作物保护优秀论文4.docx

1、作物保护优秀论文4岩木瓜化学成分的分离、结构鉴定与杀虫活性植物保护（含农药方向） 2005级 沈丽淘 指导教师 王学贵 讲师摘要：为了研究岩木瓜的杀虫活性成分，本文利用活性跟踪分离技术，采用硅胶柱层析、薄层层析及葡聚糖凝胶等分离手段对岩木瓜的化学成分进行了分离、纯化，结合化合物理化性质和波谱数据对其结构进行了鉴定。结果表明，从岩木瓜中分离得到4个化合物，分别为-香树脂醇乙酸酯（1）、蒲公英赛酮（2）、柯依利素（3）及齐墩果酸（4）。利用胃毒法测定了化合物(500g/g)对家蝇的生物活性，处理家蝇48h后，蒲公英赛酮（2）的校正死亡率达到83.33%，弱于对照药剂(鱼藤酮)校正死亡率（100%）

2、，与其他处理差异显著，表现出较好的杀虫活性，其杀虫作用机理值得进一步研究。关键词：岩木瓜；活性跟踪分离；家蝇；杀虫活性；蒲公英赛酮Compounds from Ficus tsiangii Merr. ex Corner: isolation, structural elucidation and insecticidal activityShen Li-tao Plant protection (direction of pesticide),Grade 2005Directed by Wang Xue-gui (lecturer)Abstract: The chemical constit

3、uents of Ficus tsiangii Merr. ex Corner were isolated and purified with activity-guided fractionation technology by silica gel, thin-layer chromatography and Sephadex LH-20 column chromatography to investigate the insecticidal activity constituents,and their structures were identified with spectrosc

4、opic means in this paper. The results indicated that 4 compounds were isolated and their structures were identified as -amyrin acetate(1), taraxerone(2), chrysoeriol(3), oleanolic acid(4). The insecticidal activities of compounds (500g/g) were also evaluated against imago of Musca domestica with sto

5、mach-toxicity test.After treated 48h, the corrected mortality of taraxerone(2) achieved 83.33%,which was a little lower than contrast pesticide (rotenone) but significant with other treatments. Above all, taraxerone showed better insecticidal activity, and the insecticidal mechanism would be worthy

6、of further study.Keywords: Ficus tsiangii Merr. ex Corner; activity-guided fractionation; Musca domestica; insecticidal activity; taraxerone由化学农药带来的残留、环境污染等问题受到人们普遍关注，随着社会的发展，人们对环境和食品安全的要求越来越高。因此，植物保护科学研究工作者开发出高效、低毒、低残留的药剂，有效控制有害生物危害农林作物为害，降低农药对环境及食品的污染已成为首要目标。植物源农药作为生物农药的一种成为近来的研究热点1。我国具有丰富的植物资源，从植

7、物中提取出杀虫活性成分已有较多成功报道。从楝科植物印楝中开发的印楝杀虫剂是当今世界公认的最优秀的生物农药之一,其国际影响与市场空间日益扩大2。吴文君等3对传统杀虫植物苦皮藤的化学成分、衍生合成、作用机理、制剂加工、应用技术等进行了系统研究，研制出的0.2%苦皮藤素乳油于2001年投入批量生产 ,取得明显的经济效益和环境生态效益。曾东强等4报道了山石榴果实提取物对小菜蛾的拒食作用，研究表明其甲醇提取物对小菜蛾的拒食活性高，24h非选择性拒食率达82 %。曾宪儒等5筛选了广西6种植物提取物对蔬菜害虫的生物活性，发现葫蔓藤对桃蚜、萝卜蚜和小菜蛾3龄幼虫具有较好的触杀活性。Georges et al6

8、以三齿骚扰蚊（Ochlerotatus triseriatus）、烟粉虱（Bemisia tabacci）成虫为研究对象，测定了采自布基纳法索的8种植物的杀虫活性，并通过活性跟踪从C. nigricans叶片提取物中分离出大黄素、citreorosein、emodic acid 和毛地黄黄酮，其中大黄素活性最明显。岩木瓜（FicustsiangiiMerr. ex Corner）为桑科榕属植物，为我国特有物种，在湖南发现其大量具有茎花现象7。到目前为止国内外对其植物提取物及次生代谢产物用于控制病虫草等有害生物发生没有任何相关研究。基于前期42种药用植物甲醇提取物对病虫草的生物活性的初步测定，发

9、现岩木瓜对家蝇表现出较好的活性。因此，本研究以家蝇作为活性跟踪靶标，对岩木瓜杀虫活性成分进行了跟踪分离和鉴定，并测定了化合物的生物活性。1 材料与方法1.1 供试材料1.1.1 植物材料岩木瓜（F. tsiangii Merr. ex Corner），采集于重庆市金佛山自然保护区，由重庆市药用植物栽培研究所易思荣副研究员采集并鉴定。1.1.2 供试昆虫家蝇(Musca domestica Vicina Macquar)：在室内连续饲养多代，成虫饲料为麦麸+奶粉+糖，幼虫饲料为医用酵母片+麦麸+奶粉。成虫羽化后放入成虫饲料和水，以羽化34天的成虫供试。1.1.3 供试试剂甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三

10、氯甲烷、石油醚等化学试剂（均为AR）：广州化学试剂厂。1.1.4 主要仪器EYELAN-1型旋转蒸发仪：日本理化公司；101-2型电热恒温鼓风干燥箱：上海南阳仪器有限公司；FE-130植物粉碎机：河北黄晔科学仪器厂；1702-MP8型电子天平：德国Startorius公司；HH.S21-4型水浴锅：上海悦丰仪器仪表公司。1.2 方法1.2.1 材料的干燥与提取将采集的植物在自然状况下风干，然后用白瓷盘盛装放入真空干燥箱内烘干，设置箱内温度为55，压力为0.05Pa，直到植物样品完全干燥为止。然后用粉碎机进行粉碎，得到60目筛的植物样品粉末。采用冷浸法8进行提取，称取50g干粉样品装入大型广口瓶

11、，然后加入500mL甲醇进行提取，每天振荡一次，5天后滤出浸提液，重复3次，将滤出液合并，在55下减压蒸馏，得到植物甲醇提取物浸膏，称重。1.2.2 化学成分的初步分离岩木瓜干粉经95%甲醇冷浸提取并依次经石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取后，得到石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物，并称重。1.2.3 正相硅胶柱层析分离洗脱剂系统的选取：用两种或三种互溶且极性不同的溶剂配成一系列成极性梯度的混合溶剂，用TLC板对样品进行展开。选择样品在TLC板上展开后分开的点数多，且多数点的Rf值在0.2-0.6以内的溶剂系统为合适的洗脱系统。拌样：在待分离样品中加入少量易挥发且对样品溶解性好的溶剂，

12、稍稍水浴加热使样品完全溶解。将硅胶（拌样硅胶比柱层析所用硅胶的颗粒较大）加入溶解的样品溶液里，放在水浴上，边加边搅拌，直至溶剂完全挥干。装柱：湿法装柱洗脱剂与适量硅胶搅拌混匀，倒入固定好的层析柱中，用洗耳球在四周轻敲层析柱，使柱面平整。同时打开活塞，使溶剂缓缓流出，沉降至硅胶填料面不再下降为止。上样：用药勺将拌好的硅胶样品均匀洒在装好的硅胶填料上面，轻敲使样品层高度不再下降，然后在样品层上洒上一层石英砂或加一团脱脂棉。洗脱：上样后，从层析柱上方加入洗脱溶剂进行洗脱。根据层析柱装入填料的量和柱直径大小，定量接取流分。所接流分浓缩后经TLC点样检验，比较各流分组分的异同。1.2.4 Sephade

13、x LH-20凝胶分离先将Sephadex LH-20进行预处理，然后根据需要用不同的溶剂反复浸泡，溶剂一般为丙酮、甲醇等。将浸泡好的Sephadex LH-20装入细长的玻璃柱中，用相应的溶剂反复洗脱。待液面与凝胶平齐时，快速加入经0.45m微孔滤膜过滤的样品溶液，等样品刚好完全进入凝胶时，加入溶剂进行冲洗，从下端接收。1.2.5 薄层层析（TLC）薄层层析硅胶板经110活化2h后，存放于干燥器中备用。加样与展开：待分离样品用溶剂溶解到适量浓度，用直径0.3mm的毛细管点样在距薄层板边缘1cm左右的直线上，挥发干溶剂后放入层析缸中展开。检测：展开完成后（距上端20%-40%均可），取出硅胶板

14、，吹干溶剂，先在紫外灯下观察荧光显色情况，后放在碘缸中用碘显色，初步观察样品情况。1.2.6 结构鉴定 结构鉴定主要根据核磁共振（NMR）图谱进行，由核磁共振谱推测C、H原子数及相关的基团，推测出化合物的结构，通过对比文献，对波谱数据进行归属。1.2.7 杀虫活性测定方法家蝇：采用胃毒法8。活性跟踪测定时用电子分析天平准确称取0.1g各萃取物于10mL的刻度试管中，用丙酮溶解并定容至10mL刻度配制成10mg/mL溶液。化合物杀虫活性测定时将分离所得化合物及鱼藤酮（对照药剂）用丙酮分别配制出500g/mL浓度的药液。然后称取1g白砂糖于直径为2.5cm，高为7.5cm的指形管中。用微量进样器准

15、确吸取1mL各种药液转入指形管中，待溶剂自然风干后备用。挑选羽化后4天整齐一致的家蝇成虫，用乙醚麻醉后，迅速向每管中接入10 头家蝇。每处理设3 次重复，每重复10头试虫，丙酮作空白对照。处理12h、24h、36h、48h后分别记录死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率。1.2.8 统计分析死亡率（%）= 校正死亡率（%）=利用SPSS10.0（Duncans 新复极差测定法）及EXCEL2003统计分析不同处理的差异显著性及标准误。2 结果与分析2.1 岩木瓜枝叶提取、初步分离及其对家蝇的毒杀活性2.1.1 提取和初步分离结果岩木瓜干粉20.3kg经95%甲醇冷提取得到浸膏约1850g，依次经石油

16、醚、氯仿和乙酸乙酯萃取后，得到石油醚萃取物（435.0g）、氯仿萃取物（35.5g）、乙酸乙酯萃取物（57.8g）和水萃取物（975g）。2.1.2不同萃取物对家蝇的杀虫活性不同溶剂萃取物的杀虫活性见表1，由表可见各萃取层处理家蝇12小时后校正死亡率不高，均在20%左右；各萃取层处理家蝇24小时后，石油醚萃取物的校正死亡率最高，达到90%；其次是氯仿层，其校正死亡率80%，然后为水层处理，其校正死亡率为43.33%，这三层校正死亡率均与乙酸乙酯萃取物处理差异显著；各萃取层处理家蝇36小时后，石油醚萃取物处理家蝇的校正死亡率最大，达到96.67%，其次为氯仿萃取物，其校正死亡率达到80.00%，

17、而水层处理其校正死亡率为63.33%。从以上分析结果说明岩木瓜甲醇提取物的活性成分主要集中在石油醚萃取物、氯仿萃取物。表1 岩木瓜甲醇提取物各溶剂萃取物对家蝇的杀虫活性（2000g/g 糖）Table 1 Insecticidal activity of partition extracts from F. tsiangii against Musca domestica（2000g/g sugar） （四川雅安，2008.11）萃取层 Fraction12 h校正死亡率（%）The corrected mortality of 12 hafter treatment（%）24 h校正死亡率(

18、%) The corrected mortality of 24 h after treatment（%）12 h校正死亡率（%）The corrected mortality of 12 hafter treatment（%）石油醚萃取物Petroleum ether extract13.331.36 ab90.000.00a96.671.36a氯仿萃取物 Trichloromethane extract13.33.000.00ab80.000.00a80.000.00a乙酸乙酯萃取物 Ethl acetate extract0.000.00b0.000.00c3.331.36c水萃取物 W

19、ater extract20.000.00a43.338.92b63.336.80bCK0.000.00b0.000.00c0.000.00c1) 校正死亡率是三次重复的平均值SE，同列数字后随相同字母表示在0.05水平上差异不显著（DMRT）1) The corrected mortality is average of three replications SE; Those within a column followed by the same letter arent significantly different at 5% level (DMRT).2.2 岩木瓜活性成分的分离2

20、.2.1岩木瓜石油醚层活性成分的分离2.2.1.1 岩木瓜石油醚层各馏分对家蝇的生物活性采用正相硅胶柱层析对石油醚萃取物（435.0g）中杀虫活性成分进行分离（硅胶为100200目：柱规格为85mm1200mm，用石油醚装柱，以石油醚:丙酮（98:2），（95: 5），（90:10），（85:15），（80:20），（70:30），（60:40），（50:50），（40:60），（30:70）进行梯度洗脱，最后用甲醇冲柱）得到225个馏分，通过TLC分析将12，34，56，7，910，1116，1720，21，2223，2429，3040，4149，5063，6479，8094，95106，1

21、07118，119132，133144，145154，155163，164179，180205，206225馏分分别进行合并。各馏分对家蝇成虫生物活性结果如表2所示。由表可见岩木瓜石油醚层各馏分处理家蝇12h 以后有两个馏分段对家蝇的校正死亡率在70%以上，为F34及F1116馏分，其校正死亡率分别为74.07%及85.89%；各馏分段处理家蝇24h后，有4个馏分段对家蝇的校正死亡率在70%以上，分别为F34、F56、F1116及F206225号馏分，其校正死亡率分别达到87.50%、70.83%、100.00%及79.17%，因此，岩木瓜石油醚萃取物的活性成分主要集中在F34、F56、F11

22、16及F206225号馏分。表2 岩木瓜甲醇提取物石油醚层各馏分对家蝇的杀虫活性（500g/g 糖）Table 2 Insecticidal activity of different fractions from Petroleum ether of F. tsiangii against M. domestica（500g/g sugar） （四川雅安，2008.11）馏分Fractions质量（g）Weight(g)12 h的校正死亡率（%）The corrected mortality of 12 h after treatment（%）24 h的校正死亡率(%) The correc

23、ted mortality of 24 h after treatment (%)F1232.833.331.31cd1)66.671.70cF3415.674.071.51b87.500.00abF5618.144.441.31c70.830.85bcF715.43.700.76gh8.331.70fghF91010.23.700.76gh16.673.40efghF11167.685.891.47a100.000.00aF17203.200.000.00h0.000.00hF2135.80.000.00 h0.000.00hF222312.43.700.76gh12.501.47fgh续表

24、2馏分Fractions 质量（g）Weight(g)12 h的校正死亡率（%）The corrected mortality of 12 h after treatment（%）24 h的校正死亡率(%) The corrected mortality of 24 h after treatment (%)F242916.70.001.47h0.000.00hF304028.522.220.00def20.830.85defgF414913.50.000.00h8.331.70fghF506324.30.000.76h0.000.00hF64798.50.000.00h29.170.85de

25、F951066.50.000.00h4.170.85ghF10711810.73.700.76gh37.501.47dF11913210.218.520.76ef25.000.00defF80947.33.700.00gh36.591.47dF1331445.43.700.76gh33.330.85deF1451546.114.810.76fg20.830.85efgF15516310.311.111.31fgh38.501.47dF1641795.23.700.76hg4.170.85ghF18020515.40.000.00h0.000.00hF20622535.829.630.76de7

26、9.170.85bcCK0.000.00h0.000.00h1) 校正死亡率是三次重复的平均值SE，同列数字后随字母表示在0.05水平上差异不显著（DMRT）1) The corrected mortality is average of three replicationsSE; Those data within a column followed by the same letter arent significantly different at 5% level (DMRT).2.2.1.2 岩木瓜石油醚层活性成分的分离F34馏分活性成分的分离。该馏分段含有油酯较多，将其用石油醚反复

27、洗脱，得到白色粉末（50mg），然后用丙酮溶解，多次重结晶后得到白色单一化合物，经1H-NMR,13C-NMR波谱数据确定为化合物YMG-1。F56馏分活性成分的分离。将该馏分段用石油醚反复洗脱除去油脂状物质，再用丙酮溶解，重结晶得到白色粉末状物质（310mg），再采用正相硅胶柱层析（硅胶：200-300目，柱规格为20mm500mm，以石油醚:丙酮（90:10）装柱，以（85:15），（80:20），（75:25），（70:30），（60:40）进行梯度洗脱）得到5个馏分。经TLC确定，第35馏分为单点，荧光不显色，碘显色，10%硫酸显浅紫色。经1H-NMR,13C-NMR波谱数据确定为化合

28、物YMG-2。2.2.2 岩木瓜氯仿层活性成分的分离2.2.2.1 岩木瓜氯仿层各馏分对家蝇的生物活性采用正相硅胶柱层析对氯仿萃取物（35.5g）分离（硅胶：100-200目，柱规格为45mm900mm，以氯仿装柱，经氯仿:甲醇（98:2），（95: 5），（90:10），（85:15），（80:20），（70:30），（60:40）进行梯度洗脱）得到139个馏分。经TLC确定，将馏分15，620，2135，3647，4863，6469，100105，106109，110-139分别合并。各合并馏分段对家蝇的生物测定结果如表3。结果表明，各馏分处理家蝇12h 以后各馏分对家蝇的校正死亡率都低于

29、50%，最高的是F2135，其校正死亡率为50%。各馏分处理家蝇24h ，F620 、F2135 及F106109 三个馏分段对家蝇的校正死亡率均超过85%，说明岩木瓜氯仿层的活性成分主要集中在该三馏分段。表3 岩木瓜甲醇提取物氯仿层各馏分对家蝇的杀虫活性（500g/g 糖）Table 3 Insecticidal activity of different fractions from Trichloromethane of F. tsiangii against M. domestica（500g/g sugar） （四川雅安，2008.11）Fractions质量(g)Weight(g)

30、12 h的校正死亡率（%）The corrected mortality of 12 h after treatment（%）24 h的校正死亡率(%) The corrected mortality of 24 h after treatment (%)F153.25.000.00c1)63.331.85 bF6201.540.000.00ab84.072.14 aF21352.150.000.00a87.781.85 aF36471.80.000.00d48.151.07 cF48632.20.000.00d51.852.83 bcF64692.40.000.00d51.851.07 bcF1001054.20.000.00d59.262.83 abF1061091.520.000.00ab86.671.85 aF110-1393.70.000.00d59.262.14bcCK0.000.00d0.000.00d1) 校正死亡率是三次重复的平均值SE，同列数字后随字母表示在0.05水平