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1、纳他霉素概述学习资料纳他霉素概述第一章 纳他霉素概述纳他霉素早在1955年被Struyk等人发现，他们从南非纳他州的土壤中分离到的纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）培养液中分离出了一种新的抗真菌物质，当时称为Pimaricin（匹马菌素）；4年后美国人Burns等从土壤中分离到了一株恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanoogensis，并从其培养物中分离到了Tennecetin（田纳西菌素）。此后的研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物质，并被世界卫生组织WHO统一命名为纳他霉素（Natamycin）。第一节 纳他霉素的性质一、纳他霉素的分子结构纳他

2、霉素为四烯大环内酯，四烯系统呈全顺式，内酯环上C9C13部位为半缩醛结构，含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨基二脱氧甘露糖（Mycosamine）。其化学结构式如图1-1所示。纳他霉素是两性物质，分子中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数pKa值分别为8.35和4.6，等电点为6.5，熔点为280。纳他霉素存在两种构型：烯醇式和酮式，这就使得其难溶于多种溶剂。 图1-1 纳他霉素的分子结构二、纳他霉素的理化性质纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌物质，呈白色或乳白色结晶粉末，含3个结晶水，几乎无臭无味。分子式为C33H47NO13，分子量为665.75。纳他霉素的紫外光谱如图1-2

3、所显示，分别在290nm、303nm、318nm处有强吸收峰，280nm处有峰肩，220nm处有宽峰。由于纳他霉素含有四烯环，因此在280320nm之间出现吸收峰，而在220nm的最大吸收是由于纳他霉素含有发色团。纳他霉素的四烯发色团给分子一种高不饱和特性，可与溴和含活性氧的化合物如高锰酸钾、高硫酸盐及过氧化物相互作用；另一方面，它以环氧族形式保持弱氧化性，纳他霉素在冰醋酸中用热的碘化物处理后会析出碘。纳他霉素酸解可以释放出海藻糖氨，内酯可以通过 图1-2 纳他霉素的紫外光谱碱水解作用皂化。纳他霉素在水中或低级醇中的溶解性随着pH的降低或升高而增加，中性时溶解度最低，而在pH低于3或高于9时溶

4、解度增大。纳他霉素在各种常见溶剂中的溶解度如表1-1所示。表1-1 纳他霉素的溶解度溶剂溶解度%水0.0050.01乙醇0.01乙醇80%+水20%0.07甲醇3.3丙二醇1.42.0甘油1.5二甲基亚砜5.0冰醋酸18.5纳他霉素干粉在避光避潮下较稳定，室温下保存几年只有很小一部分失活。其三水合物同样稳定，但其无水形式不稳定，在室温封闭的瓶子中保存48小时失去15%的活性。中性的纳他霉素水溶液几乎和干粉一样稳定。纳他霉素的稳定性受pH值、温度、光照、氧化剂和重金属等条件的影响。纳他霉素在pH4.59之间非常稳定，在极端pH值下纳他霉素迅速失活，形成不同的分解产物。低pH值时其主要的裂解产物是

5、海藻糖胺；高pH值时，如pH12，由于内酯皂化可形成纳他霉酸，用强碱处理导致进一步分解，产生一系列的后醛醇反应。pH对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响。纳他霉素在pH57的范围内，30储存三周，其活性仍保持100%，pH3.6时保持大约85%，pH9.0时大约为75%，但在大部分食品所在的pH范围内，纳他霉素十分稳定。纳他霉素的稳定性好，50放置几天或100短时处理，其活性几乎无损失。120条件下加热不超过1h仍能保持部分活性。纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。辐射也能使纳他霉素分解。纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑菌活性会明显下降。一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化

6、失活，尤其是铁、镍、铅、汞等重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中，也可以添加EDTA或聚磷酸盐来防止失活。第二节 纳他霉素的生理功能和毒理性一、纳他霉素的抑菌功能纳他霉素是一种广谱抗生素，对霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类有抑制作用（表12），但对细菌没有抑制。纳他霉素的抑菌机理一般认为是：真菌的细胞膜含有麦角固醇，而细菌细胞膜中不含这种物质，多烯大环内酯类抗生素能有选择的和固醇结合，结合的程度与膜的固醇含量成正比，结合后形成膜-多烯化合物，引起细胞膜结构的改变，导致细胞膜渗透性的改变，造成细胞内物质的泄漏。纳他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而对于休眠细胞则需要

7、较高的浓度。纳他霉素对真菌孢子也有一定的抑制效果。有人测试过纳他霉素对500种霉菌的抗性，所有菌种都被110mg/L的纳他霉素抑制。Klis比较了纳他霉素、山梨酸、放线菌酮、制霉菌素、龟裂霉素等的抑菌效果，发现纳他霉素对16种在肉汤和琼脂中培养的霉菌是最有效的抑制剂，绝大多数霉菌在0.56mg/L的纳他霉素浓度下被抑制，极个别霉菌在1025mg/L的纳他霉素浓度下被抑制，1.05.0mg/L的纳他霉素能抑制多数酵母。表1-2 纳他霉素对常见微生物的抑制作用微生物名称MIC（mg/L）梨头霉菌25.0链格孢菌10.0黑曲霉5.0灰质葡萄孢菌1.0镰刀菌10.0蜂毛霉菌5.0乳念珠菌10.0指状青

8、霉菌5.0膨大青霉菌10.0青霉菌1.0根霉菌5.0细小红色根隐球菌5.0啤酒酿酒酵母菌5.0镰刀麦角菌3.0红色凸孢子菌5.0伯克力孢子酿酒酵母5.0酒香酵母菌1.5白色念珠菌1.52.0吉利蒙氏念珠菌3.00维尼氏念珠菌1.00多形汉逊氏酵母菌1.00针峰状克勒克氏酵母菌3.00贝尔氏酿酒酵母菌1.00拜也努氏酿酒酵母菌1.00啤酒酿酒酵母菌（8021）2.50啤酒酿酒酵母椭圆形变种2.50少孢酿酒酵母2.50路德维希氏酿酒酵母菌2.50鲁氏酿酒酵母菌5.00萨克氏酿酒酵母菌5.00念珠样串酵母菌2.00凝聚孔串酵母菌3.00二、纳他霉素的毒理性纳他霉素无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸、

9、不致敏。人体口服500mg纳他霉素后，在血液中的含量少于1mg/mL，即说明纳他霉素很难被动物或人体的肠胃吸收。有研究表明，奶牛食入的高剂量的纳他霉素，约90%经粪便排出。急性和慢性毒性试验证明，纳他霉素对人体器官没有明显影响，不产生伤害。Hamilton报道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。De等人研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性，在连续几年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发现真菌形成抗性的证据，使用大于MIC(最低有效抑制浓度)的纳他霉素量，人为诱导也没有发现真菌形成抗性的证据。Ray等人报道纳他霉素能减少黄曲霉产生的黄曲毒素、赭曲霉产生的赭曲毒素、圆弧青霉产生的青霉酸、展开青霉产

10、生的展开青霉素。经卫生学调查和皮肤斑点试验，表明纳他霉素无过敏性反应。经降解处理后的纳他霉素在急性毒理、短期毒性实验中均无对动物的损害。耐药性的研究表明，未见有霉菌和酵母对纳他霉素有异常的耐药性。美国FDA建议纳他霉素作为食品添加剂使用的抗生素，还被归类为GRAS产品之列。我国于1996年由食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，现已列入食品添加剂使用标准，其商品名称为霉克（NatamaxinTM）。美国CFR编码：21CFR172.155，其中对纳他霉素的DAI值是0.3mg/kg，根据我国食品添加剂使用卫生标准（GB2760）规定，食物中最大残留量是10mg/kg，而纳他霉素在实

11、际应用中的使用量为微克级。第三节 纳他霉素发酵的国内外发展动向早在1960年已有发酵生产纳他霉素的报道。但直到20世纪九十年代，纳他霉素的生产研究才重新受到关注。期间，关于纳他霉素发酵与提取等方面都有了深入的研究。目前，国外对纳他霉素产生菌基因工程方面的研究已经起步。1999年Aparicio等人研究了纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌的生物合成基因簇，染色体组包含110Kb碱基对。他们还报道了由功能基因分隔的两个亚簇编码的聚酮合酶基因组，包含两个主要的基因pimS0和pimS1，pimS0编码一个相对较小的乙酸激活聚酮合酶（PKS）基因（大约193kDa），pimS1编码一个巨大的多酶基因（大约71

12、0kDa）。2000年Aparicio等人报道了纳塔尔链霉菌的一个含16个开放读码框（表1-3），84985bp基因簇的序列，它是继制霉菌素后报道的第二个多烯大环生物合成基因簇，它编码聚酮合酶（PKS）的13个同源酶基因，PKS被分配在五个巨大的多酶系统中（PIMS0-PIMS4）。同年，Marta等人又研究报道了纳塔尔链霉菌中的一个隐蔽质粒pSNA1的基因图谱和全部核苷酸序列，DNA分子大小9367bp，G+C的含量占71.3%，拷贝数30。pSNA1包含七个开放阅读框，分别编码不同的蛋白质。2001年，Marta等人报道了从纳塔尔链霉菌中获得的目的基因片段pimD，它编码细胞色素P450环

13、氧酶，负责将4,5-去环氧匹马霉素（4,5-de-epoxypimaricin）转变成匹马霉素。4,5-去环氧匹马霉素是一种生物活性物质，是从纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌的一个重组突变体中分离得到的。表1-3 纳他霉素生物合成基因簇ORFs及结构域ORFs多肽氨基酸结构域pimS0PIMS01847PKSloadingCol组件0KS*AtaACPpimS1PIMS16797PKS组件1KSAtaKRACP组件2KSAtaDHKRACP组件3KSAtaDHKRACP组件4KSAtaDHKRACPpimS2PIMS29507PKS组件5KSAtaDHKRACP组件6KSAtaKRACP组件7KSA

14、tbKRACP组件8KSAtaKRACP组件9KSAtaKR*ACP组件10KSAtaKRACPpimS3PIMS31808PKS组件11KSAtaDHKRACPpimS4PIMS42024PKS组件12KSAtaDHKRACP TEpimAPimA602转运ABCpimBPimB626转运ABCpimCPimC352氨基转移酶pimDPimD397细胞色素P450单氧化酶pimEPimE549胆固醇氧化酶pimFPimF63铁氧还蛋白pimGPimG398细胞色素P450单氧化酶pimHPimH432流量泵pimIPimI255硫酯酶pimJPimJ343糖脱氢酶pimKPimK458糖基转

15、移酶第二章 纳他霉素的发酵生产第一节 纳他霉素的生物合成途径多烯大环内酯抗生素的生物合成途径可以分为三个步骤：活化前体的生成（乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A）、内酯大环的生物合成（多聚乙酰途径）和氨基糖的形成。如图1-3所示。由于纳他霉素生物合成代谢调控以及前体物质在其合成中的作用方面的报道甚少，因此，已有的报道更多的是基于多烯大环内酯抗生素生物合成途径来进行代谢调控。第二节 纳他霉素发酵及菌种选育一、纳他霉素发酵微生物 图1-3 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径纳他霉素产生菌为链霉菌,链霉菌的基内菌丝通常发育良好,多分枝、无隔膜而连贯，气生菌丝茁壮，较基内菌丝粗，颜色较深,当菌丝逐步成熟时,大部分

16、气生菌丝分化成孢子丝,产生呈长链的孢子，孢子被外鞘所包，鞘表面平滑或带各种装饰物,在电子显微镜下表现为双短杆镶嵌状,有鳞片或形状和大小不同的突起、刺或毛发等；孢子的分裂方式也有差异，有的沿横膈中央平切，有的两端浑圆，由残余的鞘相连。目前，报道的纳他霉素生产菌有三种：1、恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanovgensis，ATCC 13358，其形态特征为孢子丝圈至螺旋形，有时柔曲；孢子呈球形或椭圆形，表面带细刺。2、纳塔尔链霉菌Streptomyces natalensis，ISP 5357，其形态特征为孢子丝25圈松敞螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，表面带小刺。3、褐黄孢链霉

17、菌Streptomyces gilvosporeus，ATCC 13326，其形态特征为孢子丝螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，孢子表面带刺。二、纳他霉素发酵菌种选育1、菌种筛选与诱变链霉菌可产生大多数已知的抗生素、动物生长促进剂等生物活性物质。由于链霉菌的抗生素生物合成基因趋于成簇排列，共同控制链霉菌的抗生素生物合成，因而利用基因技术很难将全部抗生素生物合成基因克隆表达出来。采用传统的育种方法，即利用各种理化因子对链霉菌进行诱发突变，可以使其抗生素产量得到提高。但由于诱变所产生的突变是随机的，并且突变频率低，只有10-310-6，在突变株中，多数为负向变异，生产需用的正变株的突变频率更低。由于基因

18、突变是不定向的，如果盲目上摇瓶进行经验式筛选，必然导致目标菌株筛选工作量大，直接影响了诱变育种的效率。因此，在诱变完成后，如何定向筛选出正向突变株则是一项更重要的工作。纳他霉素产生菌链霉菌的产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系是目前抗生素科研领域的一个热点。Ochi等人从多种链霉菌中获得rel突变株，rel突变株的共同特点是其产抗生素能力消失，并且菌体内积累鸟苷四磷酸（ppGpp）的能力明显下降。而在同种链霉菌的正常菌株中菌体形态分化和产抗生素的开始往往伴随ppGpp的激增。这表明ppGpp是次级代谢起始的优势信号因子，对抗生素生产的启动具有重要作用。1996年，Shima等人通过抗性突

19、变使原本不产放线菌紫素的S.lividans产生放线菌紫素。DNA测序显示该链霉素抗性突变株中编码核糖体蛋白S12的rpsL基因中Lys-88突变为Glu。进一步实验表明这种链霉素抗性基因突变可以使rel突变株恢复抗生素的生产，而没有伴随ppGpp的积累。这些研究证明链霉素抗性突变株能够在无需ppGpp的情况下，经过一个尚不明确的途径最终恢复次级代谢产物的生产。1997年，Hesketh等人提出了一种提高S.coelicolor生产放线菌紫素的育种新方法。该方法利用链霉素抗性突变作为筛选手段进行诱变育种，极大的提高了工作效率。2001年，Haifeng等人发现庆大霉素和利福平都可以代替链霉素作

20、为抗性筛选条件，并获得同样的实验结果。这些研究使这一方法具有了普遍性意义。2、菌种保藏与分离复壮对于生产纳他霉素的放线菌来说，可以采用定期移植保藏法或冷冻真空干燥保藏法，这两种方法操作简便，效果较好。定期移植保藏法一般使用高氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基或察氏琼脂培养基等，培养温度28左右，保藏温度46，保藏湿度在50%70%以下为宜。每三个月移植一次。如果采用冷冻真空干燥保藏法，冻干的菌株能在更长的时间内保持着生命力，并能相对减少经常移植引起的变异。只不过冻干保藏法要求操作技术比较熟练。冷冻真空干燥保藏法保藏的菌株可在室温存放，也可在低温（410）存放，但温度应保持恒定，而且要避光。冻干的

21、菌种经贮藏后，需用时可在无菌室内开启安培管进行恢复培养。其步骤如下：先用锉刀将安培上部横锉一道痕迹，用烧热的玻璃棒置痕迹处，安培壁上立即出现裂纹，当空气进入后再行打开，用无菌吸管将液体培养基如营养肉汁、麦牙汁加入安培管中，溶化干燥的样品，摇匀，再用无菌吸管吸取溶化的液体并移入适宜的培养基上，在最适温度下培养。第三节 纳他霉素发酵工艺一、发酵碳源、氮源及营养条件纳他霉素发酵所采用的原材料主要为大豆蛋白抽提物，酵母抽提物，葡萄糖，原料的质量标准为通用发酵用标准，实验表明，原材料的产地和质量对发酵有较大影响，原材料的确定除了其他化验指标外，摇瓶实验结果是极为重要的依据。有人认为用非酵母蛋白和酵母蛋白

22、的混合物作为培养基中的氮源，可提高纳他霉素的发酵效价。研究了豆油、淀粉、木糖、糊精、甘油、乳糖、蔗糖、菜籽油和葡萄糖等不同碳源对纳他霉素发酵的影响，结果表明葡萄糖是最适碳源，并且当葡萄糖浓度为36.0g/L时，纳他霉素产量最高。同时，选择大豆蛋白胨和酵母粉为复合氮源，会进一步以高纳他霉素发酵单位。优化后的培养基组成为：种子培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨6，酵母粉6，NaCl10，pH7.0。发酵培养基（g/L）：大豆蛋白分离物20，酵母粉4.5，葡萄糖（50葡萄糖单独灭菌）40，pH7.0。也有研究认为仅采用能够促进菌体快速增长的葡萄糖为唯一碳源，效果并不好，并且，随其浓度的增加会产生“

23、葡萄糖效应”。针对这种情况，可采用复合碳源，即采用可快速利用碳氮源加慢效碳氮源的方法。这样，有可能消除“葡萄糖效应”。Eisenschink等人报道了流加碳、氮源进行纳他霉素发酵的过程。指出发酵培养基中至少应有15g/L的蛋白氮源，其中碳源要不断流加，使碳源浓度保持在530g/L，纳他霉素产量可达至少5g/L。三、发酵工艺条件影响纳他霉素发酵的因素主要是温度和pH。选择了2335之间共7个温度梯度进行实验，结果表明，菌体量和纳他霉素产量在2529温度范围内随着温度的升高而增大，29时达到最大值。当温度高于29时，纳他霉素随着温度升高而减小，特别是温度高于31后，菌体量和纳他霉素的值都迅速下降。

24、将初始pH值分别调为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，发酵96h测定纳他霉素产量，结果表明，当初始pH值在7.58.0之间时，纳他霉素的产量最高。也有报道认为发酵过程中通过添加NaOH或KOH或Ca(OH)2等，控制发酵液pH值维持在5.96.1，可以提高纳他霉素发酵效率。四、种子和接种量获得菌种后首先要进行菌种的活化，从安培管中接种一环于装有50mL液体活化培养基的250mL三角瓶中，29，200r/min振荡培养48h，转接于保藏斜面，29恒温培养10天左右，待斜面完全被孢子覆盖，4保存备用。在发酵前，要先制备孢子悬浮液和进行种子培养，用适量无菌水洗下

25、琼脂斜面上长好的孢子，将孢子悬浮液置于装有玻璃珠的三角瓶中，在振荡器上充分振荡，使孢子均匀分散，孢子浓度为1051010CFU/mL；然后取一定量的孢子悬浮液接种于种子培养基中，29，通风培养30h，使菌体处于对数生长期。分别将以培养18、20、22、24、26、28、30h的种子以115的不同接种量接种于发酵培养基中，发酵96h，结果发现种龄为24h、2接种量的种子所产生的纳他霉素量最高。另外，研究表明，用孢子接种比用营养细胞接种的纳他霉素产量高40%。五、纳他霉素发酵Borden和Raghoenath两个研究小组发现，褐黄孢链霉菌经发酵罐放大培养总发酵周期为250h，因供氧及产物浓度等原因

26、，搅拌速度在不同时期有所不同，发酵初期的搅拌速度较低，到发酵后期，由于产物及代谢物的积累，产物的生成速率下降，故应适当提高搅拌速度以保持发酵罐内足够的溶解氧水平；还可采取持续地抽去发酵罐中的培养液，同时，以与之相同的速率向发酵罐中添加新培养液，这样就避免有害代谢物在发酵罐中过度积累，及时补充新鲜的营养成分。另外，在发酵后期，添加的新鲜培养液各营养成分的浓度比原来的培养液都有所增加，这也有利于产物的进一步生成。发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是关键因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源（葡萄糖）。在发酵前期葡萄糖的浓度为40

27、g/L，到发酵后期则为20g/L，此时菌体生长和纳他霉素的产量均达到最佳值。有资料表明，氮源的类型对菌体生长和纳他霉素的产量有较大影响，菌体细胞生长最好的氮源是酵母抽提物，而纳他霉素产生的最佳氮源是牛肉浸出物，所以将两种氮源混合使用则使纳他霉素的产量增加两倍。采用5L自动发酵罐进行了纳他霉素的分批发酵，确定的发酵工艺条件为初始葡萄糖浓度：40g/L；以体积比2%的接种量接种于5L罐内；空气流速6L/min，起始转速200rpm，当溶氧下降至40%以下，增加转速；29；发酵96h，纳他霉素的产量为2.75g/L。第三节 纳他霉素的提取和精制一、纳他霉素的提取纳他霉素的分离提取方法有很多。专利GB

28、846933报道了利用甲醇、丁醇和丙酮等从发酵液中提取纳他霉素的方法。美国专利NO.3378441报道了用限制性水溶性有机溶剂萃取纳他霉素。也有专利报道了盐析法提取纳他霉素，包括溶剂溶解，蒸发和纳他霉素析出。另外，专利GB2106498报道了体积浓缩法和从过滤后的发酵液中用丁醇回收纳他霉素，从中可分离纳他霉素。世界专利WO92/10580报道了在低pH条件下用甲醇溶解纳他霉素，然后除去固形物，提高pH以沉淀析出纳他霉素。这些提取过程一般要求多级纯化，操作费用比较昂贵，而且纳他霉素对酸降解非常敏感，存在提取量低的缺点。1999年美国专利5942611报道了一种有效的提取高质量纳他霉素的方法，该方

29、法的提取过程主要包括四步：（1）用错流过滤发酵液，浓缩至发酵液浓度达到1050%（W/V），浓缩过程中，可以在5070条件下加热发酵液以提高蒸发量和过滤速率。（2）调节发酵液的pH在1011，添加足够量的水溶性有机溶剂如乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等溶解发酵液中的纳他霉素。可通过加抗氧化剂如抗坏血酸、BHA、BHT等来进一步提高纳他霉素的稳定性。（3）通过错流过滤除去没有活性的发酵不溶物。（4）调节过滤液的pH在5.57.5范围内，使纳他霉素沉淀。过滤得到析出的晶体，可用于进一步纯化，干燥。通过这种方法，干燥产品纯度可达9499%（无结晶水计算），纳他霉素回收率可达4070%。二、纳他霉

30、素的精制Millis等人开发了甲醇法精制纳他霉素，其处理过程如下：将甲醇加入到含有经提取的纳他霉素粗品溶液中，使温度不超过15；调节溶液pH为1.04.5，除去溶液中析出的固体，并将pH调至6.09.0，这时纯的纳他霉素就会析出沉淀。第五节 纳他霉素的检测一、生物检测法纳他霉素效价的生物检测法主要采用管碟法。管碟法利用抗生素在琼脂培养基中的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液和未知浓度的样品在含有敏感性实验菌的琼脂表面进行扩散渗透，由于对被试菌的抑制作用而产生抑菌圈，抑菌圈的大小和抗生素的浓度之间有一定的比例。这个方法利用抗生素抑制敏感菌的特点，符合临床使用的实际情况，而且灵敏度高，接近0.5g/ml，不需特殊设备，为国际公认。二、色谱分析1. 纸色谱法表1-4 用Whatman1号滤纸通过以下几种色谱系统进行分析，色谱斑用生物自显影测定。溶剂系统Rf值正丁醇/