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1、分子生物学习题集答案剖析第一章2、问答题1.重组 DNA的含义是什么?目的基因的获得。从细菌或动植物细胞中取出染色体的DNA，用内切酶将之切成若干片段，从中鉴定出目的基因。另一种方法是从细胞中分离到信使核糖核酸核(mRNA)用反转录酶的作用获得该基因的互补DNA(cDNA)。如果预先知道某种蛋白质的氨基酸顺序，可以破译它的遗传密码，用DNA合成的方法获得基因。 运载体的选择。运载体一般为质粒，是细菌中染色体以外的DNA。但它不是正常的成分，即没有质粒也完全可以正常生长。质粒是环状的DNA，能自主复制，有若干内切酶切口和某些抗生素的抗药性基因。可以作为转基因的载体。 内切酶切割。将目的基因与质粒

2、DNA如pBR322质粒，用相同的内切酶分别进行切割，结果它们都会形成相同的切口。 连接酶连接。DNA连接酶，常用的有T4。在三磷酸腺苷(ATP)及镁离子存在的条件下，T4连接酶能将切口相同的两种DNA连接起来，形成一个插入目的基因的质粒，叫重组质粒。 宿主菌。宿主菌如大肠杆菌作为受体菌，需要培养到旺盛生长阶段，叫感受态细胞。一般在液体培养基中，37振荡培养过夜即可。 重组DNA的转化。将插入目的基因的质粒加入呈感受态的大肠杆菌中，同时加入适当的钙盐(Ca+2)，振荡培养。大肠杆菌将重组质粒吞入胞内。这个过程叫转化。 转化子的筛选。pBR322质粒的PstI酶切口处插入目的基因时，则会破坏了抗

3、氨苄青霉素的基因。将转化后的大肠杆菌单个菌落，挑取菌体分别接种于含氨苄青霉素及链霉素的培养基中。如在链霉素培养基上生长而在氨苄青霉素培养基上不能生长的菌落即为转化子。第二章二、问答题1.什么是细菌的限制修饰系统(restriction-modificaton system, R-M system)，细菌的限制修饰系统有什么意义? 即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称R-M system。限制性内切酶识别特异的DNA序列并打断DNA，同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化，使得限制性内切酶无法识别。 这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来入侵的DNA在限制性内切酶的作用下被水解，而细

4、菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护起来。2.何谓断裂基因( split gene)?何谓重叠基因( overlapping gene)?它们在生物进化与适应上有何意义? 重叠基因：不同基因共用一段相同的DNA序列。 断裂基因：真核生物结构基因，有若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因或间隔基因。 重叠基因生物学意义： 原核生物进化的经济原则(较小的C值编码较多的基因信息)； 遗传信息量的估算、突变效应的鉴定、表达调控的理论发展； 丰富和发展了基因的概念(部分回答 C不等于c)。 间隔基因的生物学意义

5、： 有利于生物遗传的相对稳定。在突变随机发生的前提下，间隔基因的内含子突变不会承受自然选择压力； 增加变异概率，有利于生物的进化。间隔基因长度的增加在某种程度上与增加了基因内的重组变换概率，这样可形成蛋白结构域的重新组合； 扩大生物体的遗传信息储量。通过改变读码框或利用内含子编码基因，或对内含子以不同方式剪接； 利用内含子进行代谢调节。例：酵母细胞色素b基因内含子编码一个成熟酶，利用成熟酶切除未成熟的mRNA中的内含子。3.什么是顺反子?用“互补”和“等位基因”说明“基因”这个概念。 4.IS元件整合到靶位点时会发生什么，IS元件整合到靶位点时会发生什么? IS元件的末端是反向重复序列，这两个

6、重复序列高度同源，由供体提供IS元件的一个拷贝到靶位点，涉及酶切、复制、重组，即通过转座酶与末端IR和受体靶位点序列DNA双链进行特定长度的交错切割，再将IS元件连接到靶位点的凸出单链上，最后由聚合酶填补空缺完成转座。当IS元件整合到靶位点后，插入位点的宿主靶DNA序列被复制，在转座子两端产生宿主靶DNA序列的正向重复，因此IS DNA两侧的IR总是与短的正向重复相连，正向重复序列的长短受控于转座子插入时对靶位点产生错切序列的长短。 5.列出一个转座子插入到一个新位点所要求的步骤。 复制型转座：发生转座的整个DNA序列是原转座因子的一个拷贝，转座伴随着新拷贝的复制。 .转座酶对供体转座子的末端

7、反向重复序列和受体靶位点序列的DNA双链进行特定长度的交错切割； .共同的机制使转座子和靶序列的切口末段发生交叉共价连接，形成单链转移复合体； .DNA聚合酶利用连接缺口处的3-OH末端和模板链填补缺口，完成转座子及正向重复序列的复制，最后将供体复制子与受体复制子分子连接成具有两个转座子的共联体，两个拷贝的转座子位于两个复制子的连接处，方向相同，正向重复； .由拆分酶催化在两个转座子拷贝之间的同源重组交换，释放出两个独立的复制子，另一个复制子则获得了被复制的转座子，并在转座子的两端形成与最初发生错切长度相同的，短的正向重复序列。 非复制型转座：转座因子作为一个整体直接从原始位点插入转座到新的靶

8、位点，而供体原来的位点上已没有转座因子了。有两种转座机制： .利用供体和受体靶DNA序列的直接连接完成转座，只需转座酶，涉及转座子从供体DNA释放和在靶位点上的插入，在供体位点会造成DNA的断裂，转座子的一条单链与靶位点的单链连接，互补链缺口经修复合成填补，完成转座后同样在转座子两侧形成靶位点序列的正向重复。 .保守转座：转座酶在转座子两端发生剪切，产生双链断裂，完整的转座子从供体中释放出来，转座子与已切断的靶位点连接，复制、修补缺口。 6.比较基因组的大小和基因组复杂性的不同： 个基因组有两个序列，一个是 A，另个是 B，各将2000bP长。其中个是由400bp的序列重复5次而成，另一个则由

9、50bp的序列重复40次而成，问： (1)这个基因组的大小怎样? (2)这个基因组的复杂性如何?7.被加工的假基因与其他假基因有哪些不同?它是如何产生的？ 功能基因累积突变型假基因：某基因发生了对其表达过程中的一个阶段或全部阶段具有阻断作用的突变，就会使该基因失去活性。这些变化包括消除起始转录的信号，阻止在外显子与内含子的连接点进行剪接或过早地终止翻译等。 加工假基因：基因组中与RNA转录物相似的失活基因。已加工过的假基因有明显的RNA加工反应的印迹，这表明它们在某种程度上经过RNA阶段。形成： DNA转录前体RNA后经剪接加工形成成熟的RNA,再反转录成cDNA，随后插入到基因中； DNA转

10、录的前体RNA经加工形成成熟的RNA，进而与DNA形成杂合双链插入到基因中，形成无启动子，无内含子，无终止子的加工型假基因，或反转座假基因。 假基因生物学意义：假基因以基因家族中的一个成员存在，在进化上具有进化的整体性，不承受选择压力；无论其序列是否有功能，基因簇每个成员都会发生重复、缺失和重排。通过对突变体的自然选择，使优良突变基因得以进化；部分回答了生物进化的C值矛盾。8.请描述 C值矛盾，并举一个例说明。 某生物单倍体基因组DNA的核苷酸数为大C值，受中心法则限定，编码结构基因DNA的核苷酸数为小c值。生物进化的C值矛盾表现为： 生物体进化程度高低与大C值不成明显相关（非线性）。例：有些

11、哺乳动物的基因组叫两栖类的多数生物还要小； 亲缘关系相近的生物大C值相差较大。例：昆虫类、两栖类和显花植物类C值相差几乎上百倍 ； 一种生物内大C值与小c值相差极大。例：Euk. 人体 c = C/10； Prok. x174 c C )。9.跳跃复制的结果是什么? 基因的重复可以通过跳跃复制产生，复制后的拷贝发生突变和突变累积，然后 形成基因簇，最后分化成执行不同功能的基因。重复序列的突变在某种意义上又进一步抑制了不对称交换，维持了进化所选留的新基因的相对稳定。10.列举一个已知的 DNA序列编码一种以上蛋白质的三种方法。 出现在重叠基因中： 在核糖体结合位点之后含有多重起始位点，或终止密码

12、的漏读（其中UGA、UAG易被漏读、错读，UAA能严格终止），例如两种蛋白质均从同一起始密码开始起译，其中一种蛋白在遇到第一个终止密码是就停止翻译，另一种蛋白由于发生漏读，核糖体继续翻译到下一个终止密码处； 以不同的读码框架对同一条mRNA进行识读和翻译； 选择不同的起始密码AUG，但按同一个读码框架对同一条mRNA进行识读和翻译； 编码在同一DNA区段不同极性单链上的重叠基因，即反向重叠基因； 真核生物内含子选择性剪接可由同一初级转录物产生多种蛋白质，即同源异型蛋白。另一个版本：在核糖体结合位点之后含有多重起始位点在一两个碱基的移码方式出现重叠的可读框不同的剪接方式，产生不同的mRNA方式

13、第三章二 问答题:1.设计实验克隆大肠杆菌的复制子。 用荧光物质特异性标记大肠杆菌的复制子，利用相同的限制性内切核酸酶分别酶解E.coli DNA复制子和具有抗生素基因（例如）质粒DNA，根据荧光标记筛选出切下的的E.coli DNA复制子片段，与质粒DNA片段连接后，转化缺乏基因的受体菌（），接种于含有氨苄青霉素的培养基中，选择能正常生长的菌落，即可克隆到E.coli 复制子的DNA片段，因为只有同时具有复制子和的基因组DNA的菌落才能既检测到荧光标记，由能在含有氨苄青霉素的培养基中正常繁殖。2.试证明一个基因中只有一条 DNA链作为模扳被转录。 分子杂交试验：分别将体外双向转录体系和体外不

14、对成体系（与体内相同方向的单向转录）中分离得到的转录物与体内转录物杂交，如果能检测到杂交双链产物，则可证明体内的目标片段是按双向转录模式进行转录的，反之，就是以不对称转录方式进行单向转录。3.描述 Matthew Meselson-Franklin Stahl试验，说明这一实验加深我们对遗传理解的重要性。 将加入到培养E.coli的培养基内，标记合成的新生DNA单链； 将E.coli转移到培养基内，经一个世代后，提取E.coli DNA Cscl密度梯度离心，测定DNA分子密度。 分析：如果为全保留复制，则出现两条不同密度DNA带纹； 如果为随机复制，则出现一条中等密度DNA； 如果为半保留复

15、制，则出现一条中等密度DNA. 实验结果将全保留复制否定；提取在培养基内复制一代后的DNA（即第二世代），密度梯度离心 分析：如果为随机复制，则占的随机分布在4条双DNA链中，出现一条低密度DNA；如果为半保留复制，则出现两条低密度DNA，两条中等密度DNA将这些DNA分子热变性，单链DNA密度梯度离心 分析：如果为随机复制，则出现一条带纹；如果为半保留复制，则出现一条高密度带纹和一条低密度带纹；让E.coli再继续复制第三代、四代，两条带纹中，低密度DNA带纹逐渐变宽，中等密度DNA始终为两条带两种放射性标记的双链DNA.4.什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么? 质粒的相容性是指

16、两种质粒是否可以共存于同一个细胞，如果能够共存则叫相容（又叫亲和），不能共存则称为不相容。从本质上说，能够共存于同一个细胞中的质粒具有不同的复制机制，因而复制时互不干涉，并保持稳定。根据质粒的这一特性将质粒分为若干个不相容群。同一个不相容群中的质粒不能共存于同一个细胞，因而他们的复制机制相同，因此凡能共存于同一个细胞中的质粒属于不同的不相容群，因而他们的复制机制不同不相容性质粒：具有共同的复制调控机制(相互竞争, 相互制约)；相容性质粒( F, ColEI )：复制调控机制完全不同(和平共处, 互不干扰)。5.解释在DNA复制过程中，后随链是怎样合成的。 双链DNA分子复制起始时RNA聚合酶从

17、复制原点处使双链DNA分子局部开链，前导链在一段RNA引物的发动下按连续合成的模式完成合成过程：在合成10-12个核苷酸的RNA片段之后，再由DNA聚合酶完成前导链DNA的合成，在完成近1000-2000个核苷酸的DNA合成后，后随链才在引发酶的作用下开始启动冈崎片段的引物RNA的合成：引发酶往往与其他相关酶类结合在一起形成引发体合成RNA引物分子，为DNA聚合酶合成DNA分子提供了启动聚合的3-OH末端，冈崎片段聚合完成后，DNA聚合酶利用其外切和聚合功能降解RNA引物分子，同时利用前一个冈崎片段DNA的3-OH聚合DNA,完成类似切口平移的过程，填补切除引物分子后的缺口，最后由DNA连接酶

18、将冈崎片段连接。6.描述滚环复制过程及其特征。 过程：单链DNA经复制成为双链复制型（RF），复制的起始是在RF型DNA分子的正链（+）上形成一个切口，当有3末端外露，5末端游离后，以另一单环负链（-）为模板开始启动新生正链的前导链合成，游离的5端按冈崎片段方式启动后随链的合成；随模板链（-）的滚动，新生正链不断在3末端延伸（共价延伸方式），当其完全游离出亲本单环负链后，自身立即作为模板链按不连续方式合成冈崎片段，经过多轮的滚动，合成出的双链DNA分子是多个基因组串联在一起的多联体，后经切割才形成单体分子。 特征：新生正链与亲本正链总是连在一起；滚环复制的DNA图形看似“”字母；前导链的启动不

19、需要引物，也不需要转录激活，直接在3OH端切口上启动复制，整个复制过程只有一个复制叉（单项复制）。7.研究表明小麦成熟胚，未成熟幼胚，幼嫩花序，叶片细胞中端粒DNA的长度分别为30 kb，80kb, 45kb, 23kb。请讨论这一研究结果的分子生物学机理。（8分） 随着组织、细胞的老化，染色体端粒DNA的长度逐渐缩短。 真核生物发育终端的体细胞中端粒酶基因表达如果受到抑制，将会导致体细胞中染色体DNA一代一代的短缩，当短缩至一个重要的信号序列处，就会引起细胞的早衰或死亡。 8.某一质粒载体具有 Tetr 和 Kanr的表型，（四环素和卡那霉素）在 Kan抗性基因内有一Bgl 的切点。现用Bg

20、l 切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插人片段的重组体? 1转化后涂皿时应加四环素。（用Bgl 切割该载体，破坏了Kan抗性基因。） 2培养后长出的菌落具有Tetr Kans和Tetr Kanr的抗性基因型。 3重新点种在含四环素和卡那霉素的平板上，然后点种在只含四环素的平板上，选择只在四环素平板上生长的菌落（能在四环素平板上生长而不能再含四环素和卡那霉素的平板上生长的菌落），即为所需的重组体（Tetr Kans）。 第四章 二、 问答题:1 概括典型原核生物启动子的结构和功能，并解释

21、什么是保守序列。 原核生物启动子：上游控制元件（UCE）+核心启动子=扩展的启动子 UCE:即-40-70区,能与CAP-cAMP复合物结合，是激活转录的正调控位点。 核心启动子： -35区：Sextama盒，是RNA聚合酶首先识别和结合的位点（R site），或松弛结合位点。保守序列TTGACA,保守序列突变影响因子结合效率；-10区：Pribnow盒，是RNA聚合酶随后滑到区域的结合位点（B site）,或紧密结合位点。保守序列TATAAT,保守序列突变影响开放复合物形成的速度，富含AT，解链发生区； +1位点：转录起始点（I site），几乎均为嘌呤（A或P）。-35区和-10区间有17

22、1bp的间隔序列，其保守性有利于RNA聚合酶的启动，保证了-35区和-10区能与因子同时作用，为RNA转录提供恒定DNA双链解链区间，17bp的间距较17bp的序列对转录更为重要，间距的突变趋近17bp时，表现为上调突变，远离17bp时，表现为下调突变。启动子序列与-35区序列为TTGACA及-10区序列为TATAAT的标准启动子序列同源性程度的大小决定了启动子的强弱。 保守序列：指DNA分子中的一个核苷酸片段或者蛋白质中的氨基酸片段，它们在进化过程中基本保持不变。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。从跨种保留的角度来看，这种序列的存在意味着在形成不同物种的进化过程中

23、，有一段特殊的基因序列被保留了下来。 2.简述原核生物RNA聚合酶全酶的组成以及各个亚基的功能。 RNA聚合酶全酶：5个亚基，、和，依靠空间结构专一性与特异性地与DNA结合。 亚基：结合核心酶启动转录后脱离核心酶，使核心酶促延伸。可重复使用； 使全酶识别Sextama Box（R位点）、Pribnow(B位点),选择并紧密与模板链发生特异性结合，保证了相对较高的转录效率； 修饰RNA聚合酶的构型：降低全酶与DNA的非专一性结合力，增强全酶与R, B site的专一性结合力，导致RNA链的延伸缓慢； 亚基：核心酶的组建因子； 促使RNApol与DNA 模板链上游转录因子结合； 位于前端的因子使双

24、链解链为单链； 位于尾端的因子使单链新聚合为双链。 亚基：促使RNA聚合酶聚合NTP，合成RNA链，使转录延伸； 完成 NMP之间的磷酸脂键的连接； 与RNA编辑有关； 与 Rho()因子竞争RNA 3-end； 构成全酶后，因子含有两个位点：起始位点（I）对利福平敏感，只专一性与ATP/GTP结合，决定了RNA的第一个核苷酸为A或G,延伸位点（E），对利福平不敏感，对NTP没有专一性，保证了RNA的延伸。 亚基：强碱性亚基； 促使RNA聚合酶与非模板链结合； 受K酶抑制。 3.原核生物与真核生物的mRNA的各有什么特点? 原核生物mRNA的特点为:1半衰期短。原核生物中，mRNA的转录和翻译

25、是在同一个细胞空间里同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发了。2许多以多顺反子的形式存在。原核细胞的mRNA(包括病毒)有时可以同时编码几个多肽。3原核生物mRNA的5端无帽子结构，3端没有或只有较短的多聚A结构,原核生物起始密码子AUG上游有一被称为Ribosome Binding Site (RBS)或SD序列（Shine Dalgarno sequence）的保守区，因为该序列与16S-rRNA 3端反向互补，所以被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用4原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子; 真核生物mRNA的特点为：1真核细胞mRNA的合成和

26、功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。mRNA以较大分子量的前体RNA出现在核内，只有成熟的、相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才能进入细胞质，参与蛋白质的合成。2以单顺反子形式存在 。3真核生物mRNA的5端存在帽子结构，除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3端具有多聚A结构，真核生物的mRNA中，由DNA转录生成的原始转录产物-前体mRNA，要经过5加“帽”和3酶切加多聚腺苷酸，再经过RNA的剪接，编码蛋白质的外显子部分就连接成为一个连续的可译框，通过核孔进入细胞质，作为蛋白质合成的模板。真核生物的mRNA还可以通过RNA编辑在初级转录物上增加、删除或取代某些核苷酸而改变遗传信。真核

27、生物几乎永远以AUG作为起始密码子。4.-地中海贫血症患者不能合成-球蛋白。将患者与正常人-球蛋白基因的DNA序列进行比较分析发现，除第一个intron中有一个碱基发生了改变外，所有序列相同，但其mRNA分子比正常人多出约100多个核苷酸。根据这一结果，说明患者缺失-球蛋白的原因。 第一个intron中有一个碱基发生了改变，使得RNA加工过程中，对内含子的识别和剪接出现错误，剪接不完全，导致成熟mRNA比正常mRNA核苷酸多，编码蛋白质时可能对密码子的识别出现错位，也可能编码的蛋白质无法形成正常-球蛋白的空间构像等，最后使患者缺失-球蛋白。5 说明研究两个已知蛋白质间相互作用关系的酵母双杂交技

28、术的分子生物学原理。 很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个

29、完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。菌株具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。6 举三例RN

30、A的研究成就并说明其在推动分子生物学发展中的重要意义。7.说明constitutive splicing与alternative splicing, cis-splicing与trans-splicing之间在概念及机制上的区别。组成型剪接：真核细胞在正常生理条件下发生的常规的RNA剪接。选择型（可变）剪接：mRNA前体的不同剪接方式。其中的某个或某些外显子被代替、添加或删除，结果一个基因可产生多种信使核糖核酸（mRNA），从而翻译得到多种蛋白质。 顺式剪接：将一个信使核糖核酸（mRNA）前体中的各个内含子切除，并将相互邻近的各个外显子加以连接，形成成熟的mRNA的过程。在这个过程中，各个外显

31、子都来自同一个mRNA分子。反式剪接：由两个分立的RNA分子各失去一部分序列而连接为成熟的剪接产物。两种独立的基因产物，不产生共线性的中间产物，通过一系列的磷酸转酯反应，直接将两个外显子剪接在一起。顺式剪接与反式剪接的区别见P1708.简述前体mRNA经过剪接形成mRNA的过程；9.核内mRNA前体是按 GUAG规则进行剪接的，还有什么机制可以从RNA初级转录物中剪接内含子?10.哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的? -35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA聚合酶起始位点)启动子序列和终止子11.什么是可变剪接？它是怎样造成： (1)在不同的组织中基因活性不同？(2)单个基因翻译产生两个不同的多肽？12.什么是增强子? 它们与其他调控序列有何不同? 增强子具有哪些特点? 增强子：可强烈促进一个或几个基因转录的DNA元件，增强子通常位于作用基因的上游，但当它们被反转或移到几百甚至几千碱基对外时，也能发挥作用。 可以从非常远的距离使它的靶基因转录活性增加达1000倍； 作用不依赖方向和位