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1、完整版Fish实验FISH-荧光原位杂交实验(原位杂交)实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位 杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。2.实验原理荧光原位杂交( Fluorescence in situ hybridization FISH )是一门新兴的分子细胞遗传学 技术，是 20 世纪 80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性 原位杂交技术。 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异 分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 FISH 的 基本原理

2、是用已知的标记单链核酸为探针， 按照碱基互补的原则， 与待检材料中未知的单链 核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于 DNA 分子在染色体上是沿着染 色体纵轴呈线性排列， 因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上 定位。 与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、 杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。杂交所用的探针大致可以分为三类： 1)染色体特异重复序列探针，例如 a 卫星、卫星 III 类的探针，其杂交靶位常大于 1Mb ，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强， 易于检测； 2)全染色体或染

3、色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上 极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得； 3)特异性位置探针， 由一个或几个克隆序列组成。 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记 的方法。间接标记是采用生物系标记的 dUTP(biotin-dUTP) 经过缺口平移法进行标记，杂交 之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测， 同时还可以利用几轮抗生物素蛋白 荧光 素、生物素化的抗 抗生物素蛋白、抗生物素蛋白 荧光素的处理，将荧光信号进行放大， 从而可以检测 500bp 的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共 价结合， 或在缺口

4、平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。 直接标记法在检测时步骤简 单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。3.实验用具及材料Y 染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻 片、 Nikon E-400 、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、 200mL 移液器、 20mL 移液器、暗盒、指 甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温 20。4.实验方法及步骤1）探针及标本的变性（1）探针变性将探针在 75怛温水浴中温育 5min ，立即置 0，510min，使双链 DNA 探针变性。（2）标本变性1将制备好的染色体玻片标本于 50培养箱中烤片 23

5、h。（经 Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。2取出玻片标本，将其浸在 70 75的体积分数 70%甲酰胺 /2 SSC的变性液中变性 2 3min。3立即按顺序将标本经体积分数 70%、体积分数 90%和体积分数 100%冰乙醇系列脱水，每次 5min ，然后空气干燥。2）杂交将已变性或预退火的 DNA 探针 10mL 滴于已变性并脱水的玻片标本上， 盖上 18 18 盖 玻片， 用 Parafilm 封片，置于源潮湿暗盒中 37要交过夜 （约 1517h）。由于杂交液较少， 而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。3）洗脱此步骤有

6、助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。（1）杂交次日，将标本从 37温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热 4250的体积分数 50%甲酰胺 /2 SSC 中洗涤 3次，每次 5min 。3）在已预热 4250的 1SSC 中洗涤 3 次，每次 5min 。（4）在室温下，将玻片标本 2SSC 中轻洗一下。4）杂交信号的放大（1）在玻片的杂交部位加 150mL 封闭液 I，用保鲜膜覆盖， 37温育 20min。（2）去掉保鲜膜， 再加 150mL avidin-FITC 于标本上， 用保鲜膜覆盖， 37继续温育 40min。（3）取出标本，将其放入已预热

7、4250 的洗脱液中洗涤 3 次，每次 5min 。（4）在玻片标本的杂交部位加 150mL 封闭液 II ，覆盖保鲜膜， 37温育 20min。（ 5）去掉保鲜膜，加 150mL antiavidin 于标本上，覆盖新的保鲜膜， 37温育 40min 。（6）取出标本，将其放入已预热 4250的新洗脱液中，洗涤 3 次，每次 5min 。（7）重复步骤（ 1）、（ 2）、（ 3），再于 2SSC 中室温清洗一下。（8）取出玻片，自然干燥。（9）取 200mL PI/antifade 染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。5）封片可采用不同类型的封片液。 如果封片中不含有 Mowiol （可使封片

8、液产生自封闭作用） ， 为防止盖片与载片之间的溶液挥发， 可使用指甲油将盖片周围封闭。 封好的玻片标本可以在 -20-70的冰箱中的暗盒中保持数月之久。6）荧光显微镜观察 FISH 结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源， FITC 的激发波 长为 490nm。细胞被 PI 染成红色，而经 FITC 标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。 由于本实验使用的是 Y 染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳 性，即使在末分裂的细胞中， 也可以观察到明显的杂交信号。 照相记录实验结果 （图 16-1）。附录 I FISH 相关溶液的配制 1）20SSC：1

9、75.3g NaCl, 882.g 柠檬酸钠，加水至 1000mL（用 10mol/L NaOH 调 pH至 7.0）。2）去离子甲酰胺 （DF）：将 10g混合床离子交换树脂加入 100mL 甲酰胺中。 电磁搅拌 30min， 用 Whatmanl 号滤纸过滤。3）体积分数 70%甲酰胺 /2 SSC：35mL 甲酰胺， 5mL 20 SSC， 10mL 水。4）体积分数 50%甲酰胺 /2 SSC：100mL 甲酰胺， 20mL 20 SSC， 80mL 水。5）体积分数 50%硫酸葡聚糖（ DS）： 65水浴中融化， 4或 -20保存。6）杂交液： 8mL体积分数 25%DS， 20mL

10、 20 SSC混合。（或 40mL 体积分数 50%DS，20mL 20SSC，40mL ddH2O 混合）取上述混合液 50mL ，与 5mL DF 混合即成。其终浓度为体积 分数 10% DS 2SSC，体积分数 50% DF 。7） PI/antifade 溶液PI 原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为 100mg/mL ，取出 1mL，加 39mL 双蒸水，使终浓度为 2.5mg /mL 。Antifade 原液：以 PBS 缓冲液配制该溶液，使其浓度为 10mg/mL ，用 0.5mmol/L 的NaHCO3 调 pH 值为 8.0。取上述溶液 1mL ，加 9mL 甘油，混匀。PI/a

11、ntifade 溶液： PI 与 antifade 原液按体积比 1：9 比例充分混匀， -20保存备用。8）DAPI/antifade 溶液：用去离子水配制 1mL/mg DAPI 储存液，按体积比 1:300,以 antifade 溶液稀释成工作液。9）封闭液 I：体积分数 5% BSA 3mL ，20SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL 混合。10）封闭液 II ：体积分数 5% BSA 3mL ，20SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL 混合。11）荧光检测试剂稀释液： 体积分数 5% BS

12、A 1mL ，20SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL 混合。12）洗脱液： 100mL 20 SSC，加水于 500mL ，加 Tween20 500 mL 。13）TE 缓冲液： pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA ；pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA ；pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA 。14）溶液 I：25mmol/L Tris HCl（pH 7.4）, 10mmol/L EDTA 。15）溶液 II ： 10% SDS，0.

13、2M NaOH 。16）溶液 III ： Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至 50mL。17）LB 培养基：胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g, NaCl 10g, 加水至 1000mL ，用5mmol/L NaOH 调 pH 值至 7.0 。附录 II DNA 探针的制备质粒 DNA 克隆的提取、纯化和鉴定。1）用接种环挑取一小块 -70 冻存的转化菌， 接种于 5mL LB 培养基中， 37剧烈震荡过夜。2）将收集到的菌液 3000r/min 离心 10min ，弃掉上清液。3）向菌体沉淀中加入溶液 I300mL, 溶液 II 350mL ，混匀后将其置于冰浴中片刻，再加

14、溶液III 350mL 混匀，加酚和氯仿混合液（体积比为 1：1） 500mL 后充分混匀。4） 12000r/min 离心 10min 。5）取上清液，向其加入 600mL 异丙醇，充分混匀后以 12000r/min 离心 1530min ，弃掉上 清液。6）用 1500mL 体积分数 70% 乙醇洗涤沉淀 2 3 次，晾干。7）用 TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀。8）加水至 200mL ，以 Rnase A（终浓度 200mg /mL ）在 50水浴中消化 30min 。9）加入酚、 氯仿和异丙醇 （三者体积比 25：24：1）溶液 200mL 混匀， 12000r/min 离心 2min

15、。10）取上清液，再加入氯仿和异戊醇溶液（体积比为 24：1）200mL 混匀， 12000r/min 离心2min。11）取上清液，以 20mL 3M NaAc 及 500mL 体积分数 100%乙醇沉淀 DNA 。12）可将上述溶液在 -70放置 30min至1h以充分沉淀 DNA ，然后用 12000r/min离心 15min 。13）将沉淀用 1.5mL 体积分数 70%乙醇轻洗，自然晾干。14）用 TE 缓冲液溶解 DNA 。15）取12mL上述纯化的 DNA 溶液，于8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳鉴定 DNA 并 检测浓度。16）取 1mg DNA ，用相应限制性内切酶

16、45 单位， BSA100 200mg /mL，于 37水浴中 酶解 2 4h。17）电泳观察，根据酶切片段数量及大小，估计 DNA 克隆插入片段大小。附录 III 探针的生物素标记探针的标记可采用 PCR 或缺口平移法来制备，但多数情况下采用缺口平移法来制备。 该过程包括以 DNase I 在 DNA 双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗， 即大肠杆菌聚合酶 I 自缺口处进行修补合成。在修补合成互补链时将生物素标记的 d-NTP 掺入，从而复制出带有生物素标记的探针。本实验采用缺口平移法，按 GIBCO 公司提供的 方法以 biotin-14-dATP 标记探针。标记好的探针可

17、以在 -20下长期保存。总反映体积 50mL ， DNA 1mg,10 dNTP 5mL, 10Enzyme Mix 5mL 。其中 10dNTP 为： 500mmol/L Tris HCl（pH 7.8） 50mmol/L MgCl2100mmol/L - 硫基乙醇 100mg /ml 去除核酸酶的牛血清白蛋白0.2mmol/L dCTP, 0.2mmol/L dGTP, 0.2mmol/L dTTP0.1mmol/L dATP, 0.1mmol/L biotin-14-dATP10 酶混合为： 0.5units/mL DNA 聚合酶 I0.075untis/mL Dnase I50mmol

18、/L Tris HCl(pH 7.5)5mmol/L 醋酸镁1mmol/L -硫基乙醇0.1mmol/L 苯甲基磺酰氟体积分数 50%甘油100mg /mL 牛血清白蛋白将上述混合液于 16作用 1h。用 8.0g/L 琼脂糖 /TBE 缓冲液凝胶电检测标记产物。以 DNA 片段长约 300500bp 为宜。如片段较大，则应加适量 Dnase I 继续酶切，直至 DNA 片段长度适中后， 加 5mL 终止缓冲液 (300mmol/L EDTA )终止反应。用乙醇沉淀的方法将 探针与非掺入的核苷酸分开。一、荧光原位杂交( FISH ) 是一种简单、敏感、而容易操作的方法，结果迅速，并能在同一标本

19、上检测多个不同的基 因，可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片。FISH 技术是利用特异的 DNA 探针，标记了生物素，地高辛、或荧光素，对检测细胞进行 DNA-DNA 原位杂交，并用荧光法显示。FISH 实验步骤试剂配制：（1）变性液（ 70%甲酰胺 + 2SSC ，pH7.0 ）： 4 ml 20 SSC；8 ml 蒸馏水； 28 ml 甲 酰胺。每次新鲜配制。（2）杂交后洗涤液： 20SSC 4 ml ；蒸馏水 16 ml ；甲酰胺 20 ml 。每次新鲜配制。调节 pH 前升至室温。1.用硅化玻片，石蜡切片， 60烤片过夜。二甲苯脱蜡至酒精，斜置切片，空气中干燥。2.蛋白酶

20、处理：（1）每个染色缸 40 ml 蛋白酶 K消化溶液， 配制方法如下： 2SSC 40 ml 倒入 Facal 管， 在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。（2） 37水浴槽中预热染色缸和蛋白酶 K 溶液。 37孵育 20 min 。（3） 2SSC 在室温下漂洗切片 3 次，每次 1 min 。（4）梯度酒精脱水（ -20 预冷），空气中干燥。3.变性：（1）每一个立式染色缸配制 40 ml 变性溶液；（2）78水浴槽中平衡预热混合液染色缸；（3）78孵育 8 min ；（4）即移入-20预冷 70%酒精的染色缸内 2 min ，再依次移入 80% 、90%和 100%的-2

21、0 预冷酒精内，每缸 2 min ；（5）空气干燥。4.杂交：（1）准备探针；（2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；（3）滴 10 l 探针在切片的组织上，加盖玻片；（4）盖上湿盒盖， 37孵育 1216 h 。杂交后水洗：（5）镊子小心去除盖玻片；（6）43预热杂交后水洗溶液 40 ml 水洗切片 15 min ；（7）2SSC（37）洗两次，每次 10 min ；（ 8）切片放人染色缸的 1PBS 内待检测，勿使切片干燥。 检测：（ 9）从 1PBS 中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时 处理 4 张切片。（ 10 ）每张切片使用 3060 l 罗丹明抗 -地高

22、辛抗体或 FITC 卵白素， 室温下孵育 20 min ； （ 11 ）去掉塑料盖膜， 把切片放入含 1PBS 的染色缸。 1PBS 室温下洗 3 次，每次 2 min 。 扩增：（12 ）从 1PBS 中取出切片，斜置切片使液体排出；（ 13 ）每张切片滴 3060 l抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育 20 min ；（ 14 ）去掉塑料盖膜， 把切片放入含 1PBS 的染色缸。 1PBS 室温下洗 3 次，每次 2 min ； （15 ）从 1PBS 中取出切片，斜置切片使液体排出；（ 16 ）每张切片滴 3060 l 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育 20 min ；（17）1P

23、BS 室温下洗 3 次，每次 2 min 。5.细胞核染色：（1）张切片加 1020 l DAPI ，覆盖盖玻片并在室温下孵育 25 ml ；（ 2 ）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在 -20 冰箱。 切片在染色之后 1h 内可以在显微镜下观察。二、用引物介导的原位标记（ PRINS ）是 PCR 和荧光原位杂交（ FISH ）的结合， PRINS 是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针 与固定在细胞内的靶 DNA 互补序列，在聚合酶的驱动下，带有标记的脱氧核苷酸 （FITC-dUTP 或半抗原 -dUTP ）和 dATP 、dCTP 、 dGTP 的延伸，依赖标记，新合成的 DNA

24、就能直接的或间接的带有 FITC ，用荧光显微镜观察。PRINS 实验步骤1.常规脱蜡浸入 0.01 mol/L PBS ；2.用 0.2 mol/L 盐酸处理 5min ；3.蛋白酶 K（25 g/m）l 消化 37 15 min ；4.分别用 80% ，95%和 100%酒精脱水，室温干片；5.加 PCR 混合液 25 L（10 mmol/L Tris-HCl ，50 mmol/L KCl ，1.5 mmol/L MgCl 2， 各加 200 mol/L dATP ，dCTP ，dGTP ，1.5 mmol/L dig-11- dUTP 1.5 l，引物 250 ng ， Taq DNA 聚合酶 2 U ），加盖片；6.94变性 5 min 后置入 65 湿盒中 5 min ；7.用 0.1 SSC 液， 65 洗 5 min ；8.片于 65 1020 s ；用 4SSC-0.1% 吐温 20液 42洗 5 min ，2 次；9.经 Buffer 1 液洗后滴加20% 羊血清封闭30 min ；10.加地高辛抗体复合物（1：500 ）室温下2 h；11.Buffer 液洗 5 min ；12.用 BCIP-NBT 显色 12 h ，在镜下控制，终止显色；13.用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。