《分子生物学》实验17课时.docx

1、分子生物学实验17课时（本科）生物科学专业分子生物学实验2013年制订课程代码： 学分：1 总学时：17先修课程：生物化学，有机化学等。开课对象：生物科学专业（本科）一、课程的性质、目的与任务 分子生物学已成为生命科学的基础学科之一，其基本理论和实验技术已渗透到生物学的各个领域并促进了一批新学科的兴起和发展。目前，以分子生物学为基础的基因克隆重组技术已成为现代生物技术的核心。为了适应分子生物学技术的发展，落实培养创新人才的目标，特开展本实验课程，以培养学生的动手能力，加强学生对分子生物学实验技术的理解。除了增进对分子生物学内容的理解，更重要的是培养学生的实验技能和创新思维设计。通过实验原理的讲

2、解和实验操作，使学生初步了解和熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作机能和实际应用，提高学生的创新思维和独立分析问题解决问题的能力。二、实验内容与学时分配实验内容实验类型学时分配比例实验器材清洁灭菌与试剂配制操作2PCR扩增目的DNA验证2核酸的琼脂糖凝胶电泳与分析验证2pET28a质粒在大肠杆菌中的扩增与试剂盒抽提（碱抽提法）综合4感受态细胞的制备 (CaCl2法）综合3pET28a质粒转化大肠杆菌TOP10与鉴定综合4共17学时实验一 实验器材清洁灭菌与试剂配制一、 学习分子生物学实验室规则与注意事项二、 熟悉相关仪器的使用及操作规程超净工作台、PCR仪、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统、恒温

3、水浴锅、恒温培养箱、摇床、冷冻离心机、涡旋振荡器、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、重蒸水装置、移液枪三、器材的清洁与包装消毒（每组一份）1.试管清洗与包装灭菌：用清洁液刷洗后自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗两遍，晾干或烘干使用。取棉花与纱布，制成棉塞，塞好试管口。3只一组用报纸包裹、细绳扎紧，高温蒸汽灭菌。2.培养皿清洗与包装灭菌：将培养皿清洗干净，晾干或烘干，盖好，4套一组用报纸包裹，灭菌。3.离心管的包装与灭菌：将100ml烧杯清洗干净，晾干或烘干。取1.5ml及10ml离心管装入烧杯中，包口灭菌。4.枪头的灭菌：将10ul、200 ul和1000 ul枪头装入配套的枪头盒，包好灭菌。5.清洗250ml

4、、100ml和蓝口瓶盖盖。装好灭菌。6.灭菌完毕后取出烘干或晾干，保存备用。四、试剂的配制与灭菌：1. LB培养基：酵母提取物 5g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；琼脂 1520g；定容至1000mL（NaOH调pH至7.0，121、20min高压灭菌）。有时需在培养基中添加抗生素，琼脂凝固点为40，所以添加抗生素最好在5055。2.电泳缓冲液 ：50TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定

5、容至1 L后。高温高压灭菌，室温保存。1TAE缓冲液的配制：称量20 ml的50TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。溴化乙锭贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。6上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。配制：10 ml 溴酚蓝 25 mg 二甲苯青FF 25 mg 甘油 3 ml用6TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20保存。其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖3. 0.05mol

6、/l CaCl2溶液：称取0.37g CaCl22H2O，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。4. 含15%甘油的0.05mol/l CaCl2： 称取0.37g CaCl22H2O，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。5. 取锥形瓶装好双蒸水，包口、灭菌，即无菌水，存放于室温。6.用脱脂棉制成棉球，配制75%酒精浸泡，置于广口试剂瓶中备用。实验二 PCR扩增目的DNA及电泳鉴定一、 实验目的：掌握PCR技术的原理、方法和实验注意事项二、实验原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以

7、单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3-OH末端，并以此为起始点，沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形

8、成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的适温延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。三、 实验用品 PCR仪、台式离心机、电泳装置与凝胶成像

9、系统、移液枪、PCR管、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、一对引物、无菌水、模板（DNA或cDNA）四、 实验步骤在一灭菌的0.2ml PCR管中加入：2l RT产物2.5l 10Buffer1.5l 25mM MgCl2(终浓度为1.5mM)0.5l 10mM dNTPs (终浓度各为0.2mM)2.0l 10M上下游引物混合物（终浓度各为0.8M）0.5l 1U/l Taq DNA聚合酶16l灭菌双蒸水总体积为25lPCR反应程序为94/5min预变性；94/20s变性、50/40s退火、72/40s延伸，循环35圈；72/10min再延伸。反应结束后，取5L扩增产物采用1.5%琼脂

10、糖凝胶进行电泳分析。实验三 核酸的琼脂糖凝胶电泳与分析一、实验目的 学习并掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以

11、通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。 三、实验用品1.仪器及耗材：水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、移液枪及配套枪头、点样板或保鲜膜、一次性手套、10

12、0 ml或250 ml锥形瓶、量筒等。2.试剂及配制：50TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温保存。1TAE缓冲液的配制：称量20 ml的50TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。溴化乙锭贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后，转移到棕

13、色瓶中。室温保存。6上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。配制：10 ml 溴酚蓝 25 mg 二甲苯青FF 25 mg 甘油 3 ml用6TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20保存。其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖四、实验方法1. 制备1琼脂糖凝胶(50ml)：称取0.5 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml1TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。2. 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。取少量琼脂糖凝胶液将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成

14、模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。3. 加样：在保鲜膜上混合8.3l质粒DNA样品和1.7l上样缓冲液，用10 l移液枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升

15、高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。5. 电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1TAE溶液染色约20 min，再用清水漂洗10 min。6. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。7. 常见问题及注意事项1. 配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。2. 琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。3. 电泳时应注意电源线路，预防触电。4. 溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。5. 紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。6. DNA带

16、形状模糊：DNA加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。7. 质粒DNA的存在形式有3种，共价闭环DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA 线状DNA ocDNA。五、实验结果在紫外仪中观察电泳荧光区带，并拍照、分析。实验四 pET28a质粒在大肠杆菌中的扩增与试剂盒抽提（碱抽提法）一、实验目的学习并掌握在宿主菌中扩增质粒的理论依据与操作方法。了

17、解大肠杆菌质粒提取的原理和方法，掌握小量快速提取法（试剂盒法）。二、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。基因工程用质粒都带有选择性标记序列，最常用的的选择性标记是对抗生素的抗性基因。如本实验所使用的质粒（pET28a），即带有抗卡那霉素（Kanr）抗性基因。当培养中含有卡那霉素时，宿主（大肠杆菌BL21）的蛋白质合成受到抑制，而pET28a质粒

18、可自行复制，从而将大大增加拷贝数，达到抽提质粒的浓度要求。一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：培养细菌，使质粒DNA大量扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。图1 pET-28a 质粒基因结构简图碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋

19、结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。三、实验用品 仪器及耗材： 37恒温摇床、台式离心机、恒温水浴锅、移液

20、枪及配套枪头、记号笔、烧杯、冰盒、酒精灯、打火机、计时器； 50 ml离心管、1.5 ml离心管、离心管架、蓝盖试剂瓶、大试管、100 ml三角锥瓶、250 ml三角锥瓶、玻棒等； 3S柱离心式质粒小量抽提试剂盒 实验材料： 大肠杆菌BL21，含pET28a质粒。 试剂及配制： LB培养液的配制： 酵母粉 5.0 g； 蛋白胨 10.0 g； NaCl 10.0 g；依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH调节培养液的pH值至7.0。再加去离子水将溶液定容至总体积为1000 ml，高压蒸汽灭菌25 min，冷却后4保存。卡那霉素：50mg/ml，配制后抽滤

21、灭菌，分装，-20冻存。 溶液 （GET缓冲液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖 配制：1000 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0） 25 ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 ml 20% Glucose（1.11mol/L） 45 ml dH2O 910 ml将以上溶液混合装瓶， 10磅高压灭菌20 min，冷却后4保存。溶液II（变性液）：200 mmol/L NaOH ， 1% SDS配制： 500 ml 10% SDS 50 ml 2N NaOH 50 ml取以上溶液

22、，用灭菌去离子水定容至500 ml，充分混匀。室温保存，此溶液保存时间最好不超过一个月，最好现用现配。注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 溶液 III (醋酸钾液)：3 mol/L 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸配制：500 ml醋酸钾 147 g冰醋酸 57.5 ml加入300 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至500 ml。高温高压灭菌后，4保存。10TE缓冲液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA配制：1000ml1 mol/LTris-HCl 缓冲液(pH 8.0) 10

23、0ml500 mmol/L EDTA (pH8.0) 20 ml加入约800 ml的去离子水，均匀混合。溶液定容至1 L。高温高压灭菌后，4保存。苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。其它试剂：TE（pH8.0）、异丙醇、氯仿/异戊醇（24:1）、无水乙醇、70乙醇四、实验方法（一）pET28a质粒在大肠杆菌中的扩增1. 菌种活化：将50ml LB培养基加入到250ml三角锥形瓶中，加入卡那霉素50L，然后接入一单菌落（携带pET28a的大肠杆菌BL

24、21菌株），并保持通气良好，于37 220 rpm振荡培养过夜（约16h），如有必要可以再转接一次，于37 220 rpm振摇培养34 h。2. 菌液转接：取灭菌后的50ml三角锥形瓶一支，加入15ml LB培养基和15L卡那霉素，接种菌液250L，于37恒温振荡器中 220 rpm振摇培养。3. 培养过夜后，收集所培养的菌体，用于质粒抽提。（2）质粒DNA提取（碱裂解法）用3S柱离心式质粒小量抽提试剂盒抽提，以试剂盒使用说明为准1. 将过夜培养的1ml细菌转移至1.5 ml离心管，高速（15,000转/分钟）离心5分钟，彻底去除上清。重复1次。2. 加入100l Solution I，用枪头

25、或振荡器充分悬浮细菌。3. 加入200l Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。4. 加入400 l Solution III，立即上下颠倒510次，使之充分中和，室温放置2分钟。（注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。）5. 高速离心，15,000转/分钟，10分钟。无需低温离心。6. 取出2ml样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到（吸或倒入）3S柱子里。盖上离心管盖子，室温放置2分钟；用台式离心机室温高速（15,000转/分钟）离心2分钟。7. 取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集

26、管中，吸取700l Wash Solution到3S柱，高速离心2分钟。8. 重复步骤7一次。9. 取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，高速离心5分钟。10. 将3S柱放入干净的1.5ml的离心管（预先写好标签）中，在3S柱子膜中央加50l TE或水，不要盖上离心管盖，室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心3分钟。11. 弃3S管。保留1.5ml离心管，盖好离心管盖，存放于-20保存备用。附：自制抽提液碱裂解法操作1. 吸取培养的菌液1 ml，转入1.5 ml的离心管中，用台式离心机以12000 rpm离心3 min。弃上清。在管内再次加入菌液1ml，离心，弃上

27、清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。2. 加100 l 溶液 重悬细菌沉淀，用枪吹打直至混和均匀。3. 加200 l溶液 ，盖紧管口，轻缓上下颠倒离心管以混合内容物。室温静置5 min（溶液变透明，粘稠）。4. 加150 l溶液 ，轻微振荡混和10 sec，置冰上10 min (溶液出现白色沉淀)。5. 12000 rpm离心6 min，取上清液至另一离心管（弃沉淀）。6. 加等量的酚/氯仿/异戊醇，旋涡混匀1 min，12000 r/min离心6min，取上清液至另一离心管。7. 加1倍异丙醇，振荡混匀，静置10 min，12000 rpm离心6 min。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附

28、于管壁的残余液滴除净。8. 加200 l 70乙醇洗涤沉淀物，台式离心机12000 rpm离心2 min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干（或在5060的烘箱中也可）。9. 沉淀加20l TE, 反复吹打使质粒DNA充分溶解，20保存。五、实验结果 将所抽的质粒存放于4冰箱中备用。六、思考与讨论 如果要在此pET28a质粒中放入外源重组基因，该如何选择插入位点？常见问题：1.提取的质粒DNA不纯：变性不充分；关键步骤反应时间过短；离心时间或速度不够。 2.提取的质粒DNA呈涂布状：操作过程中用力过猛，动作过大；操作系统内有污染。 3.与染色体DNA分离不全：变性过程不完全；试剂配制有问题（成分，浓

29、度或pH）。实验五 感受态细胞的制备 (CaCl2法）一、实验目的了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理，掌握制备方法。二、实验原理在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，

30、制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存（半年），因此CaCl2法为使用更广泛。三、实验用品 材料： 大肠杆菌TOP10 设备器材： 超净工作台、冷冻离心机、恒温摇床、冰箱、恒温水浴锅、分光光度计、移液枪（1000l、100l）及相配枪头、离心管（1.5ml、10ml）、离心管架、记号笔、计时器、锥形瓶、冰盒、温度计。 试剂：LB液体培养基0.05mol/l CaCl2溶液：称取0.37g CaCl22H2O，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。含15%甘油的0.05mol/l CaCl2： 称取0.37g CaCl22H2O，溶于50ml重蒸水中，

31、加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。四、 实验步骤（一） 受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coli TOP10单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右。（二） 感受态细胞的制备 （CaCl2 法） 1）、在超净台上将8ml培养液转入10ml离心管中，冰上放置10分钟，然后于4下3000g离心10分钟。 2）、在超净台上弃去上清，用预冷的0.05mol/l的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4下3000g离心10分钟。 3）、在超净台上弃去上清，加入400l预冷含15%甘油的0.05mol/l的CaCl2 溶液