转铁蛋白标记磁性脂质体的制备及体外成像汇总.docx

1、转铁蛋白标记磁性脂质体的制备及体外成像汇总中国组织工程研究 第21卷 第6期 20170228出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 28, 2017 Vol.21, No.6 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH923 www.CRTER .org研究原著陈维翠，女，1986年生，广西壮族自治区贺州市人，汉族，硕士，主要从事影像诊断、分子影像学相关研究。通讯作者：刘岘，博士，硕士生导师，副主任医师，广州中医药大学第二附属医院影像科，广东省广州市 510120中图分类号:R

2、318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (201706-00923-05 稿件接受：2016-12-13Chen Wei-cui, Master, Department of Radiology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Liu Xian, M.D., Masters supervisor, Associate chief p

3、hysician, Department of Radiology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China转铁蛋白标记磁性脂质体的制备及体外成像陈维翠1，刘淑仪1，林爱华2，刘 岘1 (广州中医药大学第二附属医院，1影像科，2药学部，广东省广州市 510120 引用本文：陈维翠，刘淑仪，林爱华，刘岘. 转铁蛋白标记磁性脂质体的制备及体外成像J.中国组织工程研究，2017，21(6:923-927

4、.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.018 ORCID: 0000-0002-1814-8295(陈维翠文章快速阅读：文题释义：转铁蛋白受体：为跨膜糖蛋白，介导细胞内铁的摄取、参与细胞生长调节，且能在肿瘤细胞表面高度表达，是一种有效的肿瘤标志物，广泛应用于各类恶性肿瘤的靶向治疗。磁性纳米粒子：以磁性材料为中心，包被生物高分子的核壳结构。磁性纳米粒具有良好的磁导向性和生物组织相容性，可与多种功能分子结合，如蛋白质、核酸、生物素等。摘要背景：利用转铁蛋白受体表达的特异性和转铁蛋白-转铁蛋白受体结合的亲和性，转铁蛋白修饰药物载体可以明显提高药物的特异结合能力和

5、疗效。转铁蛋白也可修饰影像对比剂，针对肿瘤组织的转铁蛋白受体，实现肿瘤的特异性靶向成像。目的：评价转铁蛋白-磁性纳米粒的理化特性，并对其细胞结合特性进行体外实验研究。方法：采用旋转蒸发法制备磁性脂质体，共价结合法制备转铁蛋白-磁性纳米粒。对转铁蛋白-磁性纳米粒的粒径、电位、形态、转铁蛋白结合效率、r2弛豫率、细胞结合特性及细胞毒性等指标进行分析评价。转铁蛋白-磁性纳米粒与转铁蛋白受体高表达HepG2肝癌细胞特异性结合后进行体外MR 成像。结果与结论：转铁蛋白-磁性纳米粒平均粒径为95.1 nm，多分散系数为0.21，Zeta 电位为-1.25 mV，r2弛豫率为94.62 mmol -1s -

6、1，每个磁性脂质体约结合27个转铁蛋白分子；荧光共聚焦电镜显示转铁蛋白-磁性纳米粒与转铁蛋白受体高表达HepG2肝癌细胞发生特异结合，荧光胞浆出现罗丹明红染；普鲁士蓝铁染色显示HepG2细胞内和细胞表面有铁染色颗粒；体外细胞MR T2WI成像显示，转铁蛋白-磁性纳米粒与HepG2细胞标记后，离心管信号强度下降；而空白磁性纳米粒与细胞不发生结合，故无明显信号强度下降；细胞毒性实验显示细胞生长曲线良好；以上结果表明，转铁蛋白-磁性纳米粒满足MR 分子探针的所需要求，可用于MR 分子成像。 关键词：生物材料；纳米材料；磁性脂质体；转铁蛋白受体；纳米粒子；磁共振成像；国家自然科学基金 主题词：脂质体；

7、受体，转铁蛋白；纳米粒；磁共振成像；组织工程 基金资助：广东省科技计划项目(2013B021800247；国家自然科学基金青年项目(30700184Transferrin-labeled magnetolipsomes: preparation and magnetic resonance imaging in vitroChen Wei-cui1, Liu Shu-yi1, Lin Ai-hua2, Liu Xian1 (1Department of Radiology, 2Department of Pharmacy, the Second Affiliated Hospital of G

8、uangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, ChinaAbstractBACKGROUND: Transferrin (Tf is one suitable ligand to be conjugated to drug delivery systems to achievesite-specific targeting and desired therapeutic effect, due to its specific binding to transferrin recept

9、ors (TfR, and high 陈维翠，等. 转铁蛋白标记磁性脂质体的制备及体外成像 P .O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org924www. CRTER .orgexpression on the surface of tumor cells. Contrast agents are also modified with Tf to achieve specific tumor imaging. OBJECTIVE: To prepare Tf-labeled magnetoliposomes (MLs, and characteriz

10、e their utility as TfR targeted MR specific contrast agent in vitro.METHODS: MLs and Tf-MLs were prepared by lipid film hydration method and covalent coupling method, respectively. Tf-MLs were characterized by their mean size, zeta potential, polyindex, r2 relaxivity, Tf-bindingefficacy and cytotoxi

11、city. In vitro MRI contrasting properties of the suspended nanoparticles incubated with HepG2 cells were determined.RESULTS AND CONCLUSION: The mean diameter, polydisperisity index, zeta potential and r2 relexivity of Tf-ML were 95.1 nm, 0.21, -1.25 mv and 94.62 mmol-1/s, respectively. The coupling

12、efficiency was calculated and the values obtained were 59.4 g Tf/mol phospholipid corresponding to about 27 molecules of Tf-MLs. After a 2-hour incubation withrhodamine-labeled Tf-MLs, rhodamine fluorescence was detected intensively in the plasma membrane and the cytoplasm of the TfR-overexpressing

13、HepG2 cells. In contrast, Tf-ML showed little binding in MCF-7 cells that had low TfR level. HepG2 cells incubated with Tf-ML showed much higher intracellualar iron density than incubated with non-targeted MLs. In vitro MR T2WI of cells demonstrated the centrifuge tube containing HepG2 cells incubat

14、ed with Tf-MLs produced a lower visible signal intensity than that treated with non-targeted MLs. Tf-MLs showed their potentials such as high r2 relaxivity, specific binding ability characteristics. These results suggest the availability of Tf-MLs to serve as a targeted contrast agent. Subject headi

15、ngs: Liposomes; Receptors, Transferrin; Nanoparticles; Magnetic Resonance Imaging; Tissue EngineeringFunding: the Science and Technology Program of Guangdong Province, No. 2013B021800247; the National Natural Science Foundation of China, No. 30700184Cite this article: Chen WC, Liu SY, Lin AH, Liu X.

16、 Transferrin-labeled magnetolipsomes: preparation and magnetic resonance imaging in vitro. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(6:923-927.0 引言 Introduction利用肿瘤表面的抗原或受体与靶向对比剂的特异性结合，可实现对肿瘤特异性显像的目的。转铁蛋白(transferrin，Tf 为单链糖基化球蛋白，可协助血浆糖蛋白运载铁离子至正常细胞。转铁蛋白受体(transferrin receptor ，TfR 是一种跨膜糖蛋白，与转铁蛋白相互作用介

17、导对铁的吸收1。研究表明，转铁蛋白受体在肿瘤细胞中表达显著增加，而在正常组织表达少，可作为肿瘤抗原标记物和诊断治疗的靶向部位；转铁蛋白受体不易发生脱落凋衰，且增高程度与肿瘤的分期、分级有密切关系；转铁蛋白-转铁蛋白受体结合具有高亲和性，这些特点使其在肿瘤靶向诊断和治疗中越来越受到重视1-2。利用转铁蛋白受体的有效靶向作用，转铁蛋白修饰抗肿瘤药物可明显提高药物的特异结合能力和疗效。而磁性脂质体为药物传递系统中的新型载体，可包裹药物和Fe 3O 4分子，既具有磁流体性能，又具有脂质体组织相容性好的特点3。基于以上，实验设想利用转铁蛋白标记磁性脂质体作为MR 影像示踪剂，针对肿瘤组织的转铁蛋白受体，

18、实现特异性靶向成像的目的。1 材料和方法 Materials and methods1.1 设计 观察学实验。1.2 时间及地点 于2015年12月至2016年4月在广东省中医科学研究院实验室完成。1.3 材料 二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoyl phosphatidylcholine ，DSPC 、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC 购自于德国Lipoid 公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1,2-distearoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy(poly(ethy

19、lene glycol-2000，PEG2000-DSPE、罗丹明-磷脂酰乙醇胺(rhodamine-PE购自美国Avanti Polar Lipids公司；双铁人转铁蛋白H-Tf(Fe2、磁性氧化铁纳米粒子、3-(2-吡啶二巯基 丙酸N -羟基琥珀酰亚胺酯dithiothreitol and 3-(2-pyridylthio propionic acid N-hydroxysuccinimide ester, SPDP、胆固醇(cholesterol, Chol购自美国Sigma 公司。 1.4 实验方法1.4.1 磁性脂质体的制备 5 mg 磁性氧化铁纳米粒子与脂质(DSPCchol PE

20、G2000-DSPE 为630.6摩尔比 混合，溶于氯仿/乙醚混合液(体积比11 ，脂质总量为 120 mol ，在40 条件下旋转蒸干；然后脂质混合物加入2.5 mL 硫酸铵溶液进行水化(pH 7.4 ，并使用探针型声纳仪(Sonics VCX-130-PB, Newtown, CT 进行超声波处理15 min。制备的脂质体使用0.45，0.22，0.10 m多聚碳酸酯滤器分别过滤5次统一粒径。此外，加入0.001 mol rhodamine-PE 用于荧光成像。1.4.2 转铁蛋白受体靶向磁性脂质体的制备 采用共价结合法制备。室温条件下10 mg H-Tf (Fe2与20 mmol/L S

21、PDP在甲醇内孵育30 min ，使用Sephadex G-25凝胶柱， 0.1 mol/L乙酸缓冲液(pH 4.5去除过量的SPDP ；然后加入二硫苏糖醇，在室温下孵育30 min对SPDP 进行还原(终浓度为50 mmol/L。终产物使用Sephadex G-25凝胶柱，MES 缓冲盐溶液进行纯化(25 mmol/L MES，140 mmol/L NaCl ，pH 6.5 。还原后的转铁蛋白加入事先制备的磁性脂质体(转铁蛋白脂质比例为0.21 ，4 条件下孵育过夜。游离的转铁蛋白采用Sepharose CL-4B层析柱去除(HEPES缓冲液 。 1.4.3 转铁蛋白-磁性纳米粒的粒径、电位

22、及形态检测 取纯化体脂质体混悬液，加适量双蒸水稀释后，用Nicomp380粒度仪(Particle Sizing Systems测定其粒径及zeta 电位。按14比例稀释转铁蛋白靶向磁性脂质体，取1滴放在镀膜铜网上，滤纸吸去多余液体，加入2%磷钨酸染色30 s，干燥后透射电镜下观察其形态。 陈维翠，等. 转铁蛋白标记磁性脂质体的制备及体外成像 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH925www. CRTER .org1.4.4 转铁蛋白-磁性纳米粒结合效率检测 采用氨基黑BSA 蛋白分析法4，转铁蛋白结合效率以g/mol方式表示，计算每个脂质体分子所

23、结合转铁蛋白数量。1.4.5 转铁蛋白-磁性纳米粒r2弛豫率测定 将浓度为0.10，0.12，0.14，0.16和0.18 mmol/L的转铁蛋白-磁性纳米粒装入试管内，另取10 mL 纯净水及空白载体作对照。使用GE Signa HDX 3.0T超导型磁共振扫描仪，T2 map序列对各管进行横断成像。扫描参数为TR/TE 2 000 ms/20 ms 、 40 ms、60 ms、80 ms、100 ms、120 ms、140 ms、160 ms，NEX 为4，FOV 为75 mm75 mm，层厚2 mm，层间隔2 mm。将原始数据导入T2mapping 分析软件，计算r2弛豫率。 1.4.6

24、 细胞结合实验 选择肝癌细胞HepG2(转铁蛋白受体高表达 、人乳腺癌细胞MCF-7(转铁蛋白受体低表达 与罗丹明标记的免疫脂质体在37 下孵育2 h ，采用共聚焦荧光显微镜观察细胞悬液。罗丹明-PE 的激发、发射波长分别选择560 nm、590 nm。转铁蛋白-磁性纳米粒、非靶向磁性纳米粒与HepG2细胞反应16 h 后进行普鲁士蓝染色，吸去培养基，PBS 洗涤2次，1 mL体积分数为4%甲醛固定液固定30 min，PBS 洗涤2次，加入1 mL普鲁士蓝染液染色10 min，PBS 洗涤2次，加入伊红溶液染色5 min ；再用PBS 洗涤2次，光学显微镜观察实验结果。1.4.7 细胞毒性试验

25、 采用MTT 法检测。取生长对数期的HepG2、MCF-7细胞，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为1108 L-1。实验前1 d接种到96孔细胞培养板中，每孔加入200 L细胞悬液，在CO 2培养箱内(37 ，体积分数为5%CO2、饱和湿度 培养24 h，弃去上清液，分别加入不同浓度(50，100，200，400，600，800，1 000 mol/L脂质体溶液培养24 h ，每孔加入20 L MTT 溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h，待结晶充分形成后，去除上清液，每孔加入100 L二甲基亚砜溶解液，在37 细胞培养箱内继续孵育，直至在镜下观察二甲基亚砜全部溶解。使用酶标仪在570 nm

26、波长处测定吸光度，计算细胞存活率，通过细胞存活率评价脂质体的细胞毒性。细胞存活率(%=实验组吸光度值/空白对照组吸光度值100%。1.4.8 体外细胞MR 成像 选择转铁蛋白受体高表达HepG2肝癌细胞，在DMEM 培养基内进行培养，待细胞生长程度至80%时，加入胰蛋白酶进行消化处理，然后分别加入转铁蛋白-磁性纳米粒、空白磁性纳米粒孵育3 h ，使用PBS 进行洗脱，并在1 mL的PBS 内进行离心(1 500 r/min， 5 min，去除上清液，剩余的细胞成分移入0.5 mL离心管内进行MR T2WI成像，成像参数为TR/TE 2 500/100 ms，NEX 4，层厚2 mm。1.5 主

27、要观察指标 转铁蛋白-磁性纳米粒的理化特性(粒径、电位、电镜形态、转铁蛋白结合效率、r2弛豫率、细胞毒性等指标 、体外细胞结合情况及MR 成像效果。2 结果 Results2.1 转铁蛋白-磁性纳米粒的理化特性 转铁蛋白-磁性纳米粒平均粒径为95.1 nm，电位为(-1.250.23 mV，多分散系数(PI为0.21(图1 。透射电镜显示转铁蛋白-磁性纳米粒为大小均一、边缘光滑的囊泡状球体，内部为磁性氧化铁核心(图1 。经计算，转铁蛋白偶合效率为59.4 g/mol，相当于每个磁性脂质体结合27个转铁蛋白分子。r2弛豫率为94.62 mmol-1s -1。2.2 细胞毒实验结果 随着转铁蛋白-

28、磁性纳米粒浓度增大，细胞毒性略有增加。HepG2细胞在转铁蛋白-磁性纳米粒浓度为400 mol/L时生长曲线良好，与非靶向细胞MCF-7生长曲线无明显差异；随着标记浓度增加，细胞生长曲线变为低平，提示细胞用400 mol/L以上浓度标记后，其生长增殖受到影响(图2 。2.3 体外细胞结合实验及MR 成像实验 激光共聚焦荧光显微镜显示转铁蛋白-磁性纳米粒在细胞内的分布情况。在转铁蛋白受体高表达的HepG2肝癌细胞内，罗丹明标记的转铁蛋白-磁性纳米粒发生内化，胞浆出现罗丹明红染；而在转铁蛋白受体低表达的MCF-7乳腺癌细胞内，由于不发生特异性结合，不表现内化作用，细胞浆内无明显染色(图3 。普鲁士

29、蓝铁染色显示转铁蛋白-磁性纳米粒与转铁蛋白受体高表达HepG2细胞孵育后，免疫脂质体发生内化，细胞内、细胞表面可见普鲁士蓝铁染色颗粒；非靶向对比剂与HepG2细胞孵育后，不表现内化作用，细胞浆内无明显铁颗粒染色(图4 。体外MR 成像实验表明，转铁蛋白-磁性纳米粒与HepG2细胞标记后，大体可观察到T2WI 离心管信号强度下降；而空白磁性纳米粒与细胞不发生结合，故无明显信号强度下降(图5 。3 讨论 Discussion通过抗体或配体与靶细胞表面的抗原/受体特异性结合，经吞噬、吞饮等多种方式，药物载体可释放出包封的药物或对比剂，实现靶向治疗或成像的目的。转铁蛋白-转铁蛋白受体可做为配体-受体介

30、导的药物传递系统。多个研究表明，利用转铁蛋白摄取旁路，在动物模型和人体肿瘤治疗中有非常好的效果5-11。转铁蛋白与抗癌药物(如阿霉素 偶联，可改善药物的心血管毒性和肿瘤组织的抗药性。转铁蛋白-转铁蛋白受体系统也可用于肿瘤靶向成像。 研究发现，利用转铁蛋白受体介导的受体-配体结合特点，转铁蛋白-氧化铁纳米粒子螯合物分子探针能够特异性进入肝癌等恶性肿瘤细胞，而对细胞内的转铁蛋白受体表达调控无影响，可实现对肝癌的MR 特异性显像12-14。理想的靶向对比剂系统应具有简单快速稳定的连接方式、能在血液循环中保持长时间的空间稳定性和良好的抗原识别能力15-17。实验将转铁蛋白与磁性脂质体相连，制备针对转铁

31、蛋白受体的MR 靶向对比剂，其特点是既利用了转铁蛋白-转铁蛋白受体的高亲和、高特异性的结合特点，又陈维翠，等. 转铁蛋白标记磁性脂质体的制备及体外成像 P .O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org926www.CRTER.org利用了脂质体的良好组织相容性。实验所使用的转铁蛋白为双铁转铁蛋白，生理条件下与转铁蛋白受体的亲和力最大。转铁蛋白与磁性脂质体的连接为共价结合方式。所使用的SPDP 为异型双功能偶联剂，可与细胞表面含氨基的蛋白或者多肽发生酰胺化反应，封闭B 链的结合位点，为抗体蛋白质引入硫氢基团，形成硫化抗体16。转铁蛋白成分与二硫苏糖醇在

32、pH 4.5条件下反应，产生自由硫羟基团，后者再经二硫交换反应与脂质体内的磷脂酰乙醇胺交联，形成蛋白-蛋白偶联。通过这种共价交联技术将转铁蛋白与脂质体连接起来，能在脂质体表面结合大量的转铁蛋白(约27个转铁蛋白/磁性脂质体分子 ，方法简单可靠，且包裹的水溶性内容物丢失少。但需注意的是，磷脂与抗体之间的同型交联易造成分子聚集，可能会影响抗原-抗体、配体-受体的结合。此时，在蛋白质和脂质之间使用空间长臂可解决这一问题。实验中制备的转铁蛋白-磁性纳米粒加入了聚乙二醇，可在脂质体表面形成亲水性空间立体屏障，可延长血浆半衰期并能减小免疫原性，提高其生物利用度17-19。转铁蛋白-磁性纳米粒经受体介导的吞噬作用，实现对肿瘤细胞的靶向作用。转铁蛋白-转铁蛋白受体复合物被内化后，运输到吞噬体内；ATP 依赖性质子泵将H +泵入吞噬体内使pH 降低，促进包封物的释放。体外细胞结合实验表明，转铁蛋白-磁性纳米粒与转铁蛋白受体高表达HepG2肝癌细胞发生特异性结合，经受体介导的吞噬作用进入胞浆