嗅鞘细胞纯化的不同方法及结果.docx

1、嗅鞘细胞纯化的不同方法及结果嗅鞘细胞的不同纯化方法及结果摘要：目的：探讨纯化嗅鞘细胞的不同方法以及这些纯化方法对嗅鞘细胞最终纯度的影响。方法：查阅各数据库中与嗅鞘细胞的分离培养及纯化有关的文献和其他相关书籍。结果：培养的嗅鞘细胞的最终纯度受到多种因素的影响，如嗅鞘细胞的取材来源分离方法等等。对培养的嗅鞘细胞进行纯化可获得高纯的嗅鞘细胞，其中主要的纯化方法有单纯差速贴壁法免疫吸附法化学药物抑制法无血清饥饿法等等，现在的实验研究更趋向于以上2-3种方法联合应用对嗅鞘细胞进行纯化，取得了可观的效果。关键词：嗅鞘细胞；细胞培养；细胞纯化；纯化方法中图分类号：R318.06文献标识码：AThe resu

2、lts of olfactory ensheathing cells from different purification methodsDING Dong1 HE Zhong-yi2(1Department of Human Anatomy and Embryology ,Grade2011,Ningxia Medical University , Ningxia Yinchuan,750004, China; 2Department of Human Anatomy and Embryology, Ningxia Medical University, Ningxia Yinchuan,

3、750004,China)ABSTRUCT：Objective To explore the different methods of purificating the olfactory ensheathing cells and the effects to the olfactory ensheathing cells, final density of these methods. Methods Research some literatures and relative books about culturing and purificating the olfactory ens

4、heathing cells from some database. Results The final density of olfactory ensheathing cells can be determined by several factors, eg. the source and dissociate methods of cells, high density olfactory ensheathing cells can be got by purificating them，the main methods include Different-Time adherence

5、 methodimmunosorbent methodchemical drugs inhabit and so on. The recent researchses rend to combine 2 or 3 methods above and considerable results were acquired. Key Words: Olfactory ensheathing cells;Cell culture;Cell purification;purification methodsChinese Library Classification(CLC)：R318.06Docume

6、nt Code：A促进周围神经损伤后再生的方法有多种，且大都在临床上取得了一定的效果。近些年来的研究表明嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells, OECs）可以促进中枢轴突的再生1。因此有人提出通过OECs移植来促进周围神经损伤后再生的方法，并成为研究热点且被认为有很好的临床应用前景。获取高纯度的移植所需的OECs是进行实验研究和临床应用的基础和前提，然而对取自嗅球或嗅粘膜的OECs进行培养后含有很多杂质细胞，这是很难避免的，其中最主要的是成纤维细胞和星形胶质细胞。因此对取材分离后的OECs进行纯化是获取高纯度OECs的关键。本文主要通过查阅相关文献及书籍，归纳总结几

7、种不同的纯化OECs的方法以及最终结果。其中最主要的方法有差速贴壁法免疫吸附法化学药物抑制法等等，尤其是以上某几种方法的联合应用可以获得理想的高纯度的OECs。1.单一纯化方法作用后OECs纯度单独应用差速贴壁法是最早应用于纯化OECs的方法，此外还有单纯无血清条件培养液纯化法。1.1差速贴壁法通过差速贴壁纯化法来纯化OECs最早是由Nash提出来的，2001年Nash本人在其原有的纯化方法的基础上改良成为18 h+36 h 的两次差速纯化法。单纯差速贴壁法原理是根据成纤维细胞OECs和星形胶质细胞贴壁时所需要的时间不同，经过18 h和36 h 两个时段的差速贴壁后将星形胶质细胞和成纤维细胞从

8、OECs中分离出去2。原文报道改良Nash差速贴壁后OECs纯度可达到93。而国内外许多文献报道经Nash差速贴壁法纯化后检测OECs纯度仅有72-753。张鹏等4在Nash差速贴壁法的基础上再一次改良，发现运用12 h +24 h 的两时间段差速贴壁法也可以达到原先18 h + 36 h的纯化结果。田锋等5通过实验在嗅黏膜OECs的纯化培养过程中将第1次差速贴壁的时间改为24 h，不进行第2次差速贴壁, 简化了OECs纯化培养的步骤。将24 h 前贴壁细胞继续培养，除了成纤维样细胞外，未发现嗅鞘细胞。细胞纯度第7天可以达到90%，细胞生长最为旺盛，第14 d 可以达到85%，细胞数量可以达到

9、最多。迁荣军等6将分离的OECs只进行24 h 后一次差速贴壁，鉴定细胞最终纯度平均为60.41%4.32%。李佳等7取成年SD大鼠嗅球,将分离消化所得细胞悬液进行接种然后分别于接种后2 h6 h 和18 h 3个时间点进行单步骤差速贴壁法去除成纤维细胞, 纯化OECs, OECs纯度分别为(53士5)%（73士8)%和(69士13)%,组间差异有统计学意义。通过实验可以发现差速贴壁法易于操作，可重复性较其他方法好。但是, 有实验发现从不同条件的实验标本培养出来的细胞状态差异很大。来源于46个月龄的实验标本中胎龄较小、取材耗时短所培养出的细胞的状态好、贴壁快；而胎龄较大、取材耗时较长时得到的细

10、胞贴壁慢。因此需要根据实验过程中的观察到的实际情况调整差速贴壁的时间,因此这样就增加了操作的人为性因素。通过这种方法纯化后OECs的最终纯度在70-80左右。1.2无血清条件培养液纯化张鹏等4用提前收集并制备的含有同源的OECs培养上清液的无血清条件培养液将单细胞混悬液直接种植于装有多聚赖氮酸包被的盖玻片的培养皿中，孵育两二天后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEMF12培养基继续培养3周，经免疫组化鉴定后嗅鞘细胞纯度48%-52%。 应用无血清条件培养液去除杂质细胞具有以下几点优势：无血清条件培养液作用缓和，能有效抑制成纤维等杂质细胞，却对OECs影响不大。因为在无血清条件培养液的作用时段

11、内，大部分成纤维细胞处于细胞早期分裂的增殖活性期，此时细胞对血清的需求量很高，因此成纤维细胞生存和增殖分裂所需要的营养链可以被无血清培养液有效的阻断8-9。这一点在相关研究中已得到证实。无血清条件培养液干预纯化法同阿糖胞苷法相比，作用尺度较好掌握且对OECs的损伤小。无血清条件培养液联合含有大量适合OECs生存和增殖所需的营养因子的同源OECs培养的上清液即可以限制成纤维细胞的生长，又可以最大限度的保护OECs。无血清条件培养液可以循环持续的收集和制备，大大减小了实验的成本。此纯化方案没有动用免疫抗体和化学试剂，其因此最后通过纯化得到的OECs很好的保持了其原有的生物活性，这就为进一步的OEC

12、s基础研究及临床移植应用排除了诸多不确定的干扰因素。此方法最大的不足就是纯化后所得OECs纯度较低，一般在50%左右。2.多种纯化方法联合应用纯化OECs主要包括二联纯化方法和三联纯化方法。2.1二联纯化方法纯化OECs主要是在单纯差速贴壁的基础上联合应用其他一种方法，如阿糖胞苷法无血清饥饿法添加神经营养因子法胰酶限时消化法免疫吸附法等等对OECs进行纯化。2.1.1单纯差速贴壁联合阿糖胞苷法纯化OECs 王斌等10将分离的OECs差速贴壁2 d 后换液并加入终浓度为(110-8-110-6)mol/L的阿糖胞苷持续作用48 h, 经免疫染色后发现阳性反应细胞很少，这与吴卫江等11观察结果一致

13、。因为阿糖胞苷所具有的的毒性作用在抑制成纤维细胞生长的同时也对OECs产生了杀伤作用,也可能是因为不同状态的OECs对阿糖胞苷有不同的耐受程度。阿糖胞苷对来源于不同实验标本的OECs的作用时间和作用浓度不容易把握,因此我们认为用阿糖胞苷法对OECs进行纯化培养不太可行。2.1.2单纯差速贴壁联合无血清饥饿法纯化OECs 张鹏等4对分离的OECs培养后运用改良差速贴壁法（12 h +24 h）联合无血清饥饿法进行纯化，纯度可达88%-92%。王斌等10将分离的OECs差速贴壁2 d 后在倒置显微镜观察，成纤维细胞快速生长时段内换用无血清的DMEM/F12培养基培养, 成纤维细胞脱落后用含有10%

14、FBS的DMEM/F12培养基培养。无血清饥饿法培养至36 d 时纯度约90%,9 d 时约为86%,但这种纯化方法得到的细胞状态差,镜下表现为细胞突起细、弯曲,胞体小, 培养至12 d 时纯度约为56%,15 d 约为17%。可见此种纯化方法可使OECs最高纯度保持在90%左右。有学者认为无血清纯化培养法并没有提高OECs的纯度,但可以起到延长OECs高纯度持续时间的作用, 其缺点是细胞增殖缓慢且状态下降。2.1.3单纯差速贴壁联合间断神经营养因子3（nourotrofic 3,NT3）纯化OECs 多种神经营养因子对体外培养的OECs具有明显的促进增殖的作用12-13。王斌等10将分离的O

15、ECs差速贴壁2 d 后用含有终浓度为50ng/mL NT3的DMEM/F12培养,48h后再用含10%FBS的DMEM/F12培养。即含NT3和含10%FBS的DMEM/F12培养基间隔48 h 交替使用。间断应用NT3法培养至39 d 时OECs纯度约为95%,培养至12 d 时纯度约为83%,且细胞状态良好, 表现为细胞立体感强,细胞胞体大,突起长且笔直, 培养至15 d 纯度约为66%。历强等14运用同样的方法纯化OECs，经鉴定后其最大纯度也可达到95%。实验过程中发现随着培养时间的延长OECs分裂增殖能力逐渐减弱, 细胞胞体逐渐变的细小, 突起变细、弯曲, 折光性逐渐减弱，甚至有细

16、胞死亡脱落。原因可能是NT3虽然可以促进OECs的分裂增殖, 但是不能代替血清中的某些成分，从而导致OECs生长增殖所需的营养成分缺失。在改用含100mL/L的FBS、NT3的DMEM/F12培养基培养时发现成纤维细胞迅速增殖, 其增殖速度大大超过OECs的增值速度。这可能是NT3与血清中的某种成分结合后发生促进或协同促进作用, 使成纤维细胞迅速增殖,并与OECs竞争有限的生长环境，从而导致OECs纯化培养失败。因此选择间断应用NT3对OECs进行原代纯化培养，即用含NT3的DMEM/F12培养液培养时OECs可以继续分裂增殖, 成纤维细胞因为失去了含血清的培养环境，导致细胞增殖明显减弱, 并

17、伴随有少量细胞坏死脱落。当再改用含血清的培养基培养时，基于前期OECs的生长状态优于成纤维细胞，此时便出现OECs的高密度抑制作用，导致成纤维细胞增殖不明显，而由于血清的作用OECs状态渐恢复。当成纤维细胞开始增殖时继续改用含NT3的DMEM/F12培养基培养, 这种间断改变培养基成分的纯化方法既可以维持OECs对成纤维细胞的高密度抑制作用, 同时又保证了OECs的增殖和活性。由此可见间断应用NT3法纯化培养OECs可以在更长的时间内得到状态良好的高纯度的OECs。2.1.4单纯差速贴壁联合胰酶限时消化法纯化OECs 徐朝伟等15对分离后培养的OECs经6 h 、24 h 两次差速贴壁去除杂质

18、细胞，培养至12 d 左右经胰酶限时消化，留成纤维细胞于瓶壁，重悬的细胞进行鉴定，其纯度为（83.77.7）。这与杨博宇等16采用差速贴壁与化学药物并胰酶消化法纯化新生大鼠OECs所得结果类似,纯化后OECs最终纯度在80%-90%左右。胰酶限时消化的基本原理就是根据OECs与成纤维细胞的贴壁能力不同，选择合适的胰酶消化时间段，经特定时间的胰酶消化后，贴壁能力弱的OECs比贴壁能力相对强的成纤维细胞要提前脱落，从而弃去贴壁的成纤维细胞。2.1.5单纯差速贴壁与免疫吸附法联合纯化OECs 苗宗宁等17将一定浓度的神经生长因子受体P75（neuro growth factor receptor P

19、75,NGFRP75）单抗包被培养皿后，再用含终浓度为210- 7mol/L 的阿糖胞苷的DF12培养基干预，获得最终OECs最终纯度为90%以上。康新等18将分离的OECs培养7 d 后采用胰酶限时消化法重悬细胞并接种到事先被P75抗体包被的培养皿中，最终鉴定OECs纯度可达90.40%94.56%。免疫吸附法的基本原理即根据NGFRP75是神经营养因子低亲和力受体, 也是OECs细胞膜表面特异性的标记物，能与相应的抗体发生特异性结合19。因此,这种高特异性的抗原抗体反应能保证包被在培养皿上的NGFRP75抗体可将OECs吸附在培养皿的表面。待大量的OECs贴壁,然后通过培养液的作用使其快速

20、生长增殖。采用免疫吸附法纯化可以获得较高纯度的OECs，缺点是价格昂贵，操作繁琐。综上所述，以单纯差速贴壁法为基础联合其他方法的二联纯化方案并非都具有较强的实用性。差速贴壁联合阿糖胞苷方案中化学药物Art-c的应用剂量及作用时段很难控制，且在抑制成纤维细胞生长的同时对OECs也造成无法避免的杀伤，因此很难获得较高纯度的OECs,实验中不建议应用此方法纯化。差速贴壁联合无血清饥饿法的二联纯化方案可使OECs最高纯度保持在90%左右。但有学者认为无血清纯化培养法只是起到了延长OECs纯度持续时间的作用,并没有提高OECs的纯度, 其缺点是细胞状态下降和增殖速度缓慢。差速贴壁联合间断应用NT3的二联

21、纯化方案通过维持OECs对成纤维细胞的高密度抑制作用, 最终所得OECs的纯度可在90%以上，同时又保证了OECs的增殖速度和活性。由此可见间断使用NT3纯化培养OECs可以在相对较长的时间内得到状态良好且高纯度的OECs。差速贴壁联合胰酶限时消化的二联纯化方案可是OECs纯度保持80%-90%，且操作方法简便易行，价格低廉。同差速贴壁联合间断应用NT3的二联纯化方案具有较好的实验可行性。应用免疫吸附法的二联纯化方案虽也可获取90%左右的OECs纯度，但操作繁琐且价格昂贵。因此本人认为各种二联方案的可行性由大到小依次为差速贴壁联合间断应用NT3，差速贴壁联合胰酶限时消化，差速贴壁联合无血清饥饿

22、法，应用免疫吸附法的二联纯化方案，单纯差速贴壁联合阿糖胞苷法。2.2三联纯化方法纯化OECs三联纯化方案纯化OECs的实验少有报导，主要是在差速贴壁的基础上联合其他两种方法进行纯化。杨博宇等16在其实验中通过比较证实了差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法的三合一操作技术，是一种高效率的纯化培养嗅球OECs的方法，通过这种方法纯化OECs的纯度达85以上。本人认为，三联纯化方案中比较可行的操作是在相对简单的二联纯化方案的基础上增加一种纯化方法，比如在差速贴壁联合胰酶限时消化的基础上在并用NT3的方案是一种理想的纯化方案，但其结果是否优于其他二联方案仍需通过实验证明。3.结语OECs能够促进中枢及周

23、围神经损伤后再生及修复的结论已经得到证实，此治疗方案应用于临床面临的关键问题是如何获得高纯的OECs。近年来，科研工作者们尝试了许多种纯化OECs的方法并取得了显著的成果。目前的研究现状主要趋向于在差速贴壁的基础上联合应用其他一种方法的二联纯化方案来获取高纯度的OECs,大量实验证实这些二联纯化方案各有利弊，可行性不一。而且也有研究人员提出在保证获得高纯度OECs的前提下，还应该避免纯化OECs的方案对OECs的活性产生不良影响。本人认为，在选择纯化方法时还应考虑其他可能影响OECs最终纯度的因素，比如OECs的来源20,21取材方法等的不同。有报道称来源于成年SD大鼠和新生SD大鼠的OECs

24、贴壁时间不同，因此在选择差速贴壁时间段时应考虑这点。所以OECs的纯化还应遵循个体化的原则，综合考虑各方面因素，从而选择一种最合适的纯化方案。参考文献1 Dressler MR,Butler DL,Boivin GP.Effects of age on the repair ability of mesenchymal stem cells in rabbit tendon J.Orthop Res ,2005,23(2):287- 2892 Nash HH，Borke RC，Anders JJNew method of purification for establishing primar

25、y cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb JGlia2001.34(2):81-873 范志海,沈忆新,陆政峰,等.成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的分离、培养、纯化与生物学特性的研究J.苏州大学学报：医学版，2007，27(4):547-551 3 Fan Zhi-hai, Shen Yi-xin, Lu Zheng-feng, et al. In adult rat olfactory bulb of olfactory ensheathing cell isolation, culture, purification

26、and biological characteristics research J. Journal of suzhou university, medical sciences, 2007, 27(4):547-551.4 张鹏,沈忆新,陆政峰，等.改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化培养大鼠嗅鞘细胞术J.中国组织工程研究与临床康复,2009，13(1):65-704 Zhang Peng, Shen Yi-xin, Liu Zheng-feng, et al. The skill of purificating and cultivating rat olfactory ensheathin

27、g cells by improved adhension after different periods with serum-free conditioned medium J. China tissue engineering research and clinical rehabilitation, 2009, 13(1):65-705 田锋,姜曙祥,贺西京,等.经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞J.细胞与分子免疫学杂志,2009,25(12):1189-11915 Tian Feng,Jiang Shu-xiang, He Xi-jing,et al. Cultivate

28、 and purificate olfactory ensheathing cells from olfactory mucosa by the method of improved isolate and adhension after different periodsJ. Journal of cellular and molecular immunology,2009,25(12):1189-11916 迁荣军,周迎春,赵洪洋，等.新生大鼠嗅鞘细胞的改良培养方法研究J.神经解剖学杂志，2012,28(3):307-3116 Qian Rong-jun,Zhou Ying-chun,Zh

29、ao Hong-yang,et-al.The research of improved culture method of olfactory ensheathing cells from newborn ratsj.Neuroantomy magazine,2012,28(3):307-3117 李佳,张旭,余清,等.用于移植的嗅鞘细胞的纯化培养方法研究J.中国神经免疫学和神经病学杂志,2009,16(4):289-2927 Li Jia,Zhang Xu,Yu Qing,et al.The research to purification and culture method of olf

30、actory ensheathing cells used for transplantationJ.Chinese journal of neuroimmunology and neurology,2009,(4),289-2928 历俊华,万虹,翟晶,等.无血清饥饿法去除神经组织培养中的成纤维细胞J.首都医科大学学报,2004,25(2):205-2078Li Jun-hua, Wan Hong, Zhai Jing, et al. Starvation method without serum to remove fibroblasts in the nervous tissue cul

31、ture J. Journal of capital university of medical sciences, 2004,25(2):205-2079 Ito D, Fujita N, Ibanez C, et al.Serum-free medium provides a clinically relevant method to increase olfactory ensheathing cell numbers in olfactory mucosa cell cultureJ. Cell Transplant. 2008,16(10):1021-102710 王斌，贺西京,历强

32、,等.不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞J.四川大学学报( 医学版),2008,39(6):1023-102610 Wang Bin,He Xi-jing,Li Qiang, et al. Cultivate olfactory ensheathing cells from human embryo olfactory bulb by different purification methods J. Journal of sichuan university (medical edition), 2008, 33 (6) 6:1023-102611 吴卫江,惠国桢,陆华,等.人胚嗅鞘细胞不同取材及培养方法对纯度的影响J.中华实验外科杂志, 2004,21(7):841-844.11 Wu Wei-jiang,Hui Guo-zhen, Lu Hu, et al. The influence of dif