SDSPAGE蛋白电泳手册.docx

1、SDSPAGE蛋白电泳手册蛋白电泳手册SDS-PAGE及 Western blot蛋白电泳 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一 , 电泳是指带电粒子在电场作用下 , 向着与其电荷相反的电极移动的现象 . 根据所采用的支持物不同 , 有琼脂糖凝胶电泳 , 淀粉凝 胶电泳 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中 , 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）由于无电渗作用 ,样品用 量少（1-100 g） ，分辨率高，凝胶机械强度大 , 重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体 与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。PAGE原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 （ 简称 Acr） 和交联剂

2、 N，N亚甲基双丙烯酰胺 （简称 Bis ） 在催化剂作用下， 聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶， 并以此为支持物进行电泳。 聚 丙烯酰胺凝胶电泳 （ PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生 的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。SDS-PAGE原理 SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分 子结合成复合物， 使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷， 掩盖了各种蛋白分子 间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 -SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和 分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为 SDS

3、-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDSPAGE）。实验使用过程中，还加入 DTT或者 * ，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质 的四级结构。 SDS PAGE最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶） 。索引蛋白电泳（ SDS-PAGE） 电泳试剂总表 制胶上样及电泳染色蛋白提取蛋白定量Bradford 蛋白浓度测定试剂盒使用说明BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明Lowry 蛋白浓度测定试剂盒使用说明蛋白分子量标准（图） 考马斯蛋白胶快速染色液Western blotWestern blotting DAB 检测试剂盒Western blotting ECL 化学发光检测试剂盒Western blott

4、ing 试剂盒使用说明蛋白电泳试剂（部分试剂可以相互替换） 系号 货号 名称1T8060TRIS 三羟甲基氨基甲烷2G8200Glycine 甘氨酸 3S8010SDS 十二烷基硫酸钠4A8080Acrylamide 丙烯酰胺5M8200N,N-Methylene Bisacrylamide 甲叉双丙烯酰胺 6A8090Ammonium Persulfate 过硫酸胺 7D8220DTT 二硫糖醇8M8210-Mercaptoethanol -*9T8090TEMED 四甲基 *10A101030%丙烯酰胺（ 29:1 ）11S10514XSDS-PAGE分离胶缓冲液（ PH=8.8）12S1

5、0524XSDS-PAGE浓缩胶缓冲液（ PH=6.8）13P10164蛋白上样缓冲液 （含 -*）14P10154蛋白上样缓冲液 （ 含 DTT）15D10701M DTT16A103010%过硫酸氨17T10201M Tris-HCL （PH6.8）18T10101.5M Tris-HCL（PH8.8）19S101010%SDS20T10705Tris- 甘氨酸电泳缓冲液SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，实验室可根据自己的情况和习惯来选择试剂。如选择 1、2、3、4、5、6、7、8、9 全部试剂可自己配制。也可以选择配制好的试剂。如 10、11、12、13/14 、 16、 9、 20

6、。还可选择 10、13/14 、16、9、17、18、19、20。一，制胶凝胶配制表（一）分离胶 12%分离胶 10%分离胶 8%浓缩胶（ 3%）总体积10ml10ml10ml5ml4X 分离胶缓冲液（ PH8.8）2.5ml2.5ml2.5ml04X 浓缩胶缓冲液（ PH6.8）0001.2530%丙烯酰胺 (29:1) 4ml3.32.70.5 ddH2O3.4ml4.1ml4.7ml3.2ml10%过硫酸铵100ul100ul100ul75ulTEMED10ul10ul10ul7.5ul凝胶配制表(二)分离胶 12% 分离胶 10% 分离胶 8% 浓缩胶( 3%) 总体积 10ml 10

7、ml10ml5ml30%丙烯酰胺 (29:1) 4ml3.3ml2.7ml0.5ml1M Tris-HCL (PH6.8)0000.625ml1.5M Tris-HCL（PH8.8）2.5ml2.5ml2.5ml010%SDS100ul100ul100ul50ulddH2O3.3ml4.0ml4.6ml3.75ml10%过硫酸铵100ul100ul100ul75ulTEMED10ul10ul10ul7.5ul常规 SDS-PAGRE凝胶可按上表一或者表二配制。 TEMED和 10%过硫酸铵最后加，在加入前需 混匀前面所加试剂。 10%过硫酸铵在 4有效期为一周， TEMED易挥发，使用后请盖紧

8、瓶盖。 在常温下胶 30 分钟可以凝固，如温度过低，可放 37温箱凝固。灌完分离胶后，轻轻的加1ml ddH2O 封上层，胶凝固后可见到分界线。灌浓缩胶时，先倾去水层，再用吸纸吸干。灌 浓缩胶后立刻插入梳子。 浓缩胶凝固后， 放入电泳液中 （ 让电泳液漫过加样孔 ） ，轻轻的拨出 梳子，可防加样孔变形。配制量可按上表等比加减。如果所用胶浓度与上面不同，可自行调整，主要是加减 30%丙烯酰胺的量（需要浓度总体积 /30%），最后用水补足总体积。二，上样及电泳取 3 体积蛋白样品加入 1 体积 4蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴 5 分钟。冷却后离心取上 清上样， 一般还在样品的相临孔加上蛋白 Mar

9、ker 。上样前将 5Tris- 甘氨酸电泳缓冲液稀释 成 1（100ml 加入 400ml 双蒸水混匀 ） 。一般在浓缩胶时电压 80V，分离胶时电压 120V。在目 标蛋白跑到合适的地方，停止电泳。取下胶染色或者再进行下一步实验。注意事项1.SDS 与蛋白质的结合按质量成比例（即： 1.4gSDS/g 蛋白质），蛋白质含量不可以超标， 否则 SDS结合量不足。2.用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利 用这次的标准曲线作为下次用。并且 SDS-PAGE测定分子量有 10误差，不可完全信任。3.有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（ - 胰

10、凝乳蛋白酶）组成的，它们在* 和 SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质， SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。4.有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该 法测相对分子量。5.如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是 SDS不纯引起。三，染色 蛋白电泳完后，取出电泳玻璃板，小心撬开玻板（一般胶会附在长玻板，即凹玻板一面） ， 用刀片小心切开分离胶与浓缩胶的交界处。 丢弃浓缩胶， 再用刀在胶左右两边与玻板凸起交 界处各画一刀， 放入电泳液中， 一般胶会自然滑入溶液中。可进行下一步染色。

11、我公司所产 蛋白快速染色液，可在半小时染出结果，详情请见附四（ P1300）。附一，蛋白提取货号名称说明R0010高效 RIPA组织 /细胞裂解液产品简介：在普通 RIPA 的基础上改进而来 ,含蛋白酶抑制剂及 * 酸酶抑制剂 （ 配有一支 PMSF）.R0020RIPA组织 /细胞裂解液RIPA 经 典 配 方 ， 适 于 绝 大 多 数 蛋 白 - 蛋 白 相 互 作 用 的 免 疫 实 验 。 组 成： 50 mM Tris-HCl （pH 7.4）, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS.（ 配有一支 PMSF） 保 存： 4 oC 避光R0030 非变性组织

12、 / 细胞裂解液 非变性条件下裂解的蛋白产物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原 - 抗体结合或酶 学活性，因此适宜于进行免疫共沉淀。本系列试剂随同配送一支 PMSF，请收到后 -20 保存。 RIPA 裂解液 4保存，如发现有少量 沉淀，可常温放置半小时，沉淀可消失，不影响使用。操作步骤：根据使用量，取每 1mlRIPA 加入 10ul PMSF。使 PMSF的最终浓度为 1mM。混匀备用（ PMSF 现用现加）。1，样品前处理：a） 对于细胞：贴壁细胞用 PBS洗一遍，悬浮细胞直接离心收集，按照 6 孔板每孔细胞量加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液

13、和细胞充分接触。b） 对于组织样品： 把组织剪切成细小的碎片。 按照每 20 毫克组织加入 150-250 微升裂解液 的比例加入裂解液。 （ 如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白 样品，可以适当减少裂解液的用量 ） 。 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。2，后处理：将裂解后的样品 10000-14000g 离心 3-5 分钟（对应小离心机为 16000 转），取上清， 即可进 行后续的 PAGE、 Western 和免疫沉淀等操作。注：本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂，所以不适合于 Bradford 蛋白浓度 测定试剂盒，请选择 BCA法或者 Lowry 法

14、。附二，蛋白定量 蛋白含量测定是以标准蛋白作为对照，根据蛋白浓度不同，吸光值不同而达到定量的目的。 有些方法是理解蛋白本身的吸光值 (紫外光谱吸收法) 来定量， 但更多的是用染料对蛋白进 行染色， 利用染料与蛋白结合显出与原染料及蛋白不同的吸光值来定量的。 后一种方法应用 更普遍。蛋白定量方法的选择， 应该考虑到蛋白结构 (标准品选择) 、蛋白溶液干扰物等因素的影响。 货号 名称 组成 说明PC0010Bradford 蛋白浓度测定试剂盒5G250染色液100ml2-8干扰物质少， Tris 、糖、甘油、 * 、氨、 EDTA等均不干扰测定。BSA(5 mg/ml)1ml-20oCPBS稀释液

15、30ml2-8PC0020BCA蛋白浓度测定试剂盒BCA Reagent100ml2-8 BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。Cu Reagent3.0ml2-8BSA(5 mg/ml)1ml-20oCPBS稀释液30ml2-8PC0030Lowry 法蛋白浓度测定试剂盒Folin 酚甲试剂 A200ml2-8Lowry 法测定较为不受脂类物质干扰，适于脂类含量较高的样品测定。也能耐受相当浓度的 去垢剂如 SDS。Folin 酚甲试剂 B5ml2-8Folin 酚乙试剂20ml2-8BSA(5 mg/ml)1ml-20oCPBS稀释液30ml2-8附三，蛋白分子量标准（图）附四，考马斯蛋白胶

16、快速染色液 （P1300） 考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液是一种即用型快速灵敏而且安全的染液， 用于 SDS?PAG或E 者 非变性胶的快速染色，在半小时就可以出结果。灵敏度达 10ng。使用方法：1.将电泳后的 PAGE 胶（以 8cm10 cm 大小为例）取下放入容器中，加入 50 ml 双蒸水或 去离子水，加热至沸腾后停止， （可选：继续在脱色摇床上摇动 5 分钟），弃去水溶液。2.加入 20 ml 至 25 ml 快速染色液（按盛胶容器的大小而定，以浸没胶面为准） ，加热至 沸腾后保持沸腾状态 30-60 秒，停止加热后继续在脱色摇床上摇动 5-10 分钟，弃去染色 液（此时蛋白条带应已可

17、见） 。3.加入约 50 ml 水，加热至沸腾后保持沸腾状态 30-60 秒，停止加热后继续在脱色摇床上 摇动 5-10 分钟，换水即可完成脱色，观察结果。注意事项：1染色前的清洗步骤（第一步）中，水的质量非常重要，质量越好灵敏度越高，研究证明， 若用自来水加热清洗，染色效果与灵敏度仅与常规甲醇考马斯亮蓝染色（分子克隆第二版） 相同。2脱色时可用自来水清洗。3若要得到无背景的染色胶，可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜。4经本产品染色的 PAGE 胶，胶的缩涨度小于 5% ，染色后的胶可在水中放置数月而无明显 脱色。5每次加热后，继续在脱色摇床上摇动 5 分钟，可增强染色效果。6本染色液有轻微腐蚀

18、性，请带手套操作。Western blot经过 PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如* 纤维素薄膜 ）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋 白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或 * 自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分，此技术称为 免疫印迹（ Western blot ）。Western blotting 检测系统除需要过氧化物酶标记的各种二抗外， 还需要配套的显色试剂。 索莱宝提供 DAB显色和 ECL化学发光两种试剂及相应试剂盒。West

19、ern blotting DAB 检测试剂盒本试剂盒适合加一抗后的后续显色。 操作简单， 适合重组等高表达蛋白的检测， 其敏感性不 如 ECL 法。编号名称说明SW1010Western blotting （ 小鼠 IgG）DAB 显色试剂盒可配制 250ml 二抗和 100ml 显色液，适合一抗为小鼠 IgG。SW1020Western blotting（ 兔 IgG）DAB 显色试剂盒 可配制 250ml 二抗和 100ml 显色液，适合一抗为兔 IgG 。SW1030Western blotting（ 山羊 IgG）DAB 显色试剂盒 可配制 250ml 二抗和 100ml 显色液，适合

20、一抗为山羊 IgG。SW1040Western blotting（ 小鼠 / 兔 IgG）DAB 显色试剂盒 可配制 250ml 二抗和 100ml 显色液，适合一抗为小鼠和兔 IgG 。 试剂盒容：1.封闭试剂： 30g（ 可配制 400ml） 脱脂奶粉及其他蛋白，缓冲盐等混合物。2.10 倍浓缩抗体稀释液， 50ml。3.HRP标记二抗， 0.5ml ，效价 1： 500-3000 。4.20 倍 DAB浓缩显色液， 5mlA+5mlB。Western blotting ECL 化学发光检测试剂盒 本试剂盒适合加一抗后的后续显色。敏感性比 DAB高 10 倍。适合组织及细胞中常规蛋白的检测

21、，但需有暗室等相关配套条件。编号 名称说明SW2010Western blotting（ 小鼠 IgG）ECL 显色试剂盒 可配制 250ml 二抗和 50ml 显色液，适合一抗为小鼠 IgG 。SW2020Western blotting （ 兔 IgG）ECL 显色试剂盒可配制 250ml 二抗和 50ml 显色液，适合一抗为兔 IgG 。SW2030Western blotting（ 山羊 IgG）ECL 显色试剂盒 可配制 250ml 二抗和 50ml 显色液，适合一抗为山羊 IgG 。SW2040Western blotting（ 小鼠 / 兔 IgG） ECL 显色试剂盒 可配制

22、250ml 二抗和 50ml 显色液，适合一抗为小鼠和兔 IgG。 试剂盒容：1.封闭试剂： 30g（可配制 400ml） 脱脂奶粉及其他蛋白，缓冲盐等混合物。2.10 倍浓缩抗体稀释液， 50ml。3.HRP 标记二抗， 0.1ml ，效价 1： 2000-5000 。4.ECL 显色液， 25mlA+25mlB。操作步聚常规电泳转膜后，1.清洗转印膜：将膜剥离下后，作好标记，一般在左上角剪一缺口。室温用 TBS-T 漂洗 3 次每次 5min, 以尽量洗去转印膜上的 SDS，防止影响后面的抗体结合。2.按 5g 封闭试剂加 100ml 双蒸水计， 配制膜封闭液， 配好的膜封闭液为乳白色悬液

23、， 将漂 洗过的转印膜，封闭液，摇床震动，室温封闭 30min。用 TBS-T ， PH7.6 洗液，室温漂洗 3次每次 5min。3.将 10 抗体稀释液用双蒸水稀释成 1（10ml 10 抗体稀释液加入 90ml 双蒸水，混匀， 可 4保存三个月） 。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。4.用 1的抗体稀释液稀释抗体。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜 放入杂交袋中， 加入一抗工作液，封口， 4孵育过夜或 37摇动孵育 2h 。此用过的抗体一 般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步将膜沿电泳方向剪成条，分 别作好标记，分开孵育。5.用 TBS-T ，PH7.

24、6洗液，室温漂洗 3 次每次 5min。6.用稀释好的抗体稀释液稀释二抗。根据用量， DAB法按 10ml 抗体稀释液加入 20ul HRP标记二抗（ 1：500）的比例； ECL法按 10ml 抗体稀释液加入 5ul HRP 标记二抗（ 1： 2000） 的比例，配制二抗工作液，混匀。将杂交膜放入杂交袋中，加入二抗工作液，封口， 37 摇动孵育 1h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。7.用 TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗 3 次每次 10min 。8.显色：a） DAB 显色：配制 DAB显色，根据用量，取 TBS-T 4ml ，加入 DAB显色液 A、DAB显色液 B 各

25、200ul ，混匀，加在膜正面，室温下显色。在目标条带显出后，而且背景未出时，放入水 中终止显色。b） ECL 化学发光法检测：配制 ECL发光液，根据用量，取 ECL发光液 A、ECL发光液 B等量 （一般各取 2ml ，可够覆盖一膜） ，混匀，加在膜正面，暗室避光显色 5 分种。先倾去显色液，再小心用纸吸去显色液，在上面盖一层平整的透明纸 （ 以上操作可在弱自然光条件下 ） 。将胶片，显影液，定影液等拿进暗室准备好。关上暗室门，打开红外灯，再取出感光胶片， 做好标记，轻轻的放在膜上，请小心不要错动（余下的胶片请收好） 。显色 30S到 1 分种， 拿开（直接上抬）胶片立即完全浸入显影液中

26、1-2min ，再丢入定影液中 1 分钟，离开暗室， 观察结果，根据条带强弱，可再次感光一次，并且减短或者加长感光时间（从 5 秒到 30 分钟）以期达到理想结果。注意事项：1. 请根据目标蛋白丰度及一抗来源选择试剂盒。2.western blotting ECL 发光法操作比较烦琐， 实验条件要求高， 但其敏感性较高。 而 DAB显色法操作简单，但敏感性不如发光法。3.可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深，可延长膜封闭时间，加长最终漂 洗次数与时间。 如果条带过弱， 可增加抗体浓度， 延长抗体孵育时间， 沿长显色或者感光时 间。4.TBS-T （0.01M）配制方法：称取 NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用 800ml 的双蒸水溶解， 用盐酸调 PH到 7.6 ，再加入 0.5ml Tween 20，用双蒸水 加至 1000ml，混匀即可。 （也可 按照自己的配制习惯来配制）5.一般头一次实验，可将蛋白上样量作几个梯度，如果实验结果都无条带，可将稀释过的 一抗再作 1倍，10 倍，50倍稀释，直接点到膜上（ 10ul ），封闭，加二抗，最后显色，如果 能显出斑点来，则证明显色系统没有问题（ ECL 法用胶片检测） ，可从蛋白裂解和一抗上面 找原因；如果无法显出斑点，请先从显色系统寻找原因。