无菌检查法药检所文摘.docx

1、无菌检查法药检所文摘无菌检查法第一讲2000版药典无菌检查法增修订内容概述无菌检查法是针对无菌制品的无菌性而建立起来的一套检查方法，早在19世纪初就列入了药品检查的要求项目，在人们不断实践的过程中，其方法也在不断地改进和提高，检查的X围和内容也逐步扩大。中国药典2000版就取样量、培养基质量、无菌环境、无菌操作技术等方面有大幅度的增订和修订，具体概括如下：1扩大了检验X围：以往的无菌检查仅适用于药品及敷料，本次修订增加了肠线、缝合线及无菌器具，这就使一次性注射器、一次性输血输液器等有了切实可行的检验方法。2对无菌检查的操作环境提出了明确的要求，规定操作应在100级单向流空气区域内进行，并且对单

2、向流空气区与工作台面要进行验证。3培养基：在提法上将霉菌培养基更名为真菌培养基。因为霉菌培养基上常有酵母菌生长，霉菌和酵母菌都不是分类学上的名词，而只是一个形态学类群，是一种俗称，被习惯称为霉菌和酵母菌的两大类群微生物属于真菌门。将霉菌培养基更名为真菌培养基能更确切地反映这一培养基的适用X围。在制法上提出可按药典规定的处方自制，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。使用脱水培养基（合成培养基）可大大节省我们的工作量和工作时间，但应注意使用应严格按说明进行，灭菌温度和时间统一规定为11530分钟，同时注意pH值的变化，并逐批对培养基进行灵敏度检查。培养基灵敏度检查：这是对培养基的质量性能进

3、行检验的一个试验。此次修订增加了制备稀释菌液的一种方法，即直接稀释法，新增的第二法直接稀释法较第一法（比浊法）简单，人为误差小。对两种稀释法，2000版药典都规定了菌液的最终浓度为10100个/ml而放弃了稀释级的提法，因此培养基接种管数减少，简化了工作量，明确了结果判断。4对照用菌液:对照用菌液是无菌检查实验中加入阳性对照管的菌液2000版药典对此项的改动与灵敏度实验相一致也是将菌液的稀释级10-6改为最终稀释浓度100个/ml将金黄色葡萄球菌的接种培养基由需厌气培养菌改为营养肉汤培养基。5抑细菌和抑真菌实验此项实验为本次修订时增设。在用直接接种法进行无菌检查前，要测定供试品的抑菌性。增设该

4、项实验是适应当前大量新药涌入临床，对这类药品进行无菌检查时，往往对其是否具有抑菌作用没有把握，如果其有抑菌性，就会造成我们检验结果的假阴性，国外药典都在无菌检查中设有此项内容。我国2000版药典增设该项内容，虽延长了无菌检查时间，但可以减少方法选择上的盲目性。因此具有很重要得意义。6检查法在检查法的序言中，明确规定了直接接种法和薄膜过滤法的适用X围，前者适用于非抗菌作用的供试品，后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。在进行无菌检查前，提出用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒。2000版药典把它作为一个实验步骤提出来，较95版更明确具体。（1）直接接种法：将95版的七大类供试品

5、进行了简并（如23条简并为一条）；增设了内容（如外科敷料中增设了肠线、缝合线；又专项增设了灭菌医用器具一条）；调整了次序（将有抑菌作用和抗生素类药品从直接接种法中删除，而其相应的内容在薄膜过滤法中体现出来）。对青霉素类药品叙述了两种方法都可使用，而不是只用酶法；放射性药品没有变更。经过调整，最终将供试品归纳为六类，调整后的款项，内容丰富，归类合理。在直接接种法中，最大的变动是取样量的增加和培养基管数的增加，这是本次修订无菌检查法的重要改动，并为此专门增设了表格附后。从理论上讲当某批产品染菌率一定时检出有菌的概率随样本数量的增加而增加95版进行无菌检查时一般取用2个容器在这种样本数下通过无菌检查

6、的可能性很大而这时所下的无菌结论其假阴性率比较高2000版将取样量增加到11个容器接种量从全量到5ml不等对敷料由原两个包装增加到4个包装原来剪取以面积计改为以重量计或面积计。培养基接种管数由原来的共7管调整到共11管其中真菌培养管由原来的2管增加到5管培养时间均设为7天延长了细菌原来5天的培养时间这样的修订统一了细菌和真菌的操作提高了阳性检出率。对加入供试品后培养基出现浑浊这一情况的处理方法2000版药典明确规定经7天培养后可转种或可显微观查而不是两种方法同时使用。（2）薄膜过滤法:本法将取样量由2支增加到6支将供试品由抗生素类药品、抗厌氧菌药品、抗真菌药品统一规定为有抗菌作用的药品并统一操

7、作只是在加入阳性对照菌时根据供试品的特性加入不同的菌液，在冲洗时没有统一规定冲洗次数及冲洗剂用量而以冲洗至阳性对照菌能生长为标准这就需要依靠经验来操作。阳性对照菌生长出来的时间规定为细菌2448hr真菌2472hr。在使用的仪器装置上既可使用传统的装配式滤器也可使用封闭式滤器后者是本次修订时新出现的仪器由于推荐使用的Y-型电脑集菌仪有三组培养基分别培养细菌、真菌和阳性对照因此相应的传统式滤器操作取出滤膜后分成三等份而改变了以往分为四等份。7阴性对照:中国药典95版的无菌检查法中规定取一支需厌气培养基作为阴性对照即可。这一规定明显欠准确既不能指示可能存在的细菌污染更无法在薄膜过滤法中对滤器、滤膜

8、、溶剂、冲洗剂等起到阴性对照的作用因此2000版对阴性对照做了更为准确的规定即应取相应溶剂稀释剂同时操作阴性对照与样品的唯一区别只是它不含供试品。第二讲 无菌检查的慨述一、无菌检查的定义及X围:无菌检查法是指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及药典要求无菌检查的其它品种是否无菌的一种方法一般来说凡直接进入人体血液循环系统、肌肉、皮下组织、创伤、溃疡等部位而发生作用的制品都要进行无菌检查。需要进行无菌检查的药品、敷料、器具的X围主要有以下几类:1各种注射剂:用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用的无菌水、溶媒和溶剂、还有输液和注射剂原料等。2眼用及外伤用制剂：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、

9、溃疡和烧伤等外科用药品制剂。许多国家对这类制剂规定为无菌，我国也基本如此，但中成药中含有生药原粉的这类制剂达不到要求，则以染菌限度要求。3植入剂：即用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、避孕药物、免疫药物及抗肿瘤药物等要求无菌的制剂。4可吸收的止血剂：如明胶发泡剂、凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种药物制剂。5外科用的敷料、器材等：如外伤用脱脂棉、纱布、结扎线、缝合线、可被吸收的羊肠线及一次性注射器、一次性无菌手术刀片、输血输液袋、博士伦、心脏瓣膜、以及金属和有机器材等。二、无菌检查的意义：由于微生物形体微小，适应能力强，因而它们在自然界广泛分布，与动植物共生，互惠互利，但也正因为它

10、们分布广泛，有时也给我们带来不利影响，就我们医药行业来说，外科手术时，如果手术器械灭菌不彻底，会造成伤口化脓感染；制药时如果灭菌不彻底，染菌药品进入人体后会引起一系列疾病，临床上发生因输染菌的葡萄糖造成败血症死亡的报道，国内外都有，因此人们很早就认识了药品微生物检验的重要意义，早在本世纪初就列入了检验要求项目，现在各国药典都对无菌检查X围、内容、方法、抽样有明文规定，以保证无菌用药的安全性。三、无菌检查的抽样：（一）抽样的意义：无菌检查的抽样，是指从一批产品中抽取一定数量单位的样品，作为检验样本的方法，各种要求无菌的药品在出厂前，应通过无菌检查，以保证产品的质量。但由于每批产品的数量众多，还由

11、于现有的知识及检测手段的限制，提供不了非破坏性确认批量产品中每一个最终制品的微生物质量的方法，因此通常只能从每批产品中随即抽取一定数量的单位产品，作为样本检验，以此结果来判断整批产品的质量。从理论上讲，无菌产品应是没有微生物污染的产品，但实际上，被称为无菌批的产品中，往往不是绝对无菌，而是有可能存在某种程度的污染，建立在概率论基础上的抽样方法不管多么完善，均存在风险，而这种风险随抽样量的增加而减少，随着微生物污染程度的降低而增大。假如一个批中有10的产品受到污染，从这个批中取一个成品样本做无菌检查，存在两种可能性，取到无菌样品或取到染菌样品，取到无菌样品的概率（P）为09，取到染菌样品的概率q

12、为01。则pq0901110如从这个批中取2个成品样本做无菌检查则存在三种可能，2个无菌样本，2各染菌样本，1各无菌样本和1个染菌样本，以三种可能组合的概率可按下式计算：（pq）2p22pqq2将p09q01代入即得p2081取得两个无菌样本的概率q2001取得两个染菌样本的概率2pq018取得1个无菌，1个染菌样本的概率因此，当样本数为2时，这个10染菌的批抽不到染菌样本的概率p2081抽到染菌样本的概率q22pq019。在无菌检查中，一个染菌批，设样本数为n，通过无菌检查的概率和这个染菌批被检查出来的概率为：pn（1-q）n通过无菌检查的概率（合格）1-pn1-（1-q）n检出批染菌的概率

13、（不合格）q系指批产品的染菌概率，与生产工艺提供无菌保证的能力有关。例：某产品的染菌率由下降到、，抽样样本数为，根据无菌检查判断批无菌的风险是升高还是降低？当时，通过无菌检查的概率（1-q）n1-03249当1时，通过无菌检查的概率（1-q）n1-01281当5时，通过无菌检查的概率（1-q）n1-0052903结果，根据无菌检查判断批无菌的风险升高，即误判为合格的概率由上升到3例2同一个污染水平下，增加无菌检查的样本数，无菌检查的可信度是升高还是降低，如10污染率，样本数为2、5、10。样本数通过概率可信度（不合格品检出率）n2时（1-01）28119n5时（1-01）55941n10时（1

14、-01）103565结果可信度提高即不合格品检出率提高。表1-1样本数、污染率与通过无菌检查概率的关系抽样数污染率qn2530570649416285241310-1810-21704710-2110-2210-2210-3001510-5210-6从以上分析看出，无菌检查是有局限性的，当无菌检查结果为符合规定时，其意义是相对的，对于无菌制剂，除加大抽样以提高无菌检查的可信度外，最根本的办法是严格执行GMP管理制度，加强生产环节的管理。（二）抽样的方法与抽样量：在抽样时，对产品的分批应特别注意。对无菌检查而言一个批量应以同一灭菌器的产品为一批，无菌制剂应以无菌灌装相同的最终容器，在连续不间断生

15、产，以不超过24小时的时间周期内的产品为一批，在连续生产过程中产品分别连续灭菌，如r-射线灭菌应以不超过24hr的总产量为一批，不同机器生产的，以各机的产品分批，不同班组生产的，应按班组分批，这样分批的意义是使各批号的产品具有均匀性，随即抽样时则有代表性。此外尚有其它管理方面的意义。以同一灭菌器中的产品分为一批时，应从不同部位抽取单位产品组成样本。连续生产过程中，应有不同时间抽样组成样本。抽样方法基本上可分为三种类型：1百分数抽样法：本法抽样是根据统计学概率的估算，确定随机抽样的数量，如按WHO于1975年建议的原则，英国药典1998版的抽样量（表2-2），按各批单位产品的数量确定每批的抽样量

16、，每批的抽样量为批量5左右，高者不超过20，低者可在2以下。2固定抽样法：每批样品皆抽取固定量的代表样品，而不论每批单位产品量的多少。3综合抽样法：很多国家规定的抽样法，常用上述两种综合形式的方法，即固定抽样法与百分数抽样法的综合抽样法，固定抽样法多在每批产品众多时采用。美国药典23版的无菌试验抽样量（表2-3）与前几版不同，取消了抽样方法的详细规定和表格，只规定为每种培养基需用的容器数，如容器药液装量在100ml以下，每种培养基接种自10个容器的规定药液，这是固定抽样法。中国药典（1995年版）无菌检查法规定的抽样量，采用固定抽样数，每批为2支（瓶）以上，但未规定每批的数量多少，这一抽样数量

17、较其它各国的抽样量为少，抽样量少无疑阳性检出率低，安全性差。2000版药典无菌检查的抽样量有了增加，并对生产厂的出厂产品加大了检验量，与国际接轨，但药检部门监督检查的量仍较少，与国际水平存在一定差距，仍有待提高。表2-2英国药典（1998版）抽样量的规定每批容器数（个）每种培养基检查的最小容器数（）或（个）注射剂100个10最少4100500105002最多30眼用及其它非注射用制剂2005最少220010单剂量容器的制剂按以上注射剂抽取大包装固体原料4全抽55020最少4502最少10表2-3美国药典23版抽样量的规定容器装量（ml）每种培养基接种的容器数量（个）10201050205010

18、02050100（静脉给药）101005001050010表2-4中国药典2000版药典出厂产品检验量每批产品数量/个每种培养基最底检验量注射剂10010或最少4个10050010瓶（支）5002或最多30个眼用及其它非注射产品2005或最少2个20010个桶装固体原料4每个容器55020或最少4个502或最少10个表2-5中国药典2000版药典上市抽验样品检验量供试品装量每管接种量/ml直接接种法薄膜过滤法接种取供试品数瓶培养基量/ml培养基量/ml支1以下或1全量25半量520205050100以下（静脉）全量100500全量500以上无菌粉针剂无菌粉末原料制剂最大规格份表2-6中国药典2

19、000版药典抗生素类药上市抽验样品检验量供试品装量薄膜过滤法接种培养基量取供试品数/支封闭式过滤器/ml薄膜过滤器/ml2ml以下25ml250ml50ml以上无菌粉针剂无菌粉末原料制剂最大规格量份第三讲培养基及培养基灵敏度试验一、无菌检查用培养基（一）细菌培养基：中国药典1995版所规定的硫乙醇酸盐液体培养基，与中国生物制品规程的规定一致，与国际上的英、美、日等国的药典规定也大致相同。由于细菌种类繁多，营养要求多样性，因此，要使单一的培养基适应各种细菌的生长要求是困难的，各国在修订药典时，对无菌检查用培养基也不断改进。现在采用的硫乙醇酸盐培养基，基本上适用于需气菌与厌气菌的生长要求，该培养基

20、的特点：提供氮源以及供合成蛋白质必须的各种氨基酸和簇维生素；胱氨酸、硫乙醇酸盐、葡萄糖均有降低氧化还原电位的作用，使深部氧化还原电位适合于厌氧菌的生长，同时硫乙醇酸盐有钝化含砷和汞类药物及防腐剂的有害作用；增添刃天青或美蓝作为氧化还原的指示剂，前者氧化时呈红色后者氧化时无色；少量琼脂有助厌氧环境的形成，防止因液体对流而迅速产生氧化。（二）真菌培养基：中国药典1995年版规定的真菌培养基，其处方为改良马丁培养基与中国药品生物制品规程1995版收载的真菌培养基是一致的。关于真菌用培养基，各国不尽一致。我国和日本国都规定适用于真菌和酵母菌的培养基，而英、美药典未明确规定专用的真菌培养基，仅指出大豆酪

21、蛋白消化培养基，该培养基适用于需气菌和真菌。（三）选择性培养基：对氨基苯甲酸培养基（用于磺胺类药物的无菌检查）吐温培养基（用于油剂药品的无菌检查）照需气菌、厌气菌培养基及真菌培养基的处方及制法各加对氨基苯甲酸0125g与吐温-8010ml摇匀后分装灭菌。（四）培养基测试：无菌检查用培养基无论是市售的脱水培养基或配制的培养基，灭菌后，应澄清无沉淀，此外，尚需进行如下实验：灵敏度试验、无菌试验、培养基用前检查。二、灵敏度试验：（一）菌种各国药典对无菌检查用培养基的质量，均规定用已知不同菌株做生长试验来监控。根据加入定量菌的生长结果评价所用培养基的灵敏度是否符合规定，合格者方能作无菌检查用。中国药典

22、与英、美药典规定的菌种（表3-1）需气菌有藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌；厌气菌有生孢梭菌；真菌有白色念珠菌和黑曲霉，加菌量皆在10100个之间。表3-1中、英、美各国药典培养基灵敏度检查所用的对照菌种培养基USP24BP98CP2000需气菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌藤黄微球菌铜绿假单孢菌铜绿假单孢菌枯草芽孢杆菌厌气菌生孢梭菌生孢梭菌生孢梭菌真菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉中国药典规定的培养基灵敏度试验菌种为藤黄微球菌、生孢梭菌、和白色念珠菌。藤黄微球菌是自然环境中常见的非致病菌，对营养要求较严格，生长较慢，作为需气菌的代表菌株较金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、

23、具有更多的优点。（二）细菌计数方法：（1）细菌标准浓度比浊法：取藤黄微球菌MicrococcusIuteus28001、白色念珠菌Candidaalbicans（98001）18小时左右的琼脂斜面菌苔，刮少许加至无菌生理盐水或缓冲液管内混匀，制成均匀的细胞悬液，取生孢梭菌不含琼脂的需气菌、厌气菌新鲜培养物，吸至灭菌离心管，离心，弃去上清液，菌体用09无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液，分别取其1ml加在空标准管内，与中国细菌标准浓度比浊管比浊，在细菌比浊图片纸上对比观察各种线条的透黑度，两者一致时表示浓度相当。如待测菌液浓度大（即透黑度低于标准管浊度时），可加无菌生理盐水调节使之最接近，记下所用的

24、生理盐水总量，然后根据标准比浊管所代表的各种细菌标准浓度（请看说明书）的每ml含菌数计算，即可得知待测菌液的近似浓度，并将其用无菌盐水或营养肉汤培养基稀释成每ml含菌10亿的菌液做为原液备用，临用前再将原液10倍稀释至10-7，每ml含菌大约100个（包括死菌在内），如欲知其所含活菌数，须按平板菌落计数法，取其1ml菌液加在熔化并冷至45的营养肉汤琼脂中混匀，倾注平皿，培养，计数菌落即可。按标准管比浊制成的10-7菌液，经验表明需气菌的活菌数，一般每ml均在50-100个之间。用营养肉汤培养基稀释的标准菌液，于冰箱保存，1周之内活菌数变化较小。（2）原菌培养液直接稀释法：取藤黄微球菌、生孢梭菌

25、、白色念珠菌的新鲜培养物少许，接种在相应的10ml液体培养基中，按规定的最适温度和时间培养后作为原菌液，然后取原液1ml用09无菌NaCl做10倍稀释，制成1ml含10100个菌并用平板法计数，在相同条件下，经多次测定证明后，稀释液可直接使用，不再测定活菌数。三）灵敏度检查将藤黄微球菌上述1或2的稀释菌液1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述1或2的稀释菌液1ml，分别接种至每管装量为ml的需气菌、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述（）或（）稀释液1ml接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管。以未接种的培养基管作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。结

26、果判定以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。培养基灵敏度试验操作示意图：藤黄微球菌生孢梭菌白色念珠菌取需厌气培养基的新鲜培养物真菌培养基的新鲜培养物1mlml1ml用09灭菌NaCl10倍系列稀释制成10100个/ml的菌液接种菌液每管1ml空白空白空白需厌气培养基需厌气培养基真菌培养基9ml12mlml按规定的时间培养5天结果判定：每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。三、无菌试验：将配备妥的培养基，按其用途分别置于3035培养48hr2025培养三天，均应无菌生长。如有菌生长需重新制备培养基，否则不能保证无菌检查结果

27、的可靠性，BP1998规定培养14天不得有微生物生长，这一规定是合理的。四、培养基的用前检查：需厌气培养基在临用前须作检查，培养基上部约1/101/5处呈现淡红色时可以使用，若淡红色部分超过1/高度时，应将培养基用水浴煮沸分钟，冷却至45以下时再立即接种检品，但用沸水加热法去除培养基内游离氧时，每批培养基只限加热一次，否则影响质量，全管呈现淡红色时，不得再用。第四讲阳性对照菌及抑细菌抑真菌试验一、阳性对照菌液的制备：阳性对照菌液是为供试品做阳性对照试验用，阳性对照试验是检查供试品对微生物生长有无抑制作用，以此作为评定检查方法的可行性的重要依据。因此常根据供试品的特性是抗需气菌、厌气菌或抗真菌选

28、取相应的阳性对照菌培养物，制备成菌液。金黄色葡萄球菌：斜面培养物营养肉汤3035培养1618小时生孢梭菌：斜面培养物需厌气培养基3035培养1624小时白色念珠菌：斜面培养物真菌培养基2025培养24小时分别取1ml菌液用09NaCl10倍系列稀释至含菌10100个/ml的菌液英国药典的阳性对照菌与培养基灵敏度试验所用的试验菌是相同的，中国药典规定的阳性对照菌株：金黄色葡萄球菌StaphylocociusaureusCMCCB26003生孢梭菌ClostridiumsporogenesCMCCB64941白色念珠菌CardidaalbicansCMCCB98001与培养基灵敏度试验所用培养基藤

29、黄微球菌MicrococcusluteusCMCCB28001生孢梭菌ClostridiumsporogenesCMCCB64941白色念珠菌CardidaalbicansCMCCB98001除需气菌菌株不同外，厌气菌和真菌菌株是相同的，金黄色葡萄球菌Staphylocociusaureus具有对抑菌物质较敏感，营养要求不苛刻，生长快的特点，作为抗需气菌药物的阳性对照是适宜的。二抑细菌和抑真菌实验：在用直接接种法无菌检查前，须对供试品的抑菌性有所了解。为此，可用如下方法测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用。用需厌气培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌均101

30、00个菌各两管，其中1管加规定量供试品，所有培养基管置规定的温度，培养35天，如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用，如加供试品的管与未加供试品的管对比，微生物生长微弱、缓慢、或不生长，均判为供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法（种入较大量的培养基中）或中和法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑菌性后，方可接种至培养基。抑细菌抑真菌试验操作示意图：金黄色葡萄球菌生孢梭菌白色念珠菌营养肉汤培养物需厌气培养基培养物真菌培养基培养物1ml1ml1ml用09灭菌NaCl10系列稀释制成10100个/ml的菌液接种：接种菌液接种规定量供试品需厌气培养基15ml真菌培养基15ml培养：按规定的温度培养35天结果判定：（1）如培养基各管24小时内微生物生长良好则供试品无抑菌作用。（2）如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢、或不生长，均判为供试品有抑菌作用。第五讲 检查法一、直接接种法：本法适用于非抗菌作用的药品。1准备好培养基（合成的或自配的）