色谱峰成分识别技术用于苏丹红检测的研究.docx

1、色谱峰成分识别技术用于苏丹红检测的研究河南科技学院2007届本科毕业论文论文题目 色谱峰成分识别技术用于苏丹红检测的研究学生姓名：所在院系：食品学院所学专业：食品科学与工程导师姓名：完成时间： 2007年6月1日（所有的空白页不要删除，提交打印前将该行文字删除！）摘 要研究了二极管阵列高效液相色谱仪检测苏丹红的成分识别技术，利用三维图谱对峰的纯度以及峰的组成进行手工和自动确认。在优化的色谱条件下，苏丹红1、2、3及4号得到较好分离，利用峰的前中后部光谱的一致性确认峰的纯度，通过与标准光谱图库的匹配，在保留时间一致的基础上，对样品中的苏丹红组分峰进行进一步的确认，避免假阳性的判断。经过对辣椒粉的

2、检测，取得了满意效果。关键词：高效液相色谱；苏丹红；识别技术The research on the chromatograph peak ingredient recognition technology applied in the examination of Sudan redSchool of Food ScienceHuihui ChenAbstractThe research has studied recognition technology regarding the diode array high performance liquid chromatography appl

3、ied in the examination Sudan red ingredient, and carried on the handwork and automatic confirmation to the peak purity as well as the peak complsiton by means of the three dimensional atlas. Under the optimized chromatograph condition, the Sudan red 1, 2, 3 and 4 obtain well separates, using the pea

4、k front behind spectrum uniform confirmation peak purity, through with the standard spectrum map storage match, in the retention time consistent foundation, carries on the further confirmation to in the sample Sudan red component peak, avoids the false positive judgment. Passes through to the chili

5、powder examination, has obtained the satisfactory effect.Key words：high performance liquid chromatography；Sudan red；recognition technology目 录引言 11 材料与方法 21.1 材料 21.2 试验方法 21.2.1 仪器与设备 21.2.2 试剂与标准品 21.2.3 样品的处理 21.2.4 色谱条件 21.3 标准品准备 22 结果与分析 22.1 标准品色谱图分析 32.1.1 4种苏丹红的色谱图与光谱图 32.1.2 苏丹红标准系列色谱图、光谱图分

6、析 52.3 工作曲线 82.4 样品分析 82.4.1 样品峰的成分识别 82.4.2 样品回收率 102.4.3 精密度试验 103 小结 11参考文献 11致谢 12（所有的空白页不要删除，提交打印前将该行文字删除！）引言苏丹红是一种偶氮类化合物，苏丹红1号的化学式为1-苯基偶氮-2萘酚 C6H5=NC10H6OH，苏丹红2、3、4号均是其衍生物1，它是一种化学染剂，着色能力强，但不能用于食品的染色，因其具有致癌性。经研究发现，当食品中的苏丹红含量达到几千毫克时，其诱发动物肿瘤的机会就会上百倍的增加，国际癌症研究机构将其归类为第三类致癌物质，不允许以任何数量添加到任何食品中2。2005年

7、2月英国食品标准管理局宣布收回受苏丹红污染的食品后，为了保证食品安全，维护消费者权益，国家质检总局立即发出紧急通知，要求生产企业召回受苏丹红污染的食品，对使用苏丹红的食品生产企业进行查处。但有不少食品生产企业为改善色泽、降低成本仍将其作为食用色素。经过我国有关机构的检测，发现在辣椒粉、辣椒酱等一批辣椒制品中发现含有苏丹红，并扩大到动物饲料中，如鸭饲料，从而使鸭产下红心鸭蛋。目前人们的生活质量提高了，对食品的质量安全意识也在逐步增强，如果人们长期食用含有苏丹红的食品，则会对身体造成严重的伤害。因此对食品中苏丹红的检测则势在必行，尤其是快速、简便、精确的检测方法的研究是最为重要的。目前检测方法主要

8、有：分光光度法3，该法简便易行，但单独使用分光光度计，检测波长只能固定在某个点上，且影响样品颜色深浅的因素较多，因此会使结果有部分偏差，难以做到精确的检测；凝胶渗透色谱-液相色谱法4，该方法采用了中性氧化铝柱对样品进行净化，可以除去部分杂质，然后用于液相分析，这样结果的准确性会提高很多，但氧化铝活性难以控制，而且操作繁琐, 试验条件要求苛刻, 结果重复性差；薄层层析法5，该法采用聚酰胺酚薄层板，方法较可靠，适合于基层试验室；高效液相色谱/紫外检测法，将样品处理后，用紫外检测器进行色谱分离，以出现的色谱峰作为评判标准，通过样品与标准品保留时间的对比，可初步认定样品中含有苏丹红，但该方法准确度较差

9、。本文采用的是高效液相色谱/二级阵列管检测方法，本方法所用的检测器是光电二级管阵列检测器。在此检测器中先使光源发出的紫外或可见光通过液相色谱流通池，在此对流动相中的组分进行特征吸收，然后通过入射狭缝进行分光，使所含有吸收信息的全部波长，聚焦在阵列上同时被检测，并用电子学方法、计算机技术对二级管阵列快速扫描采集数据6。对结果的分析采用光谱匹配，对色谱峰前沿、峰顶、峰后沿的光谱图比对判断峰纯度，并对样品峰光谱图进行光谱匹配、峰纯度角计算来确定是否为苏丹红。此法较之以前的方法更为精确、方便，可同时检测苏丹红1、2、3、4号。1 材料与方法1.1 材料辣椒粉（市售），选择此材料的原因是，因辣椒采摘后易

10、退色，为保持其鲜亮的红色，多在其中添加苏丹红，因此选择此材料作为试验对象。1.2 试验方法1.2.1 仪器与设备美国water公司高效液相色谱仪：510型高压泵，2996型二级管阵列检测器Empower工作站，柱温箱；恒温水浴锅（北京市长风仪器表公司）；SHZ-D（）型循环水式真空泵（河南智诚科技发展有限公司）。1.2.2 试剂与标准品乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，经0.2m膜过滤）；甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；丙酮（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；苏丹红1号（中国派尼化学试剂厂），苏丹红2号（北京通县育木精细化工厂），苏丹红3号（沈阳试剂三厂），苏丹红

11、4号（上海试剂三厂）试验用水为超纯水（乐百氏纯净水）1.2.3 样品的处理准确称取辣椒粉5.00g，放入250ml烧杯中加入乙腈-丙酮（乙腈：丙酮=4：1）溶液，放入超声振荡器中，振荡3035min，使其中可能存在的苏丹红充分溶解，用分析滤纸进行过滤，并用同样比例的乙腈-丙酮溶液多次少量洗涤滤纸，直至滤纸无色为止。放入水浴锅中蒸发浓缩至约35ml，温度为40。用丙酮洗涤转移至10ml容量瓶中，并用乙腈定容至10ml。然后用0.45m滤膜过滤，滤液装入进样瓶中供HPLC分析用7。1.2.4 色谱条件色谱柱：symmetryC18柱（美国waters公司，3.9150mm，5m）；流动相：乙腈的酸

12、性水溶液（乙腈：0.1%甲酸=7：1）；流速：1.0ml/min；检测波长：230nm；柱温：30；进样量：10l。1.3 标准品准备首先对苏丹红1、2、3、4号用丙酮多次少量溶解转移，直至溶液洗涤为无色，共耗去28ml。然后用乙腈定容至100ml,混匀，配成500g/ml的原液，同时做空白对照，吸取28ml丙酮，用乙腈定容至100ml。其次，用4支5ml移液管各吸取5ml苏丹红1、2、3、4号移入50ml容量瓶中，配成混合液，用乙腈将其定容至50ml，配成50g/ml的储备液。逐步将其稀释为5g/ml的标准品。最后制成标准系列，浓度分别为0.2，1，3，5g/ml，用于HPLC分析用8-9。

13、2 结果与分析2.1 标准品色谱图分析2.1.1 4种苏丹红的色谱图与光谱图在上述色谱条件下进样，进样量为10l。进样之前应先让流动相稳定流过C18柱2030min，等基线走平稳时（即基线噪音小于10-4时）再进样。标准样品在200800nm范围内进行扫描，光谱图见图1到图4。 图1 苏丹红1号 图2 苏丹红2号 图3 苏丹红3号 图4 苏丹红4号结果表明苏丹红1号在228.9nm和478.0nm、苏丹红2号在231.2nm和497.3nm、苏丹红3号在230.1nm和504.6nm、苏丹红4号在232.4nm和519.2nm波长处有最大吸收，但在可见光区噪音较大因此检测波长选择在230nm。

14、 4种苏丹红在230nm处的色谱图与光谱图见图5到图8，并以此建立苏丹红标准光谱图库。 a b c 图5 苏丹红1号色谱图（上图）与光谱图（下图，21点平滑处理）a：峰前沿，b：峰顶，c：峰后沿a b c 图6 苏丹红2号色谱图（上图）与光谱图（下图，21点平滑处理）a：峰前沿，b：峰顶，c：峰后沿a b c图7 苏丹红3号色谱图 （上图）与光谱图（下图，21点平滑处理）a：峰前沿，b：峰顶，c：峰后沿a b c图8 苏丹红4号色谱图（上图）与光谱图（下图，21点平滑处理）a：峰前沿，b：峰顶，c：峰后沿由图可以看出4种苏丹红均为纯样品，并没有受到其他杂质的影响。2.1.2 苏丹红标准系列色谱

15、图、光谱图分析将配制的标准系列进样后作出标准图谱，检测波长为230nm，结果见图9-图10图9 空白色图谱 图10 5ppm色谱图 图中在1.4min左右出现的锋，通过与空白对照组对比可以得出为试剂峰。对于其余4个峰首先要对其峰前沿、峰顶、峰后沿进行光谱扫描，判断其是否为单一的峰，是否受到其他成分的相互影响，光谱扫描见图11-图14 图11 3.422min，3.496min，3.611min 图12 5.936min，6.054min，6.216min 图13 9.179min，9.376min，9.614min 图14 16.271min，16.542min，16.859min由图11-图

16、14可以看出4个峰均为单一组分，并未受到其它成分的影响。通过保留时间的对比可以初步判断其出峰顺序为苏丹红1、2、3、4号，其光谱图见图15-图18。图15 3.497min光谱图 图16 6.053min光谱图 图17 9.381min光谱图 图18 16.545min光谱图 通过与标准苏丹红光谱图感官对比，光谱相似性基本一致，从而进一步证实上述结论。但感官比对具有模糊性的特点，不具有量化特征。通过与苏丹红标准光谱图库的自动匹配，上述结果得到最终确认。自动匹配结果见表1。表1 与标准光谱图库的匹配结果NameRetention TimePDA Match1 AnglePDA Match1 Th

17、resholdPDA Match1 Lib. NameInt TypePeak Type苏丹红13.4970.1601.327苏丹红070525BBFound苏丹红26.0530.3051.647苏丹红070525VBFound苏丹红39.3800.5152.163苏丹红070525BBFound苏丹红416.5362.2155.744苏丹红070525BBFound由表1可以看出峰匹配角（Match Angle）小于匹配阈值（Match Threshold），说明匹配度高，由此可以说明按时间顺序出现的峰依次为苏丹红1、2、3、4号。2.3 工作曲线标准系列浓度分别为0.2g/ml、1g/ml

18、、3g/ml、5g/ml，其响应值见表2。表2 标液浓度与响应值序号浓度（g/ml）组分响应值12340.2135苏丹红1苏丹红2苏丹红3苏丹红4苏丹红1苏丹红2苏丹红3苏丹红4苏丹红1苏丹红2苏丹红3苏丹红4苏丹红1苏丹红2苏丹红3苏丹红416606124421065491518441261377512542103624136217482315082158579411681298564268712115554通过数据计算，建立了浓度与峰面积的工作直线。结果见表3。表3 标准系列回归方程组分回归方程相关系数苏丹红1号苏丹红2号苏丹红3号苏丹红4号y=81836x+292.41y=59264x+

19、494.92y=53465x-2609.1y=22078x+301.50.99980.99970.99900.9920由表3可以看出4种苏丹红呈良好的线性关系，除了苏丹红4号以外，其余的相关系数均在3个9以上。由于苏丹红4号响应信号较小，灵敏度较低，因此其线性关系稍差。2.4 样品分析2.4.1 样品峰的成分识别为了使试验具有对比性，样品色谱图同样在230nm下进行扫描，其色谱图见图19图19 样品光谱图 由样品的色谱图与标准品色谱图对比，可以看出在相同的保留时间内，样品色谱图中均有相应的峰出现，可以初步断定其中含有苏丹红，但要做出肯定的回答需要通过光谱图的比对才可以。样品在3.461min、

20、5.992min、16.363min的光谱图见图20-图21。 图20 3.461min光谱图 图21 5.992min光谱图 图22 16.363min光谱图通过样品光谱图与标准品光谱图从峰形、最佳吸收波长和吸光值范围的对比，可以看出在3.461min出现的为苏丹红1号，5.992min为苏丹红2号，16.363min为苏丹红4号，其光谱匹配结果见表4 ，浓度响应值见表5。表4 样品光谱匹配表 NameRetention TimePDA Match1 AnglePDA Match1 ThresholdPDA Match1 Lib. NameInt TypePeak Type苏丹红13.471

21、5.6647.318苏丹红070525BBFound苏丹红25.9986.92110.704苏丹红070525VVFound苏丹红38.610苏丹红070525BBUnknown苏丹红413.278苏丹红070525BBUnknown表5 样品组分与响应值序号组分响应值1234苏丹红1号苏丹红2号苏丹红3号苏丹红4号1202176170883344207242.4.2 样品回收率向样品中加入浓度为1.5g/ml的苏丹红标准混合液，用样品处理的方法进行萃取、过滤、蒸发浓缩，洗涤、转移定容，测出4种苏丹红的回收率分别为1号97.69%，2号68.86%，3号107% ，4号61.67%。由此可知，

22、苏丹红1号回收率较高，2号回收率较低，原因是辣椒粉中可能存在一些杂质，影响到响应值；4号回收率低时因为响应信号较小，灵敏度较低；3号4号未能匹配上，原因是由于其它杂质峰的影响， 2.4.3 精密度试验从配制好的标准系列中，选用3g/ml的标准品，采用标准品处理的色谱条件，连续进样5次，测试标品精密度，其保留时间和浓度响应值的RSD值见表6和表7。表6 保留时间RSD值 序号标液组分色谱峰保留时间（min）苏丹红1号苏丹红2号苏丹红3号苏丹红4号123453.2733.3163.3613.4013.4315.4795.6045.7155.8105.8828.0778.3778.6238.8338

23、.99614.03714.63515.09715.50215.816RSD1.89%2.82%4.25%4.69%表7 浓度响应值RSD值 序号标液组分浓度响应值苏丹红1号苏丹红2号苏丹红3号苏丹红4号123452351272338752412782498002474191724681667991726141777511761071405541368401402811451151453025433754412590525984857277RSD2.94%2.43%2.53%4.49%3 小结采用反相高效液相色谱法检测辣椒制品中的苏丹红，用乙腈-丙酮溶液进行萃取，通过超声振荡器振荡，使样品中的苏

24、丹红充分溶解，并采用乙腈-酸性水溶液为流动相，使苏丹红更好的分离，从而测定样品中苏丹红的含量。本试验样品处理方法采用的是国标的方法简单可行，但由于试验条件和时间的限制未能采用最佳的处理方法使苏丹红4号溶解的更加彻底，从而在试验结果上造成一定的缺陷，本方法的优点是能够精确的测定出样品中所含的疑似物是否为苏丹红，而且方法简便，快捷。方法的精密度和稳定性良好，可以满足对样品的检测，以保障广大消费者的身体健康，减少苏丹红食用的机会。参考文献1梁景波, 黄锦燕.反相高效液相色谱法检测辣椒酱中的苏丹红染料J. 化学分析计量，2005，14(5)：27-29.2-6略7GB/T 196812005，食品中苏丹红染料的检测方法S.8 -9略致谢本文是在老师的悉心指导下完成的，并受到