健康食品安全性评价方法.docx

1、健康食品安全性评价方法健康食品安全性評估方法 880802衛署食字第88037803號公告壹、前言為評估健康食品之安全性，依健康食品管理法第三條第二項規定訂定本方法。本方法規定健康食品安全性評估資料及毒性試驗項目及方法。貳、毒性試驗之規範 一、試驗操作規範研發所需進行之非臨床試驗請參考衛生署87年6月29日公告之藥品非臨床試驗優良操作規範進行，並妥善保存所有觀察結果、原始數據及文書紀錄，以確保各項試驗數據之品質及試驗之完整性與可信度。二、安全性評估之分類健康食品之安全評估分為四個類別，主要係針對以往長期食用及製造加工之安全性作考量，故食用目的、方式、製造加工方法、流程、最終產品形式及攝食量等均

2、為分類之考慮因素。各類之安全評估項目如下：第一類：屬下列二種情形之一者，得免再進行毒性測試。（一）產品之原料為傳統食用且以通常加工食品形式供食者。（二）產品具有完整之毒理學安全性學術文獻報告及曾供食用之紀錄，且其原料、組成成分及製造過程與所提具之學術文獻報告完全相符者。第二類：產品之原料為傳統食用而非以通常加工食品形式供食者，應檢具下列項目之毒性測試資料。（一）基因毒性試驗（二）28天餵食毒性試驗第三類：產品之原料非屬傳統食用者，應檢具下列項目之毒性測試資料。（一）基因毒性試驗（二）90天餵食毒性試驗（三）致畸試驗第四類：產品之原料非屬傳統食用且含有致癌物之類似物者，應檢具下列項目之毒性測試資

3、料。（一）基因毒性試驗（二）90天餵食毒性試驗（三）致畸試驗（四）致癌性試驗（五）繁殖試驗三、毒性試驗之方法毒性試驗之方法包括下列六項：（一）基因毒性試驗（三）90天餵食毒性試驗（五）致癌性試驗 （二）28天餵食毒性試驗（四）致畸試驗（六）繁殖試驗 （一）基因毒性試驗(Genotoxicity study)基因毒性試驗可分為體內(in vivo)與體外(in vitro)測試，其目的為偵測試驗物質直接或間接引發的基因傷害及程度。一般基因毒性試驗有助於預測試驗物質的致癌性，且有助於致癌性試驗的結果分析。 試驗物質須進行三種以上的基因毒性測試，包括： 微生物基因突變分析，體外哺乳類細胞基因毒性分析

4、，及動物體內基因毒性分析。依試驗物質的性質可增加其他的基因毒性測試(說明1)。 、微生物基因突變分析一般使用細菌基因突變測試法 (gene mutation in bacteria)。(1) 菌株需使用下列5種菌株： 1. S. typhimurium TA98 2. S. typhimurium TA100 3. S. typhimurium TA1535 4. S. typhimurium TA1537、TA97、或TA97a 5. S. typhimurium TA102、E. coli WP2 uvr A、或E. coli WP2 uvr A (pKM101) 註：4 與 5 所列之三

5、種菌株，分別擇一使用。(2) 劑量範圍進行五個以上劑量組，最高劑量須足以產生明顯的毒性。 毒性之產生可由初步試驗中逆突變的菌落 (revertants)數量的減少測得。若試驗物質為高溶解度低毒性物質，最高劑量為5 mg/plate，若試驗物質具有明顯的抗菌活性，則以產生抗菌活性的劑量作為最高劑量。若試驗物質為低溶解度物質，則以產生最少沈澱物的濃度作為測試的最高濃度，但不超過5 mg/plate。(3)對照組對照組包含陰性對照組及陽性對照組(說明2)。(4)代謝活化 (Metabolic activation)進行含有及不含有S9混合物的測試(說明3)。(5)測試方法 1. 前置培養法 (Pre

6、incubation method)， 或 2. 平板混合試驗法 (Plate incorporation method) (6)試驗結果每盤培養皿中突變菌落的數量，須以各測試點之平均值，再以表格方式詳細記錄。 、體外哺乳類細胞基因毒性分析一般使用體外哺乳類細胞的染色體異常分析法 (In vitro Chromosomal aberration test with mammalian cells in culture) 或體外鼷鼠淋巴瘤tk分析法 (In vitro mouse lymphoma tk assay)。（1）體外哺乳類細胞的染色體異常分析法 (Chromosomal aberra

7、tion test with mammalian cells in culture)細胞使用哺乳類細胞株或初代哺乳類細胞。劑量範圍進行三個以上劑量組，劑量間隔可為2倍或自然對數對半(half-log)。 依據初步試驗結果決定最高劑量，以試驗物質會造成50%以上之細胞生長抑制的濃度為最高劑量。若無觀察到細胞毒性，則以5 mg/ml或10 mM (以較低者為準) 作為最高劑量。若試驗物質為低溶解度物質，則以產生最少沈澱物的濃度作為測試的最高濃度，但不超過5 mg/ml或10 mM。對照組對照組包含陰性對照組及陽性對照組 (說明2)。代謝活化進行含有及不含有代謝活化系統的測試，如S9混合物 (說明3

8、)。實驗步驟i. 細胞在試驗物質處理後之適當時機，製備染色體玻片。 由於試驗物質可能會造成細胞週期延長，故須在一個適當間隔製備檢品。ii.每個劑量組製備兩片玻片，每片至少觀察100個分裂中期細胞，檢查染色體結構變異與多套染色體 (polyploid) 的數目。在描述細胞形態異常時，須註明染色體或染色分體的結構變異種類。試驗結果 以表格方式描述染色體變異的種類及數量，並計算含染色體結構變異細胞之頻率。 （）體外鼷鼠淋巴瘤tk分析法細胞使用L5178Y TK+/- 鼷鼠淋巴瘤細胞株。劑量範圍進行三個以上劑量組，劑量間隔可為2倍或自然對數對半。依據初步試驗結果決定最高劑量，以試驗物質會造成80%以上

9、之細胞死亡的濃度為最高劑量。若無觀察到細胞毒性，則以5 mg/ml或10 mM (以較低者為準) 作為最高劑量。若試驗物質為低溶解度物質，則以產生最少沈澱物的濃度作為測試的最高濃度，但不超過5 mg/ml或10 mM。對照組對照組包含陰性對照組及陽性對照組 (說明2)。代謝活化進行含有及不含有S9混合物的測試 (說明3)。實驗步驟i. 細胞在試驗物質處理後之適當時機，清洗去除試驗物質後，細胞繼續培養以測定其存活率，同時使細胞表現因試驗物質引發之致突變表現型 (mutant phenotype)。ii.細胞經過適當的培養時間 (足以表現引發之致突變表型)，細胞分別培養於含及不含嘧啶類似物培養液中

10、，以測定其致突變數量 (numbers of mutants) 及細胞複製之效率 (cloning efficiency)。嘧啶類似物如bromodeoxyuridine (BrdU)、fluorodeoxyuridine (FdU)或 trifluorothymidine (TFT)等。試驗結果以表格方式描述每劑量組之細胞突變及存活之數目，同時計算細胞之存活率、複製效率及細胞致突變之頻率。、動物活體基因毒性分析一般使用囓齒類動物造血細胞的染色體傷害分析法 (In vivo test for chromosomal damage using rodent hematopoietic cells

11、)。(1)動物一般使用雄性鼷鼠。若雄性與雌性動物在代謝或毒性上有明顯的差異時，則須同時使用雄、雌動物進行試驗。若試驗物質為特別針對某種性別時，則應使用該性別動物進行試驗。(2)動物數量每組至少五隻動物。(3)試驗物質給予途徑以腹腔注射或強迫餵食給予。(4)劑量範圍測試三個以上劑量組。若試驗需要，可由短期試驗之單一 (或重覆) 劑量投予試驗物質決定最高容許劑量，最高容許劑量即該劑量可引發骨髓毒性或其他明顯之毒性症狀，如抑制體重增加等，一般以最高容許劑量作為最高劑量。(5)對照組一般以試驗物質使用之溶劑作為陰性對照組，陽性對照組則給予會引發致突變物質。(6)試驗物質給予頻率單一或重覆劑量均可。(7

12、)測試方法囓齒類骨髓細胞染色體異常測試法 (Chromosomal aberrations in bone marrow cells of rodents)囓齒類骨髓細胞之微核測試法 (Micronuclei in bone marrow cells of rodents)囓齒類周邊血液之微核測試法 (Micronuclei in peripheral blood of rodents)(8)實驗步驟囓齒類骨髓細胞之染色體異常測試法i.經試驗物質處理的動物在適當時間犧牲，製備染色體玻片。由於試驗物質可能會造成細胞週期延長，故須在一個適當間隔製備檢品。ii.每個劑量組製備兩片，每片至少觀察100

13、個分裂中期細胞，檢查染色體結構變異與多套染色體的數目。在描述細胞形態異常時，須註明染色體或染色分體的結構變異種類。囓齒類骨髓細胞或周邊血液之微核測試法i. 經試驗物質處理的動物在適當時間犧牲，並製備骨髓或血液抹片。一般動物經試驗物質處理後一段時間 (18到30小時) 即犧牲並收集檢品，或在24到72小時內進行多次採樣製作樣本。若試驗需要，可經由短期預備試驗結果，選擇反應最明顯的時間採樣。ii.每隻動物至少觀察1000個多染性紅血球 (polychromatic erythrocytes)或網狀紅血球 (reticulocytes)，記錄微核發生的數目，同時計算多染性紅血球或網狀紅血球佔全部紅血

14、球的比例。 可採用Giemsa 或Acridine orange 螢光染劑之染色方法。可以觀察網狀紅血球的產生取代多染性紅血球。(9) 試驗結果囓齒類骨髓細胞之染色體異常測試法以表格方式描述染色體變異的細胞總數，或每個細胞變異的頻率。囓齒類骨髓細胞或周邊血液之微核測試法以表格記錄多染性紅血球或網狀紅血球中微核發生的數目，及多染性紅血球或網狀紅血球佔全部紅血球的比例。 說明1. 基因毒性測試方法有：(1) 以基因突變為參考指標的測試方法 1. Gene mutation test with bacteria 2. Gene mutation test with mammalian cells i

15、n culture 3. Test with Drosophila melanogaster 4. Spot test with mice 5. Specific locus test with mice (2) 以染色體變異做為參考指標的測試方法 1. Chromosomal aberration test with mammalian cells in culture 2. Chromosomal aberration test with bone marrow cells of rodents 3. Micronucleus test with rodents 4. Chromosoma

16、l aberration test with genocytes of rodents 5. Dominant lethal test with rodents 6. Reciprocal translocation test with mice (3) 以基因受損為參考指數的測試 1. Phage induction test with bacteria 2. DNA repair test with bacteria 3. Unscheduled DNA synthesis test (UDS) with mammalian cells 4. Sister chromatid exchan

17、ge (SCE) test with mammalian cells (4) 其他測試 1. Mitotic recombination and gene conversion test with yeast 2. Sperm abnormality test 2. 一般以試驗物質使用之溶劑作為陰性對照組，而陽性對照組則依試驗具代謝活化與否之測試，加入適當的致突變劑 (mutagens)。 3. 使用S9混合物 (S9及coenzymes等)。S9製備方法為哺乳類動物 (鼠) 經藥物誘發代謝酵素處理後，自其肝臟萃取並經9000 X g離心而得的肝臟酵素。（二）天餵食毒性試驗(28-day fe

18、eding toxicity study)28天餵食毒性試驗之目的是測試試驗物質經重覆給予28天後對哺乳類動物可能產生之毒性影響，了解毒性變化之產生，同時測定無毒性顯示之劑量(no-observed-adverse-effect level, NOAEL)。、動物品種及性別囓齒類，最常使用的動物為鼠，雄、雌兩性動物的數量須相同，給予試驗物質之週齡為5-6週。、動物數量每個劑量組使用雄、雌至少各10隻動物；若須進行試驗中期解剖或復原測試，動物數量須視解剖的次數適量增加。試驗終結需有足夠數量存活之動物以進行適當之毒性評估。、試驗物質給予途徑一般採用胃管經口餵食(gavage)，必要時得混入飼料或飲

19、水中。 採用胃管經口餵食時之餵食體積應在10 ml/kg動物體重以下，若餵食體積過高，可採多次餵食方式，但須在6小時內完成。、試驗物質給予期間每天固定時間給予試驗物質，連續28天。、劑量範圍為使毒性試驗能夠顯示試驗物質的毒性影響，了解劑量與毒性間的關係，並預估無毒性顯示之劑量(NOAEL)。試驗中至少要有三個劑量組：(1) 高劑量為該劑量足以使試驗動物產生毒性症狀，但不造成死亡；(2) 低劑量為不會引起毒性的劑量；(3) 中間劑量為足以引起最低毒性作用 (如血中酵素值改變或體重成長速度下降)。此外，還要包括載體對照組或空白對照組，若試驗需要可加入參考對照組。劑量選擇之依據應加以說明。若試驗物質

20、混入飼料或飲水中，則濃度不得超過5% (w/w)。當以胃管強迫餵食，若在技術上可給予之最大劑量(但不得超過1000 mg/kg)，而未顯現任何毒性徵兆，則以此劑量做為最高劑量。、觀察與檢驗(1)臨床觀察 1. 每天觀察動物至少二次(兩次時間間隔不得少於六小時)，以確定死亡情形。 2. 每天觀察試驗動物的臨床症狀一次以上，記錄試驗動物顯示的毒性作用，包括作用之開始及過程。 (2)體重與食物消耗量定期測量動物的體重及食物消耗量。 1. 體重：試驗開始給予試驗物質前，測量動物體重；試驗期間每週至少測量一次。 2. 食物消耗量：試驗開始給予試驗物質前，測量食物消耗量；試驗期間每週至少測量一次。食物消耗

21、量之測量可以每隻或每組為單位。 若試驗物質是以混入飼料或飲用水的方式給予，則須以每隻或每組為單位，定期測量飲食或飲水的消耗量，同時測量食物的掉落量，換算成實際的試驗物質消耗量。在試驗開始前及在適當時機進行試驗物質之穩定性與純度的量與質之測量。(3)臨床病理檢驗 1. 血液檢驗 (Hematology) 試驗動物須在試驗結束前採樣以進行血液檢驗，一般而言，全部動物均須進行血液檢驗，但可因實際情形考量，囓齒類動物每個劑量組至少選擇雄、雌各10隻動物進行檢測。血液檢驗項目應包括：hematocrit、hemoglobin、erythrocyte count、total and differentia

22、l leukocyte counts 及凝血因子 (例如clotting time、prothrombin time、activated partial thromboplastin time 或 platelet count) 等之測量。視試驗需要而定。 2. 血清生化檢驗 (Clinical Chemistry) 試驗動物須在試驗結束前採樣以進行血清生化檢驗。一般而言，全部動物均須進行血清生化檢驗，但可因實際情形考量，每個劑量組選擇雄、雌至少各10隻動物進行檢測。血清生化檢驗內容應包括電解質的平衡、醣類的代謝、及肝與腎功能等。血清生化檢測項目包含alkaline phosphatase、a

23、lanine aminotransferase、aspartate aminotransferase、gamma-glutamyl transferase、albumin、bilirubin (total)、creatinine、urea nitrogen 、glucose、phosphorus、calcium、chloride、potassium、sodium、protein (total) 等。 3. 尿液檢驗 (Urinalysis) 視試驗需要進行。每個劑量組選擇雄、雌至少各10隻動物，在試驗物質給予前後進行尿液檢驗一次以上。尿液檢驗項目：顯微鏡觀察尿沈渣，測量尿液之量、酸鹼值與比重，

24、並測量尿液中之protein、glucose、ketones、bilirubin 與 occult blood等的含量。 4. 眼睛檢查 (Ophthalmological examination) 眼睛檢驗包括肉眼檢驗與鏡檢眼睛的外部及內部構造。最高劑量組及對照組的動物在試驗開始給予試驗物質前及試驗結束時進行眼睛檢查一次以上。若發現眼睛異常，則全部動物均須進行眼睛檢查。 (4) 組織病理檢驗 1. 試驗期間死亡的動物須儘快進行解剖，肉眼檢查器官與組織之變化。若許可，主要臟器分別稱重並進行組織病理檢查，以尋求死亡的原因及毒性變化的性質 (如嚴重程度)。 2. 為獲得更充足的毒性資料，垂死的動物

25、均行安樂死。動物在犧牲之前須記錄臨床觀察之結果，若許可，收集血液樣品以進行血液及血清生化分析。動物進行屍體解剖，以肉眼觀察其器官與組織，並進行組織病理檢驗，以了解毒性變化的性質 (嚴重程度)，若試驗需要，記錄主要臟器的重量。 3. 試驗(試驗物質給予期間) 結束，全部存活的動物行安樂死後，在剖檢前先收集血液樣品，以進行血液與血清生化分析。屍體解剖時，肉眼觀察及記錄動物的器官與組織之變化，並測量主要臟器重量。最高劑量組與對照組須進行組織病理檢驗，若最高劑量組中某種器官及/或組織發現病變現象，則全部動物的該器官及/或組織，及其他劑量組中發現任何組織病變，均應進行組織病理檢驗。 4. 一般器官與組織

26、的組織病理檢驗及稱重之項目如下，但可依試驗性質之特性及肉眼檢查發現之異常變化而有所增減： i. 臟器稱重：liver、adrenals、kidneys、gonad等分別稱重。 ii.組織病理檢驗：adrenals、heart、kidneys、liver、spleen、及目標器官。 （三）天餵食毒性試驗 (90-day feeding toxicity study)90天毒性試驗之目的是測試試驗物質經重覆餵食90天後對哺乳類動物可能產生之毒性影響，且提供更長期試驗劑量設定之依據。一般而言，試驗之期間為三個月，在試驗前須先進行一個月的短期重覆劑量毒性試驗。此短期試驗可為長期毒性試驗決定適當的劑量範

27、圍，同時可了解該試驗物質的早期毒性變化，再配合長期毒性試驗的結果，則可了解該試驗物質的毒性影響。、動物品種及性別囓齒類，最常使用的動物為鼠，雄、雌兩性動物的數量須相同，給予試驗物質之週齡為5-6週。、動物數量每個劑量組使用雄、雌至少各10隻動物。若須進行試驗中期解剖或復原測試，動物數量須視解剖的次數適量增加。試驗終結需有足夠數量存活之動物以進行適當之毒性評估。、試驗物質給予途徑一般採用胃管經口餵食(gavage)，必要時得混入飼料或飲水中。 採用胃管經口餵食時之餵食體積應在10 ml/kg動物體重以下，若餵食體積過大，可採多次餵食方式，但須在6小時內完成。、試驗物質給予期間每天固定時間給予試驗

28、物質，連續90天。、劑量範圍參考（二）5. 28天餵食毒性試驗之劑量範圍。、觀察與檢驗(1) 臨床觀察 1. 每天觀察動物至少二次，以確定死亡情形。 2. 每天觀察試驗動物的臨床症狀一次以上，記錄試驗動物顯示的毒性作用，包括作用之開始及過程。若發現腫瘤生長，則記錄每個肉眼可觀察到或觸摸到的腫瘤發現時間、部位、大小、外觀及成長過程。並同時觀察動物行為的改變、自主官能管制失調、及其他神經系統毒性徵象。 (2) 體重與食物消耗量定期測量動物的體重及食物消耗量。 1. 體重：試驗開始給予試驗物質前，測量動物體重；試驗期間每週至少測量一次。 2. 食物消耗量：試驗開始給予試驗物質前，測量食物消耗量；試驗

29、期間每週至少測量一次。食物消耗量之測量可以每隻或每組為單位。 若試驗物質是以混入飼料或飲用水的方式給予，則須以每隻或每組為單位，定期測量飲食或飲水的消耗量，同時測量食物的掉落量，換算成實際的試驗物質消耗量。在試驗開始前及在適當時機進行試驗物質之穩定性與純度的量與質之測量。 (3) 臨床病理檢驗血液檢驗 (Hematology)試驗動物須在試驗結束前採樣以進行血液檢驗，一般而言，全部動物均須進行血液檢驗，但可因實際情形考量，囓齒類動物每個劑量組至少選擇雄、雌各10隻動物進行檢測。血液檢驗項目應包括：hematocrit、hemoglobin、erythrocyte count、total and

30、 differential leukocyte counts 及凝血因子 (例如clotting time、prothrombin time、activated partial thromboplastin time 或 platelet count) 等之測量。視試驗需要而定。血清生化檢驗 (Clinical Chemistry)試驗動物須在試驗結束前採樣以進行以進行血清生化檢驗。 一般而言，全部動物均須進行血清生化檢驗，但可因實際情形考量，每個劑量組選擇雄、雌至少各10隻動物進行檢測。血清生化檢驗內容應包括電解質的平衡、醣類的代謝、及肝與腎功能等。i. 血清生化檢測項目包含血清生化檢測項目

31、包含alkaline phosphatase、alanine aminotransferase、aspartate aminotransferase、gamma-glutamyl transferase、albumin、bilirubin (total)、creatinine、urea nitrogen 、glucose、phosphorus、calcium、chloride、potassium、sodium、protein (total) 等。ii. 若需更深入研究試驗物質之毒性機轉，其他生化分析方法可視試驗物質之特性及試驗需要列入，如acid/base balance、cholinesterases、hormones、lipids、methemoglobin等項目。尿液檢驗 (Urinalysis)視試驗需要進行。每個劑量組選擇雄、雌至少各10隻動物，在試驗物質給予期間進行尿液檢驗一次以上。尿液檢驗項目：顯微鏡觀察尿沈渣，測量尿液之量、酸鹼值與比重，並測量尿液中之protein、glucose、ketones、bilirubin 與 occult blood等的含量。眼睛檢查 (Ophthalmological examination)眼睛檢驗包括肉眼檢驗與鏡檢眼睛的外部及內部構造。最高劑量