第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体.docx

1、第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴 乃 虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1 单链噬菌体的优越性2 M13 噬菌体的生物学特性二、 M13克隆体系1 M13 克隆体系2 M13 克隆体系 -半乳糖苷酶的显色反应原理3 M13 载体系列的发展4 M13 载体系列的优点三、噬菌体展示载体1 噬菌体展示载体的构建原理2 噬菌体展示载体3 噬菌体表面展示文库4 应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1 M13 噬菌体载体克隆的若干难点2 噬菌粒3 若干常用的噬菌粒载体4 pBluescript噬

2、菌粒载体5 pUC118 和 pUC119 噬菌粒载体第八讲 单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链 DNA 噬菌体有 M13 噬菌体、 f1 噬菌体及 fd 噬菌体，它们均含有分子量约为 6400 个核苷酸的单链闭环 DNA 分子。1单链 DNA phage的优越性A 具有双链的复制型 DNA(RF DNA) ，可如质粒质粒一样进行遗传操作； RF DNA ：Replication Form DNA。B RF DNA 和 ssDNA 均可感染感受态的寄主细胞形成phaque或 colony。C 不受包装的限制。因为单链 DNA phage 的大小是受其 DNA 多寡制约的。D

3、 可容易地测出外源 DNA 的插入取向。E 可产生大量的含有外源 DNA 的单链 DNA 分子，这种单链DNA 分子有如下用途 (作为模板 )：*1 用作双脱氧链终止法进行 DNA 测序*2 制备单链的放射性标记的杂交用 DNA 探针*3 利用寡核苷酸进行定点突变2M13 phage 的生物学特性AM13 phage 同 f1 phage亲缘关系十分密切，例如： 基因组组织形式相同； 病毒颗粒大小、形状相近； DNA 同源性高达 98%以上。B在 M13 phage 颗粒中只有 (+)链 DNA ，感染具 F 性须的大肠杆菌菌株，因此 M13 噬菌体是雄性 E.coli 特有的； M13 噬菌

4、体的(+)链 DNA ，又称为感染性单链 DNA 。C复制型双链 DNA(RF DNA=Replication Form DNA)感染过程：当感染的 M13 phage 颗粒穿过性须时，其外层主要衣壳蛋白质脱落，M13 DNA 及附着其上的 Gene 蛋白进 E.coli 细胞内，感染性单链 DNA( 正链 DNA) 在细菌胞内酶的作用下转变为双链 DNA ，称复制型 DNA 。通过 结构进行几轮复制。当基因产物在亲代 RF DNA 的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即告开始。E.coli DNA 聚合酶 I 以环状的 MB 负链模板合成正链的 MB DNA(pdI 将单核苷酸不

5、断加到游离的 3-CH 上合成 (+)DNA) 。当复制叉环绕模板整整一周时， 新合成的正链由基因 II 产物切去，经环化后形成单位长度的病毒基因组。*1. 只形成 (+)DNA 的原理：当每个感染细胞中合成出 200 个(+)DNA 时，便会产生出单链结合蛋白质。这种蛋白质通过同 (+) 链 DNA 结合，从而阻断了 (-)链 DNA 的合成。*2. 单链 DNA 结合蛋白 (即 GeneV 产物 )的功能有如下两方面：阻断 GeneIImRNA 的转译；与新合成的(+)DNA 结合，阻止其再转变成RNA/DNA 。图 M13 phage 在感染的 E.coli Cell 内的复制过程，前四

6、步发生在感染后的 15-20 分钟。导致每个寄主细胞内积累 100-200 个环状 RF DNA 分子，随后持续产生单链 (+)DNA 并形成子代病毒颗粒。因此在感染的细胞内， RF DNA 的分子数目和子代 (+)DNA 的产生速率都能够保持适度。D异常的形态发生 (大的克隆能力 )与大多数其他细菌病毒不同， M13 并不是在细胞内组装成噬菌体颗粒，而是在 GeneV 蛋白 -DNA 复制物移动至细菌细胞膜的同时， GeneV 产物从正链上脱落，而病毒的基因组从感染细胞的细胞膜上溢出时被衣壳蛋白所包被。由于病毒基因组并不需要导入一个预先形成的结构之中，因此，对于可被包装的单链 DNA 的大小

7、并无严格限制。EM13 是非溶菌的，因此不会形成真正的噬菌斑，实验中所见到的 M13 噬菌斑乃是由于感染细胞生长缓慢所致， 其生长速率通常只为正常生长速率的 1/2-3/4。每个感染细胞每个世代可产生数百颗粒，因此培养基内可聚集大量的病毒颗粒，其效价可达 1012pfu/ml。二、 M13克隆体系1M13克隆体系AM13mp 载体系列是 Messing et al., 构建的。这个载体系列都是从同一个重组 M13 噬菌体 M13mp1 改造而来。M13mp1 在其主要基因的间隔区插入了一段带有 -半乳糖苷酶基因 (lacZ)的调控序列及其 N 端头 146 个氨基酸的编码信息。BM13 克隆体

8、系的寄主菌寄主菌的 F 因子含有缺陷型的 -半乳糖苷酶基因，它所编码的多肽没有活性，并缺失第 11-41 位氨基酸。这种寄主菌当其感染了没有外源 DNA 插入的 M13 时，在感染细胞中产生的 -半乳糖苷酶 N 端片段与寄主 F 因子产生的缺陷型的 -半乳糖苷酶结合后，可形成具酶活性的蛋白。*M13 噬菌体之寄主菌株应用 M13 噬菌体载体进行克隆时的寄主菌株有：JM101 ， JM105 ， JM107 ， JM109 ，JM110 ， TG1 ， TG2 ，XL1-Blue ，XS127，XS101，71/18，KK2186 ，MV1184 ，(FromSomebrook et al.,

9、1989. P.211)2M13克隆体系 - 半乳糖苷酶显色反应原理*M13 和相关寄主菌株如 JM101。由于它们单独均不能产生有功能活性的 -半乳糖苷酶，因此单独均不能显色。只有当 M13 phage载体和 JM101 一类菌株一道才能产生完全的有功能活性的 -半乳糖苷酶，因此可以显色。AX-gal 显色反应原理具功能活性的 -lac 是以四聚体形式存在的，它可将无色的底物 X-gal：(X-gal: 吡喃半乳糖苷衍生物 )5-bromo-4chloro-3-indolyl- -D-galactoside(5-溴-4-氯-3-吲哚 - -D-半乳糖苷 )切成半乳糖和深蓝色的底物 -靛蓝：5

10、-bromo-4-chloroindigo因此， X-gal 可以作为检测 -半乳糖苷酶活性的一种有效的指示剂。B顺反子内互补作用或 -互补作用推理： * 使 M13 体系显色最简单的办法是使之带上一个完整的lac 操纵子，但这样的结果会使 M13 分子过大而不便于克隆操作。*所以，应用 DNA 重组技术构建出只具 -半乳糖苷酶基因一小部分的 M13 派生载体。这个片段编码 -半乳糖苷酶的氨基末端，即 -肽链。* 通 过 顺 反 子 内 互 补 测 验 (intracistroniccomplementation test)便可检测出这种 肽链的功能活性。定义：所谓顺反子内互补作用，是指编码同

11、样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因， 联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。举例：两个 lac 操纵子突变体：一个在染色体上 Lac-一个在 F 质粒上 Lac-当两者同处一个细胞内 (部分二倍体 )，两个 lac 突变体互补了，形成 Lac+互补作用：顺反子互补也可以多肽形式出现，例如 M13 克隆体系就是一个典型的例子。Lac 缺失突变 lacZ( M13) 简称 M15合成一种缺失了 11-41氨基酸的缺陷性的 -半乳糖苷酶，又称M15 多肽。这段缺失使该酶失去了四聚化作用的能力。遗传标记 lacZ M15 ：缺失突变体，缺失 lacZ 基因中的 -半乳糖苷酶 N 端部

12、分编码序列。 M15 所表达的小肽可以参与 互补。M13 phage 的许多寄主菌所携带的 F 附加体都有这种缺失的 lacZ 基因变种。但是，在体外加入野生型的 -半乳糖苷酶的溴化氰片段(cyanogens bromide fragment)(2-92 氨基酸 )就可以使 M15 多肽的活性得以恢复，重新获得形成四聚体的能力。因此说溴化氰自然补偿了lacZ 基因的 M15 突变，这种作用叫做 -互补作用：其中 M15 蛋白质多肽叫 -受体溴化氰片段叫 -给体M13-JM101 互补作用：实验发现，用一种特定的 -半乳糖苷酶的 HindII 片段代替溴化氰片段，同样也可以发生 -互补。在 M1

13、3-JM101 克隆体系中；M13 噬菌体载体具有 lac HindII 片段，JM101 F 质粒具有 M15 突变基因。所以 M13-JM101 是可以实现 -互补作用的；可形成具功能活性的 -半乳糖苷酶。克隆基因活性的调节：M13 载体所携带的 HindII 片段上具有：lacIlac 启动子 (P)lac 操纵位点 (O)lacZ ( -肽链)4 个组成部分，简称 lacZOPI 片段。*HindII 片段 =lacZOPI 片段*由上述可见 M13-HindII 片段上不带有功能性的阻遏基因。所以在被感染的细胞中， -半乳糖苷酶的合成将是组成型的：因为当 M13 噬菌体颗粒感染了 E

14、.coli 细胞之后，很快就会累积约 200 个 RF DNA/cell；假若其上带有HindII 片段，那么普通的 lac+ 细胞的阻遏状态将会随着 HindII 片段的复制而得以消除；这是因为每个细胞中都仅存有 10 个左右的阻遏物分子的缘故。结果在感染的细胞中， lac 结构基因的转录活动便属于组成型的。*从组成型到诱导型的改造为了克服这种组成性， 已将 lac 阻遏基因的 Iq 突变引入寄主细胞。这个 I q 突变基因可以产生出十余倍超量的阻遏物，所以这种突变的存在，寄主细胞就能合成出充足的阻遏物去补偿大量的 M13 RF DNA 分子。在具有 lacIq突变基因的寄主细胞中，给 la

15、c 操纵子加入一种诱导物，典型的是 IPTG ，就可以激活 HindII 片段的复制。IPTG 分子结构式IPTG 的作用：*是一种含硫的乳糖类似物。 IPTG ：isopropylthio- -D-galactoside异丙基硫代 - -D-半乳糖苷。* 这种类似物在没有乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成 -半乳糖苷酶。所以我们称 IPTG 为 - 半乳糖苷酶的安慰诱导物(gratuitous inducer)，亦即不发生代谢变化的诱导物。* 在 X-gal 显色反应中， -半乳糖苷酶同样也需要诱导，但 X-gal不是一种诱导物，所以得在琼脂平板上加入 IPTG 。JM101 寄主菌株 (及其

16、它类似菌株 )：在 M13 克隆体系中常用 JM101 菌株作寄主，该菌株染色体上的 lacZ 基因已经缺失了，但在它携带的 F 质粒上有一个M15 基因和 lacIq 突变，这有两个方面的作用：* 第一，可以产生出超量的 lac 阻遏物，这就使得 lac 操纵子的表达置于培养基中渗入的 IPTG 的调控之下。* 第二，当 M13 载体感染之后，通过功能活性的 -半乳糖苷酶。在补加-互补作用，便会形成有X-gal 及 IPTG 的培养基中，就会出现蓝色的菌落。3M13载体系列的发展M13 噬菌体要发展成克隆载体。着选必须鉴定出可用来克隆外源 DNA 的非必要区段，然而它似乎不存在这种区段。*特

17、殊区段的发现 M13 唯一的基因间区段的发现。该区段位于 Gene2 和 Gene4之间，长 507 核苷酸， (5498-6005)该区段上存在着 M13 DNA 复制起点，但就噬菌体的发育功能而言，并不要求保持该区段的完整性。*M13 mp1 载体的获得在 M13 唯一的基因间区段内有一个 BsuI 位点，将乳糖操纵子的 HindII 片段克隆在该位点上，获得了 M13mp1 载体。 M13 载体系列命名为 MBmpn 。其中 n 为整数，如 M13mp8，M13mp9 等。*M13mp2 载体的获得 EcoRI 位点的引入M13mp1 载体的获得在 M13 载体发展工作中占有十分重要的地

18、位，随后出现的一系列 M13 载体都是在它的基础上经改建派生出来。该载体缺点是克隆位点少，只有 AvaII 、BglII 和 PvuI 三个单克隆位点。因此改建的重点是增加克隆位点。在 M13mp1 的 -半乳糖苷酶 -肽链的第五个氨基酸密码子及其附近有一段 GGATTC 序列。经突变获得 GAATTC ，即 EcoRI 识别序列。 (GA 碱基转换过程。见 P.185-186)*M13mp7 载体的获得衔接物多克隆位点的引入把化学合成的衔接物加入到 M13mp2 克隆载体的 EcoRI 位点上，产生出了适用于多种核酸内切限制酶的单克隆位点的新的 M13 系列克隆载体，即 M13mp7。但这段

19、寡核苷酸短片段 (即衔接物 ) 的加入，总共为 -半乳糖苷酶基因增加了 14 个额外密码子，然而这并不影响此多肽进行互补作用的功能。*限制位点非对称排列的多聚衔接物的引入M13mp7 载体带有一段由非对称排列的多种限制位点组成的多聚衔接物区域：图这种结构的一个明显缺点是当用两种限制酶 (例如 EcoRI-SalI) 切割时，将会产生出一种具有由远端限制酶 (EcoRI) 所形成的相同限制末端的载体。这样的载体是不能克隆由同一对限制酶所产生的具不同限制末端的外源 DNA 片段。根据这一问题 Norrander et al.引入一段限制位点非对称排列的多聚衔接物至 M13 克隆载体上，其优点是：a

20、.可用来克隆不同限制末端的外源片段；b.克隆片段的插入方向也是固定的；M13mp8 与 M13mp9 以及 M13mp18 和 M13mp19 这两对载体上，有一段结构相同但取向相反的多聚衔接物区。这意味着应用这种成对 M13mp 载体，任何可克隆其上的外源 DNA 片段，均可按两种相对的取向插入。这对于 DNA 测序十分有用，可以从双链测定得到相互印证的资料。可用来制备与外源 DNA 的任意一条链互补的 DNA 探针；4M13载体系列的优点a. 可以十分方便地分离任何特定的单链 DNA 序列，克隆在M13RF DNA 分子上的外源 DNA 片段，到了子代噬菌体便形成单链形式，故可制备单链 D

21、NA 。b.重组子化学检测M13 载体上有一条饰变的 -半乳糖苷酶基因片段，可以与相应寄主产生 -互补作用，形成有活性的 -半乳糖苷酶，故可用 X-gal 及 IPTG 进行组织化学检测筛选重组体分子。 c. lacZ 基因上具有一段多克隆序列因此便于外源 DNA 片段的插入与克隆d.定向克隆在 M13mp 克隆载体上的多克隆位点的顺序是已知的，因此经两种不同限制酶消化的 DNA 的插入方向，便可据判断出来。三、噬菌体展示载体1噬菌体展法载体的构建原理*1 丝将噬菌体，诸如 M13、fd 和 f1，它们的分子量为 6408 核苷酸，共编码 10 种蛋白质。其中与噬菌体展示有关的基因有如下两种：

22、a.Gene (g8)：该基因编码主要外壳蛋白质cp(major coat protein)，其 C 端与 DNA结合，其 N 端游离于噬菌体之外，拷贝数约为 2700；b. Gene (g3)：该基因编码次要外壳蛋白质 cp(minor coat protein)，其 C 端固定在外壳上， N 端暴露在病毒颗粒的表面上，拷贝数约为 3-5 个；*2 当外源基因插入到噬菌体基因组之基因或基因的 3 端时，外源蛋白质或多肽，便会以融合蛋白质的形式表达，融合在外壳蛋白 N 端的外源多肽 (或蛋白质 )便被展示在噬菌体颗粒的表面上。根据这种事实， 1985 年 G. P. Smith建立了一种专门在

23、丝状噬菌体表面表达蛋白质或多肽的所谓噬菌体表面展示技术 (phage display)，称为噬菌体展示技术。2噬菌体展示载体 (phage display vectors)*1 定义：根据在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多肽的噬菌体表面展示技术，发展出来的一类具有特殊用途的噬菌体载体叫做噬菌体展示载体。当外源基因插入在该载体的Gene或 Gene编码序列中，并在两者保持正确读码结构的情况下，就会产生出融合蛋白质。简言之，根据噬菌体展示原理，在丝状噬菌体的基础上建立起来一类具有特殊用途的、可在其表面表达克隆的外源基因之编码蛋白质的噬菌体载体叫做噬菌体展示载体。*2Gene和 Gene的比较大多数研究

24、工作者都是用 Gene作为展示外源蛋白质的噬菌体表达载体基因。 它可融合较大分子量的外基因， 但其拷贝数只有 3-5，远远低于 Gene，更适合于展示配体受体向亲和力低的蛋白质或多肽。而 Gene则用来筛选高亲和力的配体。*3 丝状噬菌体是理想的噬菌体表面展示载体这类噬菌体具有分子量小，易于操作等特点，是目前得到应用的理想噬菌体展示载体。 T4 噬菌体和 噬菌体的展示系统到目前还没得到成功应用，有待改进。3噬菌体表面展示文库噬菌体表面展示技术，在许多基础研究和应用研究中都有广泛的用途噬菌体表面展示文库就是一个突出的例子。a.体外重组 将随机的多肽 DNA 弹夹 (random peptide

25、DNAcassette)克隆在噬菌体展示载体的 Gene编码序列中。b.感染 将以上重组的噬菌体展示载体感染雄性的大肠杆菌细胞c.随机多肽库 感染的结果，在寄主细胞中重组的噬菌体展示载体颗粒的表面，展现出各种不同的蛋白质和多肽。此即是通常所说的随机多肽库。d.亲和层析 通过亲和层析处理，将所要分离的某种特定的目标噬菌体 (例如展示具有抗体结合特性的多肽的噬菌体颗粒 )分离出来。4应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例 hGH 变体的分离应用噬菌体展示载体和展示文库技术，已经分离到大量的随机多肽，以及人生长激素变体 (hGH variants) 。下面简述应用噬菌体展示载体及展示文库技术分离人生

26、长激素变体的简单过程：hGH 变体 =人生长激素变体a.cDNA 文库构建：构建随机突变的 hGH cDNA 文库b.噬菌体文库构建：将此 hGH cDNA 文库同一种以 M13 为基础的噬菌体展示载体连接：于是 hGH 便与 M13Gene 蛋白质的氨基末端结构域融合；基因蛋白质的羧基末端同噬菌体颗粒结合，而带有 hGH 变体的氨基末端则被展示在噬菌体的外表面上；c.转化：把噬菌体文库导入大肠杆菌细胞， 并涂布在含氨苄青霉素的培养基平板上，d.菌落筛选：抗性菌落的筛选e.噬菌体颗粒诱导：用辅助噬菌体感染这些抗性菌落的大肠杆菌细胞，以诱导产生噬菌体颗粒，其中有 1%-10% 的噬菌体颗粒含有h

27、GH-Gene融合蛋白质。而且每个噬菌体表面都只展示一个这样的蛋白质分子。f.hGH 受体层析柱的制备： 用同 hGH 受体共价结合的塑料小珠装填层析柱。g.过 hGH 受体层析柱：结果：在 hGH- 噬菌体过柱时，只有展示 hGH 的被结合在柱中，而没有展示 hGH的则过柱流出。h.分离 hGH 变体：洗脱同 hGH 受体结合的 hGH- 噬菌体再感染 -再过柱 -再感染 -再过柱，最终得到 hGH 受体。四、噬菌粒 (phagemid) 载体1M13噬菌体载体克隆的若干疑难问题a.遗传稳定性下隆克隆在 M13 噬菌体载体间隔区的外源 DNA 有不稳定的趋向。克隆的外源 DNA 片段越大，这种缺失突变率越高。带有大片段外源 DNA 的重组噬菌体，其生长速度总是要比具小片段插入的缓慢得多。因此当外源 DNA 插入片段发生部分缺失之后，在强大的选择压力作用下，结果经过连续传代之后， 在细菌群体中， 含有原来重组噬菌体的细胞比例便被相对地稀释掉了。b.外源 DNA 总是以单向插入在实验中经常看到，尽管外源 DNA 片段可以双向 (正、反 )插入到 M13 克隆载体上，但在实际中观察到特定的外源 DNA 片段总是更容易地以其中的一个方向插入到 M13 克隆载体上。其原因是：外源 DNA 另一条链上的序列会不同程度地干扰 M13 克隆载体基因间隔区的功能。c.克隆能力有限一般说