HIV抗体检测.docx

1、HIV抗体检测第二章 HlV抗体检测1范围本章规左了 HIV抗体的检测方法、检测程序、检测报告及检测策略，适用于各级各类医疗机 构、疾病预防控制机构、检验检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对HlV感染者/AIDS 病人的诊断、报告和处理的实验室依据。2规范性引用文件ReViSed recommendations for the SeIeCtiOn and USe Of HIV antibody tests WHO/UNAIDS ReViSed VerSiOn 2001.实验室生物安全通用要求(GB 19489-2004)o3HlV抗体检测实验室应符合全国艾滋病检测工作规范(1997年版

2、)中对检测实验室人员、建筑设施和设备等 条件的要求。应符合实验室 生物安全通用要求(GB 19489-2004)对II级生物安全实验室(BSL-2) 的各项要求。实验室的质量保证按本规范第八章规立执行。实验室安全防护按本规范第七章规左执行。4HlV抗体检测的目的和要点4.1HlV抗体检测的目的4.1.1 HlV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。4.1. 2以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及英变化趋势而进行的检测，检测的 人群包括各类高危人群和一般人群。4.1. 3以诊断为目的的检测是为了确左个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿 咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行

3、的体检等。4.1. 4以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原 料血浆筛查。4.2HlV抗体检测的要点4.2. 1筛查试验阳性不能出阳性报告。4.2.2严格遵守实验室标准操作程序(SOP)O4.2.3严格按照试剂盒说明书操作。4.2.4注意防止样品间交叉污染。5常规HIV抗体检测的方法和程序HlV抗体检测分为筛査试验（包括初筛和复检）和确认试验。5.1 HIV抗体检测筛查试验5.1.1筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、在有效期内的试剂。推荐使用经 临床质量评估敏感性和特异性髙的试剂。5.1.2筛查方法5.1. 2. 1常用的筛查方

4、法是酶联免疫试验（ELlSA）目前国内外主要使用第三代（双抗原夹心法）试剂，少数使用第二代试剂。血源筛查仍以第 三代ELlSA为主，国际上有些国家和地区已将线性免疫酶测左（第四代ELISA试剂）用于血源筛 查。第四代ELISA试剂是最近发展起来的HIV抗原抗体联合测定试剂，可同时检测P24抗原和抗 HIV-I/2抗体。与第三代抗HlV-I/2试剂相比，检出时间提前了 49. Id。其优点在于能同时检测 抗原抗体，降低血源筛査的残余危险度。5.1.2.2快速检测（RT）及其它检测随着对HIV感染者和AlDS病人抗逆转录病毒治疗的进展，及对无症状HIV感染者提供自愿 咨询检测（VCT）的迫切需求，

5、简便、快速的HIV检测方法被广泛应用。常用的主要有以下几种：（1） 明胶颗粒凝集试验（PA）： PA是HIV血淸抗体检测的一种简便方法，是将HlY抗原致敏 明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时， 经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。 PA试剂有两种，HlV-I和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFD HIV-I/2 PA）,已经我国食品药品 监督管理局（SFDA）注册批准；HIV-K HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（SERoDlA-HIY-1/2）可初 步区分HIVT型和HIV-2型，目前我国

6、尚未引进。（2） 斑点EIA或称斑点ELlSA （dot-EIA）：以硝酸纤维膜为载体，将HlV抗原滴在膜上成点 状，即为固相抗原。加血淸样品作用，以后步骤同ELlSAo阳性结果任膜上抗原部位显示岀有色 斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。（3） 斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：与斑点EIA相似，也是以硝酸纤维膜为载体。 区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。 试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于 中度敏感的ELISA,适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有在国内被SFDA批准注

7、册的国 外进口试剂和国内产品。一般可在1030min内判读结果。（4） 艾滋病唾液检测卡：在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgP41gp36蛋白抗原，可同时 检测含在唾液中的HIV-I/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HlV IgA与IgG 抗体，敏感性特异性与ELlSA相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。以唾液 为样品测左HIV抗体的ELISA、免疫印迹法（WB）试剂已经美国FDA批准。（5） 其它快速筛査试验方法:家庭HlV检测（Home ACCeSS SyStem）等。5.1.2.3尿液HIV抗体检测1996年美国FDA首次批准HIV-1尿液ELISA

8、试剂，我国也正在研制尿液HIV抗体检测试剂。 主要适用于静脉注射毒品（IDUS）人群和其它髙危人群的大而积流行病学调查、监测。筛查阳性 者仍需采血做确认试验才能确定。5.1.3筛查试验根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛和重复检测（复检）。5.1. 3. 1初筛试验：以第三代ELISA （双抗原夹心法）为例。（1） 实验准备：试验开始前将试剂和样品放在室温（1823C）,按实验室SoP做好试剂准 备。磷酸盐缓冲液：若液体内有结晶,应放苣在37C直至溶解，用蒸馅水1： 25稀释浓缩液，4C 保存2周。TMB底物液：使用前配制，TMB液和过氧化服液等量混匀。IM硫酸终止液：85 ml蒸

9、馅水中加入5 ml浓硫酸。备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血淸后，按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进 行筛査检测。（2） 实验操作1装好所需使用数目的孔条,每孔均加入100 u 1样品稀释液。设3个阴性对照孔，1个HlV-I 阳性对照孔，若需要可再设1个HIV-2阳性对照孔。2每孔加入50 Ul待检样品及对照（对照要后加），未用孔用样品稀释液加满以溶解结合物 球，以免堵塞洗板机孔。可震摇15S, 37 + 24C孵育605mino3置洗板机上洗涤6遍（用洗液将反应孔完全加满,静巻3060S,共洗涤6遍，洗完后孔上方 及底部不应残存液体,禁止在滤纸上拍干）。4每孔加入IOOUl底物液，勿搅

10、动，室温避光孵H302mino5每孔加入IOOul IM硫酸终止反应，充分混匀。6在2h内置于酶标仪读数，单波长450nm,或双波长450/63Onln测OD值。（3） 实验结果1阴性对照（NC）, HIV-I阳性对照（PCI）, HIV-2阳性对照（PC2）NC必须V0. 25方可用，排除NOO. 25的值，计算NC平均值。NC界限范围：0. 6倍NC均值VNC 0.4, PC2-NC 均值 M 0.43CUt Off值二阴性对照均值+ 0. 100小于CUt Off为阴性，大于或等于CUt Off为阳性（4） 报告：对呈阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具HIV抗体阴性报告：对呈阳 性

11、反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。5.1.3.2复检试验：对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛 查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性：如均呈阳性反应，或一 阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认（见图1）。图1 HIV抗体筛査检测流程5. 1.4初筛试验结果的报告对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告（可用附表1）：对初筛试 验呈阳性反应者不能岀阳性报告，可岀具“HIV抗体待复查”报告（附表1）。5. 1. 5初筛试验呈阳性反应样品的转送如需送上级实验室进行复测或确认，需要填写“HIV抗体复测送检单”（附表2）

12、,经1鋼检 验人员和1名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋病筛査中心实验室，再转送艾 滋病确认实验室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。5. 1.6对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。5.2HlV抗体确认试验5. 2.1确认试验的试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。5. 2.2确认试验方法包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验（LIATEK HIVIH）.放射免疫沉淀试验（RlPA）及免 疫荧光试验（IFA）O国内常用的确认试验方法是WB。5. 2.3确认检测流程有HIV-I/2混合型和单一的HIV-1或HIV-2型。先用HIV-I/2混合型试剂进行

13、检测，如果呈 阴性反应，则报告HlV抗体阴性；如果呈阳性反应，则报告HIV-I抗体阳性：如果不满足阳性标全国艾滋病检测技术规范 准，则判为HlV抗体检测结果不确怎。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，需用HIV-2型免疫 印迹试剂再做HlV-2的抗体确认试验,呈阴性反应,报告HIV-2抗体阴性;呈阳性反应则报告HIV-2 抗体血淸学阳性,并将样品送国家参比实验室进行核酸序列分析，见图2。图2 HlV抗体确认检测流程5.2.5确认试验结果的判左下面是我国使用W确认HIV感染的判泄标准和判左结果的基本原则。在实际工作中还应参 照所用试剂盒说明书综合判定，遇疑难情况应报上级实验室解决。5.2. 5

14、. 1 HlV-I 抗体阳性（+ ）至少有2条env带（gp41和gpl60gpl20）岀现，或至少1条env带和p24带同时出现。5.2. 5. 2 HIV-2抗体血淸学阳性（+）同时符合以下2条标准可判为HIV-2抗体血淸学阳性：（1） 符合WHo阳性判定标准，即出现至少2条env带（gp36和gpl40 gplO5）（2） 符合试剂盒提供的阳性判定标准。5.2. 5. 3 HIV 抗体阴性（-）无HlV抗体特异带出现。5.2. 5. 4 HlV抗体不确泄（）出现HlV抗体特异带，但不足以判左阳性注：（I）HIV-I 抗体特异带包括：env 帶：gpl60gpl20x gp41: gag

15、帶：p55. P24、pl7 （或 pl8）; POI 帶：p66 （或 p65k P51、p31o HIV-2 抗体特异条带包括:erw 带:gpl40gpl05 gp36: gag 带:P56、P26、pl6： POI 带:p68 P53、p34o （由于使用的毒株不同 HIV-2 env带也可为gpl25gpS0x gp36）o5.2.5 HlY抗体确认试验结果报告确认试验由确认实验室根据检测结果出具“HIY抗体确认检测报告单”（附表3）,报告HIV 抗体阳性（ + ）、HIV抗体阴性（-）及HIV抗体不确定（）。5.2. 5. 1符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性

16、（+）”，并按规沱做好检测后咨 询、保密和疫情报告工作。5.2. 5. 2符合HlV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性（-）”。如果近期有高危行为，如性 乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除因“窗口期”而出现的假阴性结果，建议 髙危行为后3个月时再做抗体检测。也可进行HIV-I P24抗原或HIV核酸检测，作为辅助诊断。5.2. 5. 3符合HIV抗体不确左判断标准，报告“HIV抗体不确泄（）”，在备注中应注明“3个 月后复检”，同时进行以下处理：（1） 随访复检：每3个月随访复检1次，连续2次，共6个月。如果检测时疑壺时间已超过 3个月，则在3个月后随访1次即可。将前后2份样

17、品同时检测，仍呈不确左或阴性则报告HlV 抗体阴性，如果在随访期间发生带型进展，符合HlV抗体阳性判左标准则报告HIV-1或HIV-2抗 体阳性。（2） 必要时可做HlV-I P24抗原或HIV核酸测泄，但检测结果只能作为辅助诊断依据，确认 报告要依据InL清学随访结果。5. 2. 6发出确认报告的同时要做好检测后咨询。5. 2. 7 HIY抗体确认报告由1名具有高级卫生技术职称的人员复核签字，按原送检程序反馈。如 确认对象户口不属于本辖区，确认报告应同时抄送HIV感染者户口所在地的省艾滋病确认中心实 验室。其它系统确认的地方人员（包括本地和外地），也应及时向当地卫生行政部门和省艾滋病 确认中

18、心实验室报告。5. 2.8省艾滋病确认中心实验室难以确认的样品，送国家艾滋病参比实验室确认。同一受检对 象的样品在不同实验室得到不一致的确认结果时，由国家艾滋病参比实验室和艾滋病确认实验室 审评及技术指导专家组予以仲裁。6 HIV抗体检测的替代策略除上述常规检测程序以外，可以根据不同的目的，对HIV流行强度不同的地区和不同人群采 用不同的替代策略，见表1。表1 HIV抗体检测的替代策略目的地区人群替代策略艾滋病疫情报告任何地区任何人群替代策略I高流行地区高危人群替代策略1【VCT髙流行地区一般人群替代策略III其它地区任何人群替代策略III6.1替代策略【（HIV感染疫情报告检测策略）6.1.

19、1适用范围全国HlV感染疫情报告。6.1.2检测程序及结果报告6.1.2.1先用一种筛查试剂检测，出现阴性反应则报告HIV抗体阴性（-）”。出现阳性反应则 用两种不同原理或不同厂家的试剂复测（其中包括进口第三代ELISA试剂）。6. 1. 2. 2两种试剂复测均为阳性，且苴中第三代ELlSA试剂复测样品OD值与临界值（CUtoff） 的比值（S/C0） 26.0者可作阳性考虑,上报疫情（附表4）。两种试剂复测结果均为阳性,但第 三代ELlSA试剂复测S/C0比值在1. 0-5. 9之间，或两种试剂复测结果呈一阴一阳，应进一步作 确认试验，按照确认试验的标准判断结果（图3）。图3替代策峪I （H

20、lV感染疫情报告检测策略）检测流程6.2替代策略II （髙危人群VCT检测策略）6. 2.1适用范帀HIV感染高流行地区髙危人群的VCT.应在确认中心实验室和确认实验室或以上实验室指左 的筛査实验室进行，用高质量筛查试剂检测及判断结果（见6. 2. 2）O使用该策略判断结果，阳性 报告须由确认中心实验室和确认实验室或以上实验室认可的筛査实验室出具。6. 2.2检测程序及结果报告6. 2. 2. 1先用第一种筛查试剂（ELISA-I ）检测，出现阴性反应报告HlY抗体阴性；出现阳性反 应则报告“HIV抗体待复查”，并用第一种酶联试剂（ELISA-I）和第二种酶联试剂（ELlSA-2）复检。6.

21、2. 2. 2两种ELlSA试剂检测结果均阴性则报告HlV抗体阴性：两种ELlSA试剂检测结果均阳 性，且S/CO比值均大于或等于6. O者，用第三种筛查试剂（高特异性筛查试剂）检测，如果第 三种试剂检测结果为阳性,在符合使用该策略条件的地区和人群中可以岀具WHIV-I抗体阳性（ + ）” 报告，使用“HIV抗体替代策略检测报告单”（附表5）。6. 2. 2. 3下列情况均需做确认试验，按照确认试验的结果岀报告：两种ELISA试剂检测结果一 阴一阳、两种ELlSA试剂检测结果均阳性但一种或二种S/CO在1.05.9之间、第三种筛查试剂 检测结果为可疑或阴性。图4替代策略II （高危人群VCT检

22、测策略）检测流程6.2.3在发放检测报告的同时上报疫情。6.2.4做好检测后咨询。6.3替代策略III （一般人群VeT检测策略，图5）6.3.1适用范围HIV高流行地区一般人群检测及其它地区各类人群的VCT检测。6.3.2检测程序及结果报告6.3. 2. 1先用一种髙敏感性筛查试剂检测，出现阴性反应报告HlV抗体阴性：出现阳性则用第 二种筛查试剂（高特异性）复检。6.3. 2. 2第二种筛查试剂检测阴性则用第三种筛査试剂（另一种髙特异性试剂）检测：第二种 筛查试剂检测为阳性则按疑似阳性咨询，建议进一步做确认试验，按确认试验的结果报告。6.3. 2. 3第三种筛查试剂检测为阴性则报告HlV抗体

23、阴性：第三种试剂检测为阳性按疑似阳性 咨询，建议进一步做确认试验，按确认试验的结果报告。图5替代策略In （ 一般人群VCT策略）的检测及结果报告流程图6.3.3发放检测报告的同时上报疫情。6.3.4对报告阳性者做好检测后咨询。7 HlV抗体检测情况季报的时间和程序（图6）7.1艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点应于每季度首月5日前填写“HIV抗体检测数季报表”（附 表6）,向艾滋病筛查中心实验室报告上季度检测情况。没有艾滋病筛查中心实验室的地区可直接向艾滋病确认中心实验室报告。7.2艾滋病筛查中心实验室应于每季度首月10日前将本实验室和本辖区内各筛查实验室上季度 报告的检测情况（附表6）汇总，报

24、告艾滋病确认中心实验室。7.3艾滋病确认实验室应于每季度首月10日前将上季度检测情况汇总后（附表6）,报告当地艾 滋病确认中心实验室和同级卫生行政部门。7.4艾滋病确认中心实验室应及时收集、整理和分析辖区内HlV抗体检测情况，于每季首月15 日前向省级卫生行政部门和中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心（简称中国疾控中心 性艾中心）参比实验室报告。同时，按艾滋病疫情报告的有关规泄上报疫情。7.5在非送检样品中（如专项调査与研究等）发现的艾滋病病毒抗体阳性者，应向所在地的省 疾病预防控制中心报告，并填写“HIV抗体确认检测报告单”（附表3）,报中国疾控中心性艾中 心参比实验室。7.6实验室上报检测结果的同时，应随时报同级监测人员，以便及时随访调查。图6 HrV抗体检测情况季报流程未设巻 艾滋病 筛查中 心实验 室的地 区