生物安全柜性能测试项目与方法.docx

1、生物安全柜性能测试项目与方法生物安全柜性能测试项目与方法（依据生物安全柜应用指南原理、使用和验证李劲松主编，化学工业出版社）A.1 柜体泄漏检测试验压力衰减及皂泡/示踪气体检测试验A.1.1 压力衰减及皂泡试验A.1.1.1 目的该测试应在所有压力排风系统的外表面进行，目的是检测焊缝、密封垫、压力排风系统检漏口以及级柜手套接口是否存在泄漏。A.1.1.2 仪器压力计、压.力表或压力传感系统，测量范围为0500Pa、精确度为5 Pa。渗漏检测试剂（25g/L肥皂液，或其他稀释10倍的中性洗涤剂)。塑料布(0.5mm耐冲击性聚苯乙烯膜)。管道密封胶带。A.1.1.3 （压力衰减测试）方法将安全柜密

2、封（对于I级、级安全柜即密闭正面的观察窗和排风口）。为方便测试，必要时应除去装饰嵌板及其他通道障碍部件以暴露压力排风系统。将压力计、压力表或压力传感系统连接到测试区域以指示内部压力见图A-1(a)将安全柜充气加压至500Pa，停止充气，并在30min后测量压力。允许的泄漏量为原压力的10%。如果安全柜的压力达到此标准，则使用皂泡法来确定泄漏位置。A.1.1.4 （皂泡测试）方法将安全柜密封（对于1级、级安全柜即密闭正面的观察窗和排风口）。为方便测试，必要时应除去装饰嵌板及其他通道障碍部件以暴露压力排风系统。将压力计、压力表或压力传感系统连接到测试区域以指示内部压力见图A-1(a)。图A-1 生

3、物安全柜柜体泄漏试验安全柜充气加压至。沿着安全柜压力排风系统外表面上所有的焊缝、密封垫、检漏口和级柜手套接口喷洒或擦拭液态渗透检测试剂（25g/L肥皂液，或其他稀释10倍的中性洗涤剂）。小的泄漏点将会形成气泡显示出来。而较大的泄漏点则在洞口处还没有形成气泡时，就把探测液体吹走，而且可以感觉到气体轻微的流动或听到声音。A.1.1.5 合格标准安全柜应能保持在500Pa50Pa的气压下30min，或者当压力维持在500Pa50Pa时，安全柜压力排风系统外表面上所有的焊缝、密封垫、检漏口和密封处没有皂泡产生。A.1.2 氦气泄漏测试A.1.2.1 目的该测试在可能受生物污染的压力排风系统中进行，目的

4、是检测焊接、密封垫或密封剂密封的连接处是否存在泄漏，这些泄漏可能使具有潜在危害的物质释放进入大气。A.1.2.2 仪器氦气泄漏检测器：用前应按照使用说明进行标定。A.1.2.3 方法进行测试的房间内事先应彻底排空测试气体，并且尽可能减少空气流动。测试区应禁烟。将安全柜密封(对于级、级安全柜即密闭正面的观察窗和排风口)。安全柜充气加压至500Pa。如果30min后，安全柜压力变化不超过10%，则减压至正常。如果安全柜不能保持这一压力，则使用渗漏检测试剂检查泄漏处（见A.1.1），修复后再次进行测试。氦气泄漏检测：向安全柜内充入纯氦气，直至排风口氦气浓度达15%，然后将安全柜加压至500Pa。或者

5、使用膨胀气囊在安全柜内部排出15%的空气，在气囊向安全柜外排气的同时将氦气注入安全柜，然后加压至500Pa。打开安全柜的送风机使气体循环30s。按照使用说明调整氦气泄漏检测器的灵敏度至110-5ml/s。沿缝隙、级柜手套接口、检漏口、面板密封垫以及其他可能的泄漏处移动探头。注意不使仪器震动。在探测表面以约2.5cm/s的速度移动探头，探头与表面的距离保持在6.3 13mm之间见图A-1(b)。A.1.2.4 合格标准(氦气泄漏测试)当以15%以土的氦气浓度加压至500Pa时，安全柜任意位置的泄漏率不得超过1x10-5ml/s。注意：检测的灵敏度，保持正压在整个柜体为103ml/s，肥皂水法每一

6、处为10-2ml/s，卤素漏泄试验整个柜体为10-5ml/s。保持正压操作的关键是前面开口的密闭。只要密闭完全，操作很简单。但出现漏时，确定漏泄点比较困难。肥皂水法在密闭操作不完美时也可进行，但需要柜内能持续保持一定压力。大的泄漏点因不易形成肥皂泡反而会被疏忽，要充分注意这一点。A.1.3 六氟化硫（SF6）泄漏测试A.1.3.1 目的该测试在可能受生物污染的压力排风系统中进行，目的是检测焊接、密封垫或密封剂密封的连接处是否存在泄漏，这些泄漏可能使具有潜在危害的物质释放进入大气。A.1.3.2 仪器工业型SF6泄漏检测器(或灵敏度110-7ml/s的卤化物检测仪)，使用前需按照使用说明校准。A

7、.1.3.3 方法进行测试的房间内事先应彻底排空测试气体，并.且尽可能减少空气流动。测试区应禁烟。将安全柜密封（即密闭正面的观察窗和排风口）。安全柜充气加压至500Pa。如果30min后，安全柜压力变化不超过10%，则减压至正常。如果安全柜不能保持这一压力，则使用渗漏检测试剂检查泄漏处(见A.1.1，修复后再次进行测试。向安全柜内充入SF6气体，加压至500Pa。打开安全柜的送风机使气体循环30s。按照使用说明调整SF6泄漏检测器的灵敏度至510-7ml/s。沿缝隙、连接处、检漏口、面板密封垫以及其他可能的泄漏处移动探头。注意不使仪器震动。在探测表面以约2.5cm/s的速度移动探头，探头与表面

8、的距离保持在6.313mm之间见图A-1(b)。A.1.3.4 合格标准（SF6泄漏检测）安全柜任意位点的泄漏速率不得超过510-7ml/s。A.2 高效空气粒子（HEPA）过滤器泄漏检测A.2.1 目的检测下排送风HEPA过滤器和排风HEPA过滤器本身、过滤器外壳以及过滤器固定框架的完整性。检测时安全柜以额定风速0.025m/s运行。A.2.2 仪器A.2.2.1 线性或对数刻度显示的气溶胶光度计。对于滤器上游平均粒径0.3 m，浓度为10g/L的多分散性邻苯二甲酸二辛酚（DOP）气溶胶颗粒，能够100%显示。灵敏度为110-3g/L，采样流量510-4m3/s10%以上，喷雾口面积在11c

9、m2以下。光度计使用前应按照说明进行标定。A.2.2.2 气溶胶发生器。气喷式，产生粒子的平均粒径0.3m。A.2.2.3 压力表。量程0550kPa，分辨率7kPa，使用前按照说明进行校准。A.2.3 检刚方法及合格标准A.2.3.1 适于扫描操作的过滤器如果安全柜装有过滤扩散器和保护外罩，监测前应移除。打开安全柜的风机和照明，按照使用说明安放气溶胶发生器，井将气溶胶通过有螺纹插塞的贯穿物向被测生物安全柜的远离过滤器的静压箱内引入。气溶胶的引入点应按照适于与柜内气流均匀混合的原则确定。可在气溶胶发生器的出口安装一个T形接头，以使检测气溶胶分布到单一风机的多个入口之内或多个风机的入口之内。按照

10、使用说明启动并调整气溶胶光度计。在上游临近过滤器处测量气溶胶浓度，测点最少为3点，分别为中心1点，距两边50mm处各一点，样品浓度应大于10g/L。线性刻度光度计（刻度0100）需调整满读数至100。对于对数刻度光度计，将过滤器上游侧浓度调整至一个分刻度所代表浓度的10000倍（采用仪器校准曲线）。在HEPA过滤器的整个下游面以及每个过滤器接缝的四周用光度计作扫描检漏。过滤器的四周边缘必须单独扫过，过滤器滤材与边框之间要沿着接缝扫描，过滤器与安全柜之间要围绕密封部位扫描。探头与检测面距离保持在2.5cmn以内，扫描速度小于5cm/s，线路应重叠。任何点上气溶胶的持续渗透不得超过上游浓度的0.0

11、1%。A.2.3.2 不适于扫描操作的过滤器如果安全柜的管道连接不适于对排风过滤器进行扫描操作，就在过滤器下游的通风管的某一位置钻一个直径大约为1cm（0.3in）的孔，开孔的位置要宜于气溶胶与柜内空气均匀混合，然后用刚性伸缩管将光度计的采样探头插入小孔中来进行泄漏试验。气溶胶的持续渗透不得超过上游浓度的0.005%。注意：排风高效空气粒子过滤器也可用下述方法检漏。只开排风机，不开送风机，使生物安全柜吸入普通环境空气，含尘浓度不低于100000粒/L（0.5m）。用粒子计数器的采样口在排风高效过滤器出风面和边框缝隙处之上20处，做扫描检漏，扫描移动速度520mm/s，路线应重叠。合格标准为级、

12、级和级柜第一级排风滤器3粒/L，级柜第二级排风滤器1粒/L。除级柜外其他型号的安全柜送风滤器均应达到3粒/L。检测管的直径和流量对检测灵敏度影响很大。扫描试验的最佳条件是等速吸风。流量一般设定为510-4m3/s，检测口的直径最好是25mm。DOP具有微弱致癌性。它的替代品，例如聚一烯烃（polyalpha olefin, PAO），二（2乙基己基）癸二酸酯di(2-ethylhexyl)sebacate、聚乙二醇以及药用级轻质矿物油，虽然气溶胶数据齐全，但尚不能保证安全可靠，因此目前仍采用DOP。A.3 噪声水平测试A.3.1 目的测量安全柜的机械噪声水平，有助于设法减少操作人员的疲劳。检测

13、可在普通房间里进行。A.3.2 仪器声测仪，精度为1dB，分辨率为1dB，最小范围为50100dB，应按使用说明将加权值设为“A”。A.3.3 方法A.3.3.1 打开安全柜的照明灯，使安全柜在额定风速0.025m/s（5ft/min）运行。A.3.3.2 将仪器加权值设定为“A”。A.3.3.3 在安全柜前窗中心水平向外30cm，工作台面向上38cm位置测量噪声水平（参见图A-2）。A.3.3.4 测量环境的噪声水平时，关闭安全柜的送风机和照明灯，远程排风机应继续运行，并按A.3.3.3项进行测量。A.3.4 合格标准在环境噪声不超过57dB(A)级的情况下，安全柜前方的总噪声水平不应超过7

14、OdB(A)。当周围环境噪声超过57dB(A)时，按附录A中A.3.3.3R测得的读数应当根据声测仪操作手册中所提供的曲线或表格进行修正。如果操作手册没有提供修正资料，则使用标准的校正曲线或校正表（见表A-1）表A-1 噪声读数修正表噪声测量值与背景噪声间的差值/dB(A)从测量值中减去的数值噪声测量值与背景噪声间的差值/dB(A)从测量值中减去的数值02扣除背景噪声值610133100452A.4 照明强度测试A.4.1 目的测定安全柜工作台面的照明强度，单位为h，帮助减少安全柜操作人员的疲劳。A.4.2仪器精确度为10%的便携式光度计。使用前应按照说明进行标定。A.4.3 方法A.4.3.

15、1 关闭安全柜的照明灯，沿着工作台中央纵轴测量背景光强度，起始测量点离一侧15cm，然后以大约30cm的相等间距逐点测定(见图A-3)。A.4.3.2 打开照明灯和送风机，再在相同点读取数据。图A-3 光强度测试A.4.4 合格标准背景光平均强度不大于160lx情况下，平均照明强度应不低于480lx。A.5 振动测试A.5.1 目的测定安全柜运行时的机械振动量，有助于设法减少操作人员的疲劳，防止损坏组织培养物等脆弱的试验材料。A.5.2 仪器振幅达到微米量级的振动分析仪。A.5.3 方法A.5.3.1 打开安全柜的照明灯，并使安全柜在额定风速0.025m/s内运行。A.5.3.2 测定垂直轴的

16、震动位移时，可使用适当工具将震动测试仪的传感器元件固定在工作台面的几何中心点。测试位置见图A-4。图A-4振动测试A.5.3.3 测定安全柜运行时的总振幅。A.5.3.4 关闭安全柜的送风机，仅运行排风机，测定背景振幅。A.5.3.5 安全柜总振幅减去背景振幅即得到安全柜净振幅。A.5.4合格标准安全柜正常运行条件下，工作台面中央振动频率在1010000Hz时，净振幅应50m均方根振幅。A.6 温升测试A.6.1 目的测定安全柜运行一段时间后柜内温度上升幅度。应在环境温度1928的房间内进行试验。A.6.2仪器2个温度汁：精密度为0.1。A.6.3 方法将一个温度计安装在操作台面中心上方30c

17、m的位置上，测量安全柜内的温度。同时用另一个温度计测量房间内的温度。启动送风机、点亮照明灯，使安全柜在额定风速0.025m/s内运行。记录4h以后的两个温差。A.6.4 合格标准生物安全柜正常运行4h后，柜内与环境的温度差应小于8。A.7人员、样品和交叉污染保护测试验证(微生物学)A.7.1 目的以生物学方法测试生物安全柜对人员、产品、交叉污染保护性能，接受下述检测的生物安全柜送风机、排风机均应以额定转速运行，并在整个测试期间持续稳定运行。级生物安全柜不提供产品保护，工作面气流为乱流，只进行人员保护试验一项检测；级生物安全柜需进行人员、样品、交叉污染保护三项检测；级安全柜前部封闭，工作面气流为

18、乱流，不需要进行人员、样品保护和交叉污染保护试验。A.7.2材料和仪器、设备A.7.2.1 黏质沙雷菌（Serratia marcescens ATCC.8039)菌悬液的配置第1步 高浓度的磷酸盐缓冲液（PDB）34g磷酸二氢钾（KH2P04）溶于500ml蒸馏水中；在25（77F）下用1mo/L NaOH调溶液pH值至7.20.5；用蒸馏水稀释至1L。第2步 最终的PBS稀释液蒸馏水1L（1L蒸馏水在25调pH值至7.00.1，在120高压灭菌15min）；第1步的高浓度PBS溶液1.25ml；最终pH至7.20.5；120（250F）高压灭菌15min。第3步黏质沙雷菌（Serratia

19、 marcescens）菌悬液的制备在无菌条件下将黏质沙雷菌菌种划线接种到普通琼脂培养基平皿（100mm15mm）上。（350.5）培养（242）h。在无菌条件下从特征性菌落表面上挑取一接种环细菌转移到装有5ml肉汤液体培养基的试管中。(370.5)摇床(160r/min)培养(482)h。4保存。使用前用平皿稀释计数法确定菌液浓度。用第2步配置的PBS稀释液稀释黏质沙雷菌菌液，使其平均浓度为1.010-8/mI。用PBS稀释液稀释后黏质沙雷菌菌悬液即可应用。注：黏质沙雷菌菌落为玫瑰红色，微凸，光滑湿润，边缘整齐。A.7.2.2 指示微生物也可以选用耻垢分枝杆菌(M.Smegmatis ATC

20、C.19420)噬菌体悬液的制备和使用方法。第1步 宿主菌菌液的制备将在改良L-J培养基上生长1周的耻垢分枝杆菌接种于7H9（另加10OADC+1mmol/L CaCl2）液体培养基，37 150r/min振荡培养48h，菌液麦氏比浊法应为5mg/mL，4保存备用。第2步分枝杆菌噬菌体的增殖采用半固体双层琼脂平皿法。下层用含1.5琼脂的7H9（50时加10小牛血清+1mmol/L CaCl2）7ml铺皿；上层培养基4mL（琼脂含量0.7%），在50时加入耻垢分枝杆菌和噬菌体混合悬液0.4ml（1：1混合），铺皿，37培养48h，加入9ml SM液37孵1l小时，吸取液体，用0.2m滤膜过滤，所

21、得扩增液效价检查应为1.01081.0109pfu/ml，4保存（如效价不足，可重复增殖数次）。第3步指示平板的制备和使用双层平皿法。下层铺皿方式同第2步，放入采样器中进行噬菌体采样后取出，在无菌条件下倒入48混有1ml宿主菌的上层琼脂4ml。放在台面上摇匀。使上层培养基铺满乎板。待凝固后，37培养24h，计数噬菌斑。A.7.2.3 气溶胶发生和采样仪器、设备空气压缩机、气体过滤装置、压力表、流量计、连接软管、支架等。气溶胶发生器1个，性能见附录B。含营养琼脂或其他适用的生长介质，无抑制剂或其他添加剂的平皿（100mm15mm或150mm22mm）。6个分别装有20ml无菌PBS稀释液的AGI

22、-30型冲击式空气采样器（流量校准到12.312.6L/min)。2个额定流量为(28.30.2)Lmin的安德森2级空气微生物采样器。一个外径63mm、末端密闭的不锈钢、铝质或有机玻璃圆筒模拟操作者手臂干扰气流。长度由安全柜内部的空间大小决定。管子的一端顶在工作区域的后壁，另一端经由安全柜操作口凸入实验室至少15cm。计时器1个。操作人员个人防护用具，防护服、口罩、防护镜等。A.7.3 人员保护测试用1.01088.0108的黏质沙雷菌攻击5min。(级生物安全柜不需作此项测试)A.7.3.1 方法开启安全柜待其风机达到额定风速。用软管连接空气压缩机、气体过滤装置、压力计、流量计、气溶胶发生

23、器。将装备的黏质沙雷菌悬液放入冰浴槽中，连接到气溶胶发生器上。气溶胶发生器放置于安全柜左右内壁中央，喷口位于工作台面上方35cm处，喷射轴平行于工作面。喷口距观察窗100mm，朝向观察窗(见图A-5)。图A-5人员安全性试验正面视图将一个模拟手臂的金属圆筒置于安全柜中央，圆筒的中心轴位于工作台面上方70mm。圆筒的一端紧靠安全柜的后壁，另端应伸出安全柜外150mm以上。围绕圆筒放置4个撞击采样器，采样口均位于安全柜观察窗向外63cm处。其中两个采样器的采样口轴线相隔15cm，位于圆筒顶缘水平切面。另外两个采样器的采样口轴线相隔5.0cm，位于圆筒底部下方3cm的水平面。一个有支撑架的琼脂培养皿

24、放在圆筒中心轴下方，前进风格栅上方或下方10mm处，使其对进入气流干扰最小，作为阳性对照。(见图A-6图A-8。)图A-6人员安全性试验侧面视图放置2个裂隙式空气采样器，采样口水平面与工作台面持平，垂直轴在安全柜前15cm、同侧壁20cm处。另放置两个撞击式采样器，采样口位于工作台面上方36cm，安全柜观察窗外侧5.0cm、安全柜中线两边各15cm处（见图A-8）。测试时间为30min，测试顺序为：重复进行3次测试。时间/min操作时间/min操作0启动安德森2级空气微生物采样器11关闭AGI-30型冲击式空气采样器5启动喷雾器11.5关闭喷雾器6启动AGI-30型冲击式空气采样器30关闭安德

25、森2级空气微生物采样器用直径47.0mm、孔径0.22m微孔滤膜过滤撞击式采样器中的所有采样液，无菌条件下将滤膜转移有普通琼脂平皿中。含有滤膜的平皿和取自裂隙式空气采样器的平皿在37.0培养，2428h观察结果。生物安全柜进行型式检验时应当在下述条件下重复上面检测步骤。吸入口风速偏离标准风速（-0.050.015）m/s，下送风风速偏离标准风速(+0.050.015)m/s；吸入口风速偏离标准风速(-0.050.01)m/s，下送风风速偏离标准风速(-0.050.01)m/s。试验结束后对安全柜内表面进行擦拭消毒。A.7.4 样品保护测试方法（级和级生物安全柜不需作此项测试。）开启安全柜待其风

26、机达到额定风速，安全柜前开口开启至生产商设定的最大高度。在工作台面上满布100mm15mm琼脂平皿，然后依次打开培养皿盖子。用软管连接空气压缩机、滤油装置、压力计、流量计、气溶胶发生器。将黏质沙雷菌悬液用PBS稀释液稀释100倍后，冰浴放置，连接到气溶胶发生器上。气溶胶发生器放置于安全柜的水平中心，其水平喷射轴应与前操作开口的上边缘平齐，且平行于工作面。气溶胶发生器的喷嘴应置于观察窗外侧100mm处，并朝向观察窗。将一个两端密封、外径为6.3cm的模拟手臂金属圆筒置于安全柜中央。中心轴位于工作台面向上70mm处。圆筒的一端紧靠安全柜的后壁，另一端应伸出安全柜外至少150mm(见图A-9图A-1

27、1)。图A-9受试样品保护试验培养皿摆放位置平面图作为阳性对照，将一个有支撑架的琼脂培养皿放在安全柜内圆筒中心轴下方，且位于前进风格栅上方或下方10mm，使其对进入隔栅的气流干扰最小。启动气溶胶发生器min后停止喷雾。气溶胶发生器停止后再等待5min，然后迅速盖好琼脂平皿。试验结束后对安全柜内各表面进行擦拭消毒。在37.0培养，2428h观察结果。对于新产品或经过重大改型设计的生物安全柜在下述条件下按7.9和7.10的程序分别重复进行试验：吸入口风速偏离标准风速(-0.050.015)m/s，送风风速偏离标准风速(+0.050.015)m/s；吸入口风速偏离标准风速(-0.050.015)m/

28、s，送风风速偏离标准风速(-0.050.015)m/s。A.7.4.2 合格标准每次试验中，琼脂平皿上黏质沙雷菌的菌落数不得超过5个。对照平皿必须是阳性结果。当对照培养皿内含有300个黏质沙雷菌的菌落，称其为阳性。试验重复3次。A.7.5 交叉污染测试用11048104的黏质沙雷菌攻击5min（级和级生物安全柜不需作此项测试)。A.7.5.1 方法开启安全柜待其风机达到额定风速。装有55ml黏质沙雷菌悬液(11048104/mL)的喷雾器，其水平喷射位于工作台面上方76130mm处，且平行于工作面。喷雾器的背面紧靠左（右）内壁的气流分界面，喷嘴正对右（左）内壁。将琼脂平皿按下述方法排布于工作台

29、面（见图A-12、图A13），然后依次打开培养皿盖子：在喷雾器喷嘴下方布置2列对照平皿；距喷嘴一侧内壁36cm处布置一列平皿；距喷嘴一侧内壁36cm以外位置一至两列平皿。启动喷雾器，5min之后关闭喷雾器。试验结束后对环境内各个表面进行擦拭消毒。把喷雾器放在安全柜内对面一侧内壁的中线，重复步骤。停止喷雾15min之后，迅速盖好琼脂平皿。在37.0培养，2428h观察结果。如果结果为阴性，则放回恒温箱继续培养至4448h后再计数。对于新产品或经过重大改型设计的生物安全柜在下述条件下按上述程序分别重复进行试验：吸入口风速偏离标准风速（-0.050.015）m/s，送风风速偏离标准风速(+0.050

30、.015)m/s；吸入口风速偏离标准风速（-0.050.01）m/s，送风风速偏离标准风速(-0.050.01)m/s。A.7.5.2合格标准距离攻击侧壁36cm之内的一些琼脂平皿可以得到枯草芽孢杆菌菌落，它们用作阳性对照。每次测试时，在大于38cm中心处的琼脂平皿所得到的菌落总数不得超过2个。在安全柜的左侧和右侧各做3次重复实验。A.8稳定性测试A.8.1 目的通过施加静态力并测定安全柜的变形和偏移，来测试生物安全柜以下几方面的结构完整性和稳定性：抵抗外力作用造成的翻倒；抵抗外力作用造成的变形；抵抗负载造成的工作台面偏移；倾斜时的稳定性；工作台面水平性。A.8.2 仪器测力计或弹簧秤，精确度为0.1kg千分尺；水平仪。A.8.3抗翻倒试验将安全柜的前后支架调至最高，然后固定使其不能晃动。沿任一方向，自水平位置倾斜10。合格的安全柜应不翻倒。A.8.4抗柜体变形试验用螺栓将安全柜固定在基座或地板上，使其不能移动。在安全柜顶端的背面和一个侧面水平加载1078N (110kg)的外力(加载区域不小于250mm250mm，且均匀受力)。用千分尺测量安