兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸硕士学位论文 精品.docx

1、兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸硕士学位论文 精品学号：08109117 常 州 大 学硕 士 学 位 论 文 兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸Improved Streptococcus Zooepidemicus For Producing Hyaluronic Acid By FermentationA Dissertation Submitted toChangzhou UniversityBySun Xiao-HuiOrganic ChemistryDissertation Supervisor: Prof. Wang Li-QunMarch，2011常州大学学位论文原创性声

2、明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人已完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名： 签字日期： 年 月 日学位论文版权使用授权的说明本学位论文作者完全了解 常州大学 有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属常州大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印

3、或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在 年解密后适用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 导师签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了

4、解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名： 日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日中 文 摘 要透明质酸(hyaluronic acid, HA)是由(-1,4)-D-葡糖醛酸-(-1,3)-N-乙酰-D-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成的高分子链状聚合物。HA因其特殊的生物功能学、独特的流体力学特性和极强的持水保湿性，广泛应用于医药、化妆品、食品等领域

5、。本研究旨在筛选HA产生菌株，通过多种诱变育种的方法提高透明质酸的产量，并建立发酵液透明质酸含量的快速检测方法，对改良后菌种的培养条件进行优化，最后对菌种的透明质酸合成酶基因进行克隆和序列分析，为通过基因工程技术手段提高菌种HA产量打下基础。从160份牛鼻粘膜中成功筛选到一株野生型产透明质酸菌株。样品经梯度稀释后涂布血琼脂平板，观察菌落的形态特征和溶血特征，筛选到一株有荚膜的乙型溶血链球菌。将该菌株的发酵液多糖精提物和HA标准样的红外谱图进行对比，特征吸收峰的位置和形状基本相同，峰的相对强度相似，说明该菌株为产HA菌株。对透明质酸含量检测方法CTAB比浊法和Bitter-Muir法进行优化和比

6、较，并用于发酵液中透明质酸含量的检测，成功建立了一种更快速、更精确、更准确、更高效的透明质酸检测方法。线性回归方程为y=0.0071x-0.1018， R=0.99987。以筛选到的菌株为出发菌株，经过紫外诱变得到溶血突变型菌株UV1。以突变菌株作为出发菌株进行NTG、微波复合诱变，筛选出一株HA产量明显提高的菌株W2，产量达到1.446 g/L，并且遗传稳定性优良。对突变菌株的摇瓶发酵条件进行了初步优化，确定了最佳发酵条件为：温度35 ，初始pH值8.0，装液量50 mL / 250 mL，转速180 r/min，发酵时间20 h时，HA产量达到1.86 g/L，比初始条件下提高了29%。在

7、发酵过程中添加脯氨酸和葡萄糖酸钠可以提高HA产量，发酵10 h时添加1 g/L的脯氨酸，HA的产量提高至1.986 g/L；发酵12 h时加入12.5 g/L葡萄糖酸钠作为补充碳源，HA的产量提高至2.267 g/L。从筛选到的产透明质酸原始菌株中获得其基因组DNA，以此为模板通过PCR扩增获得透明质酸合酶基因has A序列，用限制性内切酶EcoR I和BamH I对目的基因和质粒pET-22b进行双酶切，然后将目的基因与质粒pET-22b进行连接，转入E. coli DH5，得到转化子pET-22b-hasA，对转化子插入片段进行核酸序列分析，并与基因库中has A基因序列进行比对，为进一步

8、通过基因工程手段改良菌种打下了良好的基础。关键词：透明质酸；筛选；诱变；发酵；基因工程ABSTRACTHyaluronic acid is a linear macromolecular polymer which is comprised of alternated disaccharide units of D-glucuronic acid and N-acetyl glucosamine by -1, 3 and -1, 4 glycosidic bonds. Depending on its special physiological characters, unique hydro

9、mechanical properties and excellent ability of holding water, HA is widely used in the fields of pharmacy, cosmetics and food etc. The purpose of this study was to screen HA- producing strain, to enhance the yield of HA through mutation breeding, to establish a rapid method to analyze the concentrat

10、ion of hyaluronic acid in fermentation broth, to optimize the fermentation conditions of improved strain, and to clone and analyze the hyaluronidase A gene (has A) sequence which is helpful to improve HA yeild by genetic engineering.One strain of hyaluronic acid-producing bacteria was islolated succ

11、essfully from 160 collected cattle tunica mucosa samples. Samples were coated on blood agar flat plates after gradient dilution, a strain of -hemolytic streptococcus with capsule was identified by observation of morphplogical and hemolytic properties of colonies on the plates. The infrared spectrosc

12、opy of hyaluronic acid standard and fermentation broth extract of the screened bacterium was compared, and the size, shape and relative intensity of their typical IR peaks are similar. These results demonstrated that the -hemolytic streptococcus produces HA.The Bitter-Muir method and CTAB turbidimet

13、ric method were optimized to measure the concentration of hyaluronic acid in fermentation broth. The results showed that CTAB method is superior to Bitter-Muir method in terms of accuracy, precission and efficiency. The regression equation is y = 0.0071 x - 0.1018, R = 0.99987.Using the screened bac

14、teria as original strain, a hemolysin deficient mutant named UV1 was obtained by ultraviolet irradiation. UV1 was mutated subsequently by the combination of NTG treatment and microwave irradiation. A mutant named W2 with higher production capacity of hyaluronic acid was selected from all mutants by

15、analyzing the HA concentration in fermentation broth. The yield of HA was stable after transferring five generations and reached to 1.446 g/L. Its fermentation conditions in shaking flask were optimized primarily. Under the conditions of 35, pH 8.0, 50 mL fermentation medium in 250mL flask, stiring

16、speed 180 rpm and the fermentation time 20 h, the yield of HA reached to 1.86 g/L. Compared to the original conditions, the yield was increased by 29%. The adding of proline and sodium gluconate during the fermentation process could ehance the HA yield. The HA yield could reach 1.986 g/L through the

17、 addition of 1 g/L proline by the time of 10 h fermentation, and could reach 2.267 g/L through adding 12.5 g/L sodium gluconate as a carbon source complement by the time of 12 h fermentation.The genome DNA was extracted from the original strain, and the gene has A was obtained by PCR. The restrictio

18、n enzymes BamH I and EcoR I were selected to digest the aimed gene DNA sequence and the vector pET-22b. Then the hasA gene was inserted into the vector pET-22b, and the recombinant plasmid pET-22b-hasA was transformed into E. coli DH5. The sequence of insert fragment was analized and compared with o

19、ther hasA gene sequences in gene bank. The results provided a good basis for further improving strains by genetic engineering.KEYWORDS: Hyaluronic acid; Screening; Mutagenesis; Fermentation ; Genetic engineering 目 录1 绪论 11.1 透明质酸的理化性质 11.2 透明质酸的分布及生理功能 11.2.1 透明质酸的分布 11.2.2 透明质酸生理功能 21.3 透明酸的应用 21.3

20、.1 在化妆品中的应用 21.3.2 在医学方面的应用 31.4 透明质酸生产现状 31.4.1 获得高产菌株 41.4.2 培养基及发酵条件优化 51.4.3 发酵液中透明质酸含量检测方法 51.4.4 透明质酸的提取 61.5 课题研究内容和目的 61.5.1 本课题研究内容 61.5.2 本课题主要目的 72 透明质酸产生菌的分离、筛选与初步鉴定 82.1 实验材料 82.1.1 采样 82.1.2 主要培养基及溶液组成 82.2 实验方法 92.2.1 透明质酸的分离纯化 92.2.2 菌种的筛选 102.2.3 菌种的初步鉴定 102.3 实验结果与讨论 112.3.1 菌种的筛选

21、112.3.2 菌种的分类鉴定 132.4 本章小结 133 透明质酸含量检测方法建立 143.1 实验材料 143.1.1 主要仪器 143.1.2 主要试剂 143.2 实验方法 153.2.1 透明质酸的初步纯化 153.2.2 CTAB比浊法 153.2.3 改良Bitter-Muir法 153.3 结果与讨论 153.3.1 CTAB比浊法 153.3.2 Bitter-Muir法 203.3.3 两种方法准确性比较 223.3.4 两种方法精确性比较 223.3.5 两种方法直接测定发酵液中HA含量的比较 233.4 本章小结 234 透明质酸高产菌的诱变选育 244.1 实验材料

22、 244.1.1 菌种 244.1.2 主要培养基及溶液 244.1.3 主要仪器 254.2 实验方法 254.2.1 LiCl处理 254.2.2 紫外诱变 254.2.3 NTG诱变 254.2.4 微波诱变 264.2.5 紫外+NTG诱变 264.2.6 紫外+NTG+微波诱变 264.2.7 中间培养 264.2.8 稀释涂板 264.2.9 突变菌株筛选 274.3.10 分析方法 274.3 结果与讨论 274.3.1 紫外诱变最佳时间的选择 274.3.2 NTG诱变最佳条件 284.3.3 微波诱变最佳条件选择 304.3.4 诱变结果分析 304.4 本章小结 335 透

23、明质酸发酵法生产工艺条件的初步研究 355.1 实验材料 355.1.1 菌种 355.1.2 培养基 355.2 实验方法 365.2.1 发酵条件的优化 365.2.2 添加剂对发酵的影响 375.3 结果与讨论 375.3.1 发酵条件优化结果 375.3.2 添加剂的影响 405.4 本章小结 426 透明质酸合成酶基因克隆与载体构建初步研究 436.1.1 菌株、质粒 436.1.2培养基 436.1.3 酶、化学试剂 446.1.4主要实验试剂配方 446.1.5 PCR扩增用引物 446.2 实验方法 456.2.1 提取兽疫链球菌总DNA 456.2.2 目的基因的PCR扩增

24、456.2.3 PCR扩增DNA片段的回收纯化 466.2.4感受态细胞的制备 466.2.5 质粒DNA（PET-22b）的提取与检测 476.2.6目的基因片段和质粒的双酶切 476.2.7 双酶切产物回收 476.2.8 双酶切后的目的基因和质粒连接 486.2.9 重组质粒PET-22b导入E.coli DH5感受态细胞 486.2.10 重组质粒的提取 486.3 结果与讨论 486.3.1 基因组总DNA提取结果 486.3.2 hasA片段的PCR扩增 496.3.3质粒DNA（PET-22b）的提取结果 506.3.4 hasA基因和PET-22b双酶切电泳检测 516.3.5

25、 重组质粒的表达 516.3.6 转化子的测序验证 526.4 本章小结 537 结论与展望 54参 考 文 献 56攻读硕士学位期间研究成果 60致 谢 611 绪论透明质酸（Hyaluronic acid，简称HA），是一种高分子量的直链酸性粘多糖1。1934年，美国Meyer 和Palmer2首次从牛眼玻璃体中分离提取到透明质酸，它是由(-1,4)-D-葡糖醛酸-(-1,3)-N-乙酰-D-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成的高分子链状聚合物3,4。透明质酸可以吸收并保持自身重量几千倍的水分，是保水性最好的天然物质。透明质酸主要分布在动物和人体组织的细胞外基质中，对细胞的稳定和运动、增殖、分

26、化以及组织的表现型等都有重要作用。透明质酸存在于结缔组织中，可以满足很多重要功能，如韧性、支持结构以及细胞的代谢调节。作为一种可吸收，可降解的生物材料，HA因其高度的黏弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，在医药、化妆品、食品领域中广泛应用5。我国每年透明质酸的需求量很大，但产量较低，供需缺口很大，其在国内外市场是一种紧俏产品，市场前景非常广阔。1.1 透明质酸的理化性质HA 具有许多天然粘多糖共有的性质，有强吸水性，易溶于水而不溶于有机溶剂。在氯化钠溶液中会产生氢离子（葡萄糖醛酸中的-COOH解离），从而赋予了HA酸性粘多糖的性质。透明质酸的相对分子质量约为106，分子中含有200l000

27、0个双糖。电子显微镜下观察HA呈线性单链状，在水溶液中会扩展为随机的线圈状其直径约为500 nm。由于直链轴上单糖之间氢键相互作用，HA分子在空间上呈刚性的螺旋柱型，柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性6。因螺旋空间外侧具有疏水性使这些水在螺旋柱内相对固定，不易流失。HA由于其大分子链的柔顺性而具有较强的成膜能力，可以形成一层保水薄膜。HA水溶液是一种非牛顿型流体，有独特的粘弹性和应变性7。Gibbs8等发现，低浓度的HA溶液主要体现为粘性，而高浓度溶液主要体现其弹性。1.2 透明质酸的分布及生理功能1.2.1 透明质酸的分布HA广泛存在于人和动物的各种组织间质中，如皮肤、脐带、眼玻璃体、鸡冠、关

28、节滑液等。HA也是链球菌和绿脓杆菌等菌株荚膜的主要成份。不同组织获得的HA分子量可能不同，但它们之间无种属差异并且对人及动物无抗原性。1.2.2 透明质酸生理功能HA是构成细胞外基质（ECM）和细胞间质（ICM）的主要成分9。HA分子中的羧基和其他极性基团可以与水形成氢键而结合大量水分，可吸收和保持其自身重量上千倍的水分，有“天然保湿因子”(NMF)的美称。HA是天然存在于人体皮肤中的具保水功能的聚合物，具有较高的理论保水值10。 HA的亲水作用使组织有一定的渗透压，从而维持组织的正常状态。HA作为药物载体11，具有缓释药物作用和促进药物透皮吸收功能。溶液中HA分子交联形成的网状结构能够粘附药

29、物分子，减缓药物在体内扩散速度，产生长效、延效作用。HA具有促进创面伤口的愈合12的作用，低分子量的HA可以促进血管生成，高分子量的HA可以抗炎并调节炎性细胞，进而促进伤口愈合。小分子量的HA具有抑制病菌生长、抑制病原反应的功能，产生抗菌消炎作用。而大分子量的HA由于其成膜能力可以在皮肤表面形成一层水化膜，将皮肤与细菌隔离开，阻止细菌侵入皮肤，间接产生抗菌消炎作用。HA对细胞具有多种作用13,14如保护细胞并对细胞的吞噬功能有一定影响，同时可以屏蔽细胞膜上的机械感受器，影响细胞移动、增殖和分化等。1.3 透明酸的应用透明质酸因其具有特殊的生理功能、独特的流变力学特性以及优良的保湿能力，在化妆品

30、工业、医学临床研究、食品美容保健品行业等领域有着广泛的应用。不同分子量的透明质酸有着不同的用途，中等分子量的HA主要应用于化妆品，而高分子量的HA可用于眼科粘性手术、治疗关节病、软组织修复和作为药物载体，特别是在预防和减少外科手术后组织粘连中具有很高的应用价值。1.3.1 在化妆品中的应用水是生命的源泉，是构成生物机体的重要物质，如果没有水，任何生命过程都无法进行。衰老的身体会逐渐失去水分，而人体组织保持水分最重要的物质就是透明质酸，它与蛋白质的水合作用让人体组织保持大量水分。当在皮肤表面涂上含有HA的化妆品时，HA能快速形成一层具有粘弹性的水化膜，主要作用是保持皮肤水分并润湿角质层，对促进皮

31、肤吸收护肤品中其它活性营养成分有良好的作用，从而保持皮肤年轻延缓衰老15。透明质酸的天然保湿特性，使其成为化妆品中不可缺少的重要保湿成分16。阳光中的紫外线会使皮肤变红、变黑、脱皮等，含透明质酸的护肤品可以通过促进表皮细胞的增殖和分化，清除自由基的作用，可促进受太阳灼伤部位皮肤的再生17。1.3.2 在医学方面的应用作为一种天然降解且具吸收性的生物医学材料，透明质酸在医学的各个领域用途非常广泛。透明质酸含量在很多疾病中会出现明显的升高，可以作为诊断一些疾病的指标。血清中透明质酸含量水平与肝脏疾病以及肝细胞损害程度呈密切相关18。HA广泛应用于眼科、鼻科、喉科、骨科和普外科等方面19。HA稀溶液可用于治疗干性角膜炎综合症20,21，因其具有铺展湿润能力，对眼球起润滑和保护作用。HA制剂可有效治疗鼻鼾和嗓音嘶哑22。在外科手术中HA具有术后防粘连的作用，另外，还可用于耳鼓膜修补手术。HA是关节润滑和关节软骨基质内的重要成分，可用于骨关节炎、肩周炎、类风湿关节炎的治疗23。HA作为一种药物载体，可将各种药物导向各病理部位并定位释放。并且可以添加透明质酸酶抑制剂，通过抑制透明质酸酶的活性而使HA不被分解，达到缓释控释的作用，从而维持正常的生理功能24。江德臣25等