烟草及烟草制品抑芽丹农药残留量的测定液相色谱串联质谱.docx

1、烟草及烟草制品抑芽丹农药残留量的测定液相色谱串联质谱烟草及烟草制品 抑芽丹农药残留量的测定液相色谱串联质谱法技术报告目 录1.引言 11.1 项目的提出 11.2 国内外研究现状及发展趋势 22.项目主要研究内容和技术路线 42.1 项目主要研究内容 42.2 项目技术路线 43.实验部分 53.1 方法原理 53.2 试剂与材料 53.3 仪器设备 63.4 试样制备 63.5 操作步骤 63.6 测定 73.6.1 液相色谱条件 73.6.2 质谱条件 74. 结果与讨论 84.1 样品前处理条件的优化 84.2 检测条件的优化 94.2.1 质谱条件的优化 94.2.2 基质效应 104

2、.3 方法学评价 114.3.1 线性范围、检出限及定量限 114.3.2 回收率 114.3.3 共同实验验证重复性和再现性 135.不同方法的数据比对 165.1 LC-MS/MS与HPLC方法的比对 165.2 LC-MS/MS与ISO方法的比对 176. 总结 177.参考文献 18烟草及烟草制品 抑芽丹农药残留量的测定 液相色谱串联质谱法技术报告1.引言1.1 项目的提出抑芽丹，也叫马来酰肼或青鲜素，化学名称为1,2-二氢-3,6-哒嗪二酮，英文名称maleic hydrazide，GB 4839-2009 农药中文通用名称中规定其中文通用名称为抑芽丹1，其结构式如图1所示。抑芽丹纯

3、品为白色结晶，熔点296298，在水中的溶解度为0.2%（25），可溶于二甲基甲酰胺，微溶于乙醇。其钠、钾、铵盐及有机碱盐类易溶于水。性质稳定，对酸，碱性水溶液稳定。图1-1 抑芽丹结构式抑芽丹是一种植物生长调节剂和选择性除草剂，是内吸性药剂，可通过叶面角质层进入植株，降低光合作用、渗透压和蒸发作用，能强烈的抑制芽的生长。用于防止马铃薯块茎、洋葱、大蒜、萝卜等贮藏期间的抽芽，并有抑制作物生长延长开花的作用。在烟草生产中，抑芽丹一般用于烟草的化学摘心，抑制腋芽生长，在国内外应用比较广泛。在20世纪50年代时，抑芽丹即在烟草中广泛施用，登记允许使用抑芽丹的国家包括美国、阿根廷、巴西、中国、多米尼加

4、共和国、欧洲、马来西亚和南非2。其中，在美国的使用最为普遍，据美国环保署（US EPA）的统计，美国每年使用的抑芽丹有约88%使用于烟草生产中。US EPA将抑芽丹归为人类非致癌性物质（Group E），国际癌症研究机构（IARC）将其归为Group 3类致癌物，即其对人类的致癌性尚未得到官方证实3。在国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）制定的指导性残留限量（GRLs）和中国烟草总公司企业标准YQ 502014 烟叶农药最大残留限量中，对抑芽丹在烟草中的最大残留限量均定为80 mg/kg。一般农药在作物上，常以游离态存在，以有机溶剂即可实现有效萃取，而抑芽丹被喷施于作物后，其中一部分与作

5、物体内的单糖结合生成-D-葡萄糖苷，另一部分仍然呈游离态，所以，抑芽丹不能与其他农药同时检测，必须以单独方法进行检测。烟草中抑芽丹检测的国际方法为ISO 4876-1980Tobacco and tobacco products-Determination of Maleic Hydrazide Residues4，被转化为我国的国标方法GB/T 19611-20045。30多年来，该方法一直被国内外相关检测机构所使用，但是该方法操作繁琐、涉及的试剂种类繁多、消耗量大，且浓碱、高温提取的前处理条件对玻璃仪器的腐蚀性大。我国烟草行业现行的检测标准方法为YC/T 405.5-2011烟草及烟草制品

6、 多种农药残留量的测定 第5部分：马来酰肼残留量的测定 高效液相色谱法6，与ISO方法相比，该方法简化了样品前处理，但以高效液相色谱法（配紫外检测器）检测时可能会存在干扰，影响抑芽丹目标物的准确定性及定量。基于以上背景，本项目组提出了以灵敏度更高和抗干扰能力更好的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）代替液相色谱法（HPLC），对原YC/T 405.5-2011方法进行修订，以提高检测结果的可靠性，实现对烟草中抑芽丹残留量的准确定性和定量检测。1.2 国内外研究现状及发展趋势目前国内外抑芽丹的检测方法主要包括液相色谱法7-11、电化学法12,13、毛细管电泳法14、紫外分光光度法15、免疫分析

7、法16等，样品基质类型主要涉及土豆、洋葱、大蒜及食品等。由于样品基质类型不同，由基质带来的干扰情况也会有很大的不同。根据烟草及烟草制品的特点，对于烟草中抑芽丹残留量的针对性检测方法主要包括蒸馏-分光光度法4,5、气相色谱法17-19、高效液相色谱法20、液相色谱串联质谱法21,22等。GB/T 19611-2004采用的是蒸馏-分光光度法，此方法由ISO 4876:1980方法转化而来，其原理是将样品在50%的氢氧化钠溶液中煮沸除去挥发性碱性化合物，加入锌粒，由新生态氢将抑芽丹还原成丁二酸酰肼，并随后水解，蒸馏释放出联氨，分光光度法测定其与4-二甲基氨基苯甲醛形成的黄色化合物。几十年来，该方法

8、一直在使用，但操作繁琐，涉及的试剂种类繁多、消耗量大，且浓碱、高温提取的前处理条件对玻璃仪器的腐蚀性大，对操作人员的要求也较高。关于烟草中抑芽丹的气相色谱检测法的报道均采用衍生化法，通过抑芽丹与4-氯氯苄17、N,O-双（三甲基硅基）乙酰胺18、硫酸二甲酯19等衍生化试剂反应，最终以配备电子捕获检测器（ECD）、氢火焰离子检测器（FID）、或氮磷检测器（NPD）的气相色谱仪进行定性定量分析检测。在这些方法中，衍生化效率是影响测定准确性和稳定性的主要因素，因此对操作条件要求较为严格。YC/T 405.5-2011是以盐酸为提取液，加热回流萃取烟叶中的抑芽丹，经C18固相萃取小柱净化后以液相色谱进

9、行分析，以UV检测器进行检测。该方法对抑芽丹的提取效率高，但因烟草基质较为复杂，HPLC的抗干扰能力较差，故方法的检测限较高，对低含量样品有时存在定性定量不够准确的情况。随着检测仪器的发展，串联质谱（MS/MS）技术的应用愈发广泛，在提高检测灵敏度、选择性，以及简化样品前处理方面有着重要优势，其优势有：1MS/MS综合使用了保留时间、母离子、子离子和实验参数的条件，为目标物的鉴定提供了高水平的选择性；2MS/MS在对离子检测前就排除了样品基质中的干扰组分，因而即使对基体复杂的样品也可以达到较高的灵敏度。LC-MS/MS具有比HPLC更高的灵敏度和选择性，对于复杂烟草基质的抗干扰能力大大提高，可

10、增强检测结果的可靠性，也可使样品前处理过程简化，实现对烟草抑芽丹残留量的定性和定量准确检测。内标法是色谱分析中一种比较准确的定量方法，在样品处理前期加入内标可有效地校正样品萃取过程以及在质谱离子源中离子化等过程中目标物的损失。同位素内标与目标化合物性质相近，因此能很好地反应样品前处理以及检测中目标物的损失，故同位素内标也是内标法中最常使用的内标。其中，因其易得、成本低的优势，氘代同位素内标是使用最为广泛的同位素内标。廖雅桦21等人用乙酸乙酯和环己烷的混合溶剂超声提取烟草中的包括抑芽丹在内的3种抑芽剂残留，以氘代氧乐果为内标，通过凝胶渗透色谱净化，以LC-MS/MS检测。Wang L.J.22和

11、陈晓水23等人以盐酸溶液提取烟草样品，以氘代-抑芽丹为内标，以LC-MS/MS检测。前者采用微波辅助萃取，后者采用加热回流提取，但都未进一步净化提取液，造成上机溶液较脏，从而使LC-MS/MS仪器的维护频率增加。本项目拟研究建立和完善LC-MS/MS检测烟草中抑芽丹农药残留量的方法，简化样品前处理过程，改善以HPLC检测时定性定量不够准确的问题。基于以上背景，提出以灵敏度更高和抗干扰能力更好的LC-MS/MS法代替HPLC法，对原YC/T 405.5-2011方法进行修订，以提高检测结果的可靠性。2.项目主要研究内容和技术路线2.1 项目主要研究内容1. 国内外相关资料的搜集、整理。2. 根据

12、烟草及烟草制品的特点，研究开发烟草及烟草制品 抑芽丹农药残留量的测定 液相色谱串联质谱法检测方法。主要是考察以液相色谱-串联质谱联用仪（LC-MS/MS）作为检测仪器的各种检测参数，提高方法的定性能力和检测灵敏度，以氘代抑芽丹为内标进行内标法定量，降低检测干扰，提高检测数据的重复性；同时，对样品前处理过程进行考察，在保证目标物提取效率的同时，简化操作，提高批量处理样品的能力。3. 完成技术报告。2.2 项目技术路线在前期研究工作的基础上，确立的项目技术路线如图2-1所示：资料调研与整理样品收集LC-MS/MS检测条件的建立样品前处理条件的建立方法评价：检测限、回收率和重复性等指标的确定比对实验

13、完成标准文稿、编制说明及技术报告图2-1 项目的技术路线图3.实验部分YC/T 405.5-2011对抑芽丹的检测基于HPLC方法，以外标法定量。此次修订以LC-MS/MS方法替代原HPCL方法，有效地提高检测的灵敏度以及抗干扰能力，并在样品前处理开始时加入氘代抑芽丹的稳定同位素内标，以内标法定量，提高定量的准确性，并在一定程度上简化了样品前处理操作步骤。3.1 方法原理将烟末样品使用盐酸水溶液加热回流提取抑芽丹农药残留，冷却后的提取液经过滤或离心后，以固相萃取小柱净化，用液相色谱串联质谱仪进行检测，内标法定量。3.2 试剂与材料所有试剂应适用于农药残留量分析。水应为蒸馏水或同等纯度的水，至少

14、应达到GB/T 6682三级水的水平。所有溶剂应依照与样品测定（萃取和液相色谱串联质谱测定）相同的程序做空白实验以检查其纯度，溶剂色谱图的基线上应没有明显会影响抑芽丹测定的峰出现。抑芽丹（纯度99%，德国Dr. Ehrenstorfer公司），氘代抑芽丹（纯度97%，德国Dr. Ehrenstorfer公司），乙腈、甲醇（色谱纯，美国J.T.Baker公司），冰醋酸（纯度99%，美国Fisher Chemical公司），发烟盐酸（质量百分比37%，韩国Duksan Pure Chemicals公司）盐酸提取液：将发烟盐酸（37%，质量百分比）与蒸馏水按1:2（体积比）比例稀释，即得约4 mol

15、/L的盐酸提取液。固相萃取小柱为SupelcleanTM LC-18 SPE净化柱（500 mg, 3 mL）。抑芽丹标准储备液：准确称取0.01 g（精确至0.1 mg）抑芽丹标准品至100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，配制成浓度为100 g/mL的抑芽丹标准储备液。氘代抑芽丹内标储备液：准确称取0.01 g（精确至0.1 mg）氘代抑芽丹标准品至50 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，配制成浓度为200 g/mL的氘代抑芽丹内标储备液。标准工作溶液：分别移取50 L、125 L、250 L、500 L、1.25 mL、2.5 mL、5 mL 100 g/mL的抑芽丹标准储备液于100 m

16、L容量瓶中，各加入250 L 200 g/mL抑芽丹氘代内标储备液，用蒸馏水稀释定容，配制成浓度为0.05 g/mL、0.125 g/mL、0.25 g/mL、0.5 g/mL、1.25 g/mL、2.5 g/mL、5 g/mL的系列标准工作溶液，氘代抑芽丹内标的浓度为0.5 g/mL。相应的系列标准工作溶液中抑芽丹含量为5 g、12.5 g、25 g、50 g、125 g、250 g、500 g，氘代抑芽丹含量为50 g。3.3 仪器设备分析天平，感量0.1 mg;容量瓶（50 mL、100 mL）、量筒、球形冷凝管、磨口圆底/平底烧瓶（250 mL）玻璃仪器；恒温电加热套（功率230 W，

17、 河南豫华仪器有限公司）或恒温油浴锅（JY-6A，金坛市天竟实验仪器厂）；Sigma 3-30K高速离心机（德国Sigma Laborzentrifugen公司），配备适用于50 mL离心管的离心机转子；固相萃取装置；AB SCIEX TRIPLE QUADTM 5500液相色谱-串联质谱仪（美国AB SCIEX公司），配备电喷雾离子源（ESI）3.4 试样制备按YC/T 31 制备样品，测定样品水分含量。3.5 操作步骤称取5 g试样，精确至0.01g，于圆底烧瓶中。加入50 mL 4 mol/L的盐酸提取液，加入250 L 200 g/mL氘代抑芽丹内标溶液，适当振摇或超声，使烟末分散与盐

18、酸溶液混合均匀。将烧瓶放置于加热套或者油浴锅中，装上球形冷凝管，加热回流。控制回流速度，使蒸汽升至球形冷凝管第二球处，回流稳定后开始计时，回流1小时。回流结束后，关闭加热套或油浴锅电源，冷却至室温后，将提取液摇匀后倒入50 mL离心管中，10000 rpm离心10 min。分别以2 mL甲醇和2 mL超纯水活化SupelcleanTM LC-18 SPE净化小柱，取2 mL 上述离心所得的提取液，加到固相萃取小柱中，即刻开始收集流出液，并用2 mL蒸馏水洗脱，合并流出液及洗脱液，用0.45 m水相滤膜过滤，待LC-MSMS分析。样品前处理过程的示意图如图3-1所示：图3-1. 样品前处理过程示

19、意图3.6 测定3.6.1 液相色谱条件色谱柱：Hypercarb Porous Graphitic Carbon液相色谱柱，柱长100 mm，内径4.6 mm，粒径5.0 m；柱温30；进样量10 L。流动相及流速参见表3-1。表3-1. 流动相梯度时间（min）流速（L/min）1% HAc水（%）1% HAc乙腈（%）03001000830085151530085151630010902030010902130010003630010003.6.2 质谱条件扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测模式（MRM）；电喷雾电压：5500 V；气帘气压力：30 psi；辅助加热气压力：60

20、psi；碰撞气压力：6 psi；离子化温度：500；抑芽丹及氘代抑芽丹的定量离子对、定性离子对、去簇电压及碰撞能量如表3-2所示：表3-2. 化合物质谱参数化合物名称离子对去簇电压(V)碰撞能量(V)驻留时间(ms)抑芽丹113/85(定量)1102750113/67(定性)1102450氘代抑芽丹115/87(定量)1102750115/69(定性)11024504. 结果与讨论4.1 样品前处理条件的优化YC/T 405.5-2011中样品的提取是将5 g试样置于250 mL烧瓶中，加入50 mL的4 mol/L的盐酸提取液，于加热套中加热回流1 h，回流完毕放至室温后用定性滤纸过滤试样，

21、将滤液收集到100 mL容量瓶中，用适量4 mol/L的盐酸提取液淋洗冷凝管和萃取过的试样，洗液均经过滤合并至容量瓶中，以盐酸提取液定容至刻度。分别以2 mL甲醇和2 mL的0.1 mol/L的氢氧化钠溶液依次淋洗C18固相萃取小柱，从100 mL容量瓶中准确移取2 mL上述提取液加到预处理过的C18固相萃取小柱上，即刻开始收集流出组分到5 mL容量瓶中，用2 mL的0.1 mol/L的氢氧化钠溶液洗脱，合并洗脱液至该5 mL容量瓶中，并用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液定容至刻度，经0.45 m水相滤膜过滤后得待测试样萃取液，待高效液相色谱分析。该前处理采用盐酸溶液加热回流提取，是经以往研究

22、验证过的较为有效的提取方式19, 21-22，能够有效地提取烟草中游离态和结合态的抑芽丹残留。故此，本项目延续使用了YC/T 405.5-2011中以4 mol/L的盐酸加热回流提取的前处理方法。但由于YC/T 405.5-2011需使用HPLC进行分离检测，外标法定量，故前处理中有较多的定容步骤，而本项目以氘代抑芽丹作内标，采用LC-MS/MS进行分离检测，内标法定量，可省去原YC/T 405.5-2011方法前处理中的定容步骤。此外，原YC/T 405.5-2011的净化步骤中，以0.1 mol/L的氢氧化钠溶液洗脱，因提取液为4 mol/L的盐酸溶液，0.1 mol/L的氢氧化钠溶液仅能

23、中和极其少量的盐酸，以0.1 mol/L的氢氧化钠溶液洗脱的必要性不大。若以更大浓度的故本项目中氢氧化钠溶液中和提取液中的盐酸，则会产生高浓度的NaCl，对LC-MS/MS检测是不利的。故最终本项目直接采用蒸馏水作洗脱液。本项目最终确立的前处理过程如下：称取5 g试样，精确至0.01g，于圆底烧瓶中。加入50 mL 4 mol/L的盐酸提取液，加入250 L 200 g/mL氘代抑芽丹内标溶液，适当振摇或超声，使烟末分散与盐酸溶液混合均匀。将烧瓶放置于加热套或者油浴锅中，装上球形冷凝管，加热回流。控制回流速度，使蒸汽升至球形冷凝管第二球处，回流稳定后开始计时，回流1小时。回流结束后，关闭加热套

24、或油浴锅电源，冷却至室温后，将提取液摇匀后倒入50 mL离心管中，10000 rpm离心10 min。分别以2 mL甲醇和2 mL蒸馏水活化SupelcleanTM LC-18 SPE净化小柱，取2 mL 上述离心所得的提取液，加到固相萃取小柱中，即刻开始收集流出液，并用2 mL蒸馏水洗脱，合并流出液及洗脱液，用0.45 m水相滤膜过滤，待LC-MSMS分析。4.2 检测条件的优化4.2.1 质谱条件的优化在LC-MS/MS分析中，对每一种目标物需要优化的质谱参数主要有母离子、子离子和碰撞能量。首先，以适宜的质量浓度（5-10 g/mL）在m/z 30-600之间进行全扫描分析（Full Sc

25、an），确定目标物的保留时间和一级质谱图。并从一级质谱图中选择适当的离子作为母离子，母离子的选择主要考虑两方面因素：高选择性和高灵敏度，高选择性即尽量选择质荷比较大的离子；高灵敏度即尽量选择丰度较大的离子。综合考虑，选择适宜的离子初步定为母离子。其次，对选定的母离子用子离子扫描的方式，确定二级质谱图，从中选择适宜的离子作为子离子，基本原则同母离子。对每一组母离子/子离子，分别选择碰撞能量为5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 eV进行扫描优化，以响应信号大小为选择依据；再在此优化的碰撞能量附近进行微调，做二次优化，得到最优的碰撞能量。经优化得到的抑芽丹及氘代抑芽丹的质谱检

26、测参数如表3-2所示。在最优的分离检测条件下，得到的标准工作溶液的提取离子色谱图如图4-1所示：图4-1. 标准工作溶液的提取离子色谱图（A）抑芽丹定量离子（113/85）提取色谱图；（B）氘代抑芽丹定量离子（115/87）提取色谱图4.2.2 基质效应在LC-MS/MS检测中，基质效应通常由提取液中共提取的干扰物质对目标物的离子化效率产生的抑制或增强效应，从而对准确定量带来干扰。将系列标准工作溶液分别以蒸馏水和空白基质进行1:1稀释，稀释后以LC-MS/MS对两套系列标准工作溶液进行分析测定，从而考查该方法的基质效应。其中，空白基质是将抑芽丹空白烟末样品经同样的提取和固相萃取净化后得到的。以

27、水稀释得到的系列标准工作溶液的线性回归方程为Y = 0.0339X + 0.0611，以空白基质稀释得到的系列标准工作溶液的线性回归方程为Y = 0.0348X + 0.0485。由式（4-1）计算基质效应（Matrix effect, ME）。 式（4-1）其中，km是以空白基质稀释得到的系列标准工作溶液线性方程的斜率，ks是以蒸馏水稀释得到的系列标准工作溶液线性方程的斜率。经式（4-1）计算得到该方法的基质效应为2.6%，即极弱的基质增强效应。因其在20%范围内，据Kmellr等人24的报道，可认为此方法的基质效应可忽略不计，无需进行基质匹配标准工作溶液的配制。这可能是本方法采用稳定同位素

28、标记物氘代抑芽丹作为内标，以内标法定量，对操作条件、检测条件稍微的波动起到了很好的校正作用。4.3 方法学评价从线性范围、检出限、定量限、回收率、重复性和再现性这几个方面对方法进行了综合评估。4.3.1 线性范围、检出限及定量限对标准工作溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物抑芽丹与内标氘代抑芽丹的色谱峰面积比（Y）对其相应浓度（X）进行线性回归分析，即得到标准工作曲线及其线性回归方程和相关系数。以最低浓度标准工作溶液中目标物的3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限，结果如下表4-1所示：表4-1. 方法的验证结果化合物名称线性范围（g/mL）线性方程相关系数R2检出限（mg/kg）定量限（

29、mg/kg）抑芽丹0.055Y = 0.0173X+0.01330.99960.210.714.3.2 回收率在样品提取前，将抑芽丹标准储备液加入到待提取的烟末样品中，静置1 h后，按正常前处理操作处理加标样品，并同时对未加标样品进行平行测定，以式（4-2）计算加标回收率。.式（4-2）其中，C1为加标样品中检测到的抑芽丹的浓度，C0为未加标样品中检测到的抑芽丹的浓度，Cs为添加的抑芽丹的浓度。低、中、高三个添加水平下，测得的回收率如表4-2所示：表4-2. 加标回收率结果添加水平原始值（mg/kg）测定值（mg/kg）加标量（mg/kg）回收率（%）低16.127.410.2110.8中16

30、.138.020.4107.4高16.167.951.0101.6实际烟末样品的提取离子色谱图如图4-2所示：图4-2. 实际样品的提取离子色谱图（A）抑芽丹定量离子（113/85）提取色谱图；（B）氘代抑芽丹定量离子（115/87）提取色谱图4.3.3 共同实验验证重复性和再现性为了验证本项目修订后方法的稳定性，并对方法的重复性和再现性进行评价，项目组组织了多家实验室进行了共同实验。参加此次共同实验的实验室来自9家单位，分别是：国家烟草质量监督检验中心、中国烟草总公司郑州烟草研究院、湖北省烟草产品质量监督检验站、福建中烟工业有限责任公司、浙江中烟工业有限责任公司、四川省烟草质量监督监测站、贵

31、州省烟草质量监督检测站、云南烟草农业科学研究院。共同实验选取了三种烟草制品，分别为烤烟中抑芽丹农药残留成分分析标准物质（GBW(E)083046）、白肋烟中抑芽丹农药残留成分分析标准物质（GBW(E)083047）、香料烟中抑芽丹农药残留成分分析标准物质（GBW(E)083048）三种国家二级标准物质，进行实验验证。每种样品测定5平行，各实验室的三种烟草样品中抑芽丹残留量测定结果分别如表4-3、表4-4和表4-5所示。各实验室的三种烟草样品中抑芽丹残留量测定结果与总体平均值的分布分别如图4-3、图4-4和图4-5所示。表4-3. 烤烟样品各实验室的测定结果（mg/kg）实验室编号平行测定1平行测定2平行测定3平行测定4平行测定5164