胶回收方法全攻略.docx

1、胶回收方法全攻略胶回收方法全攻略说到电泳凝胶的片断回收，想来在实验室久已的“老手”们都会不屑一顾。确实，一般在各个和分子 生物学沾到一点边儿的实验室里，从琼脂 糖凝胶中回收DNA，仅仅是一种简单不过的常规实验操作。虽说早期的凝胶电泳 片断回收没有12个小时是搞不定的，每个实验室也有自己的独门秘诀，可后来各大品牌纷纷推出了了多种不同用途，不同价钱的快速凝胶回收试剂盒，一下子将 胶回收的时间缩短到10多分钟，操作也大大简化，胶回收就变成“小菜一碟”了。然而，从bbs逛上一圈下来，发现实际上还是有不少人为胶回收这种看似简单 的操作而烦恼。到底是什么导致了实验新手，甚至是老手在这个已经发展近40年的常

2、规性实验中卡壳由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验比 如酶切连接、转化筛选、测序 或者PCR 扩增、标记乃至显微注射等等，为大家搜罗各种产品和方法的优缺点，注意事项，做一个胶回收全攻略篇。一、胶回收的关键参数胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂，最基本的评定标准无外乎这么几个:质量( 回收产物的纯度和浓度)，回收效率，操作方便(速度)，柱子的载量等等。回收产物质量：回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中，普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，会强烈抑制后 继的连接、酶切、或者

3、标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断，产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。对于大片断DNA回收，质量还包括了产物的完整与否，如果机械剪切力使得回收产物大小不一致，后果决不是你希望碰见的。而对于较小片断回收，质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小，对后继实 验同样也有影响，比如连接、标记实验等等就很不爽，往往不得不再浓缩一次，增加了操作的复杂性。此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会 对结果产生致命的影响。回收率：回收得率，是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少，电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失，因而尽可能多的回收电泳凝胶条 带中的目的片断，

4、提高产物得率，对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关，比如DNA片断越大，和固相基质的结 合力越强，就越难洗脱，回收率就低;又比如说，DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。因此，根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于 样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的。其他：操作方面，相信大家都会比较喜欢操作简单，快速，应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂，可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便 的设计;离心过柱就比离心沉淀要简单方便。载量，就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了，因为对于

5、纯化柱或者一定量的纯化介质，过量的 产物吸附不了就是被浪费掉的。难免有时你需要回收比较大量的产物，大载量就很有优势同一个片断你要用2个柱子，多郁闷啊。二：胶回收方法和分类20世纪70年代是一个奠定现代分子生物学的时代，1973年冷泉港实验室的Joseph Sambrook和Phillip Sharp发明了利用琼脂糖凝胶分离DNA和EB染料观测DNA相结合的技术。现在，琼脂糖和聚丙烯酰胺 凝胶电泳是分离、鉴定和纯化核酸和蛋白质片断的标准方法。生物通将在后面另文讨论聚丙烯酰胺 凝胶电泳片断回收的方法，这里首先介绍的是琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法：1.柱回收试剂盒：可谓目前最简单快速的回收方法，

6、只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再 洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧 就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。2.玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒：这个方法比前面的方法更为灵活，可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量， 也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样，将电泳凝胶的条带切下，Buffer溶解，(区别在于这里)加入纯化填料填料吸附混合，快速离心沉淀去上清，

7、洗涤沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脱液纯化介质中吸附的片断释放出来，离心，取上清，就是回收的产物。这个方法适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回 收，但是操作就较前者复杂一些，涉及到多次离心沉淀和取上清，有可能会误吸了微量的沉淀;另外干燥的程度也有点技巧，干过了不好洗脱，没干透又影响结果。 后来的改进版本有将混合了纯化介质后的凝胶溶解液加入到一种离心过滤柱上，这种柱子不带纯化填料，只有一层过滤膜，离心过滤后，填料在柱子里，溶液被甩 掉，这样就避免了上述的问题。3.低熔点琼脂糖：传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀

8、。这个 方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现在用的人已经不多了。想当年经费紧张的时候，低熔点琼脂糖贵，不舍得这么浪费的，比较取巧省钱的 法子就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再将那块家伙切出来，就可以非常非 常节约了。除了直接酚抽低熔点琼脂糖凝胶，还有人用琼脂糖酶来消化琼脂糖凝胶，条件也相当温和，只是那酶价格并不便宜(光那酶的成本就少5-6块，还不算 其他的麻烦事)，多数的酶只适合用低熔点琼脂糖，问题是我不用酶也可以直接酚抽，费时间还特长，所以，并不觉得特别好用。后来据说T家的琼脂糖酶可以用于 常规琼脂

9、糖，前提是你有办法在65度把那胶化了。但那需要极好的耐心。我们后面会有介绍。后来有老师从美国回来了，才有机会尝试更好的低熔点琼脂糖 FMC(现在叫做Cambrex了)的GTG级别低熔点琼脂糖!那才是最简单的方法呀!洗的超级干净的电泳槽 灌胶，电泳后，直接将条带切下65度保温融化，就可以直接在融化的琼脂糖DNA混合物中加酶进行后继实验所谓的GTG就是遗传技术级，可以在凝胶中进行各种酶反应的哦!实验条件非常温和，非常适合大片断的回收。4.透析带电洗脱法。烦，简直不堪回首。切下的条带放在充满TAE的透析带中再电泳一段时间，让DNA走出凝胶，走向溶液中，再反向电泳一会儿，将附在透 析带上的DNA赶回溶

10、液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后传统方法酚抽沉淀，那块胶通常还要再染色看看残留。由于绑透析带非常难搞，只有在 万不得已的非常大的片断时才会考虑的。也是丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。后来看到以色列的一个小公司GeBA有出简易透析管(生物通早在02年就 有新技术专栏文章介绍的)，就是将小指管两边各开一小窗，贴上透析膜，把胶块放在管中再电泳。由于不需要绑透析带，使用方便;而且管中溶液体积小，容易处 理;膜的面积也小吸附也少;顿时觉得是救星。后来貌似Pierce也推出了类似的东西，买起来更方便一点。纤维素膜纸片法和其他改良法。早期实验室最常用方法之一。将DEAE纤维素膜裁成小条活

11、化处理。电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的 DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有 DNA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难。曾经常用的另一方法是在电泳胶前挖小槽，加入缓冲液，电泳一小会 儿，手提紫外监视，等条带进入槽中，还没在另一头上岸时停止电泳，吸出溶液酚氯仿抽提(加点甘油可降低DNA在溶液中的移动速度，防止那边还没全部下水， 这边就已经上岸了的情况。当然也可以挖大点的孔或者多吸几次，反正是要沉淀的，体积大些不要紧)。不过这些方法在柱回收试剂

12、盒推出后都渐渐要淘汰了。毕竟 比较麻烦费时间，而且回收的产物纯度也不比试剂盒前者是纯化介质吸附DNA后彻底除去溶液，经过洗涤残留在纯化介质上的杂质，最后洗脱;手工的方法多 是用酚氯仿抽提溶液后乙醇沉淀，由于有些多糖沉淀属性和DNA相似时就容易共沉淀下来。鉴于竞争的日趋激烈,纯化试剂价格逐渐向下,连核酸纯化领域的顶级 名牌Qiagen也开始大幅度的折扣优惠,所以,有条件还是选择试剂盒,比自己慢慢摸索要更能节约宝贵的青春。所以，这里准备将回收片断按照大小不同来分 别介绍不同用途的产品：常规片断级(DNA片段为100bp-10kb)：主流方法是柱回收试剂盒大片段级(DNA片段7kb)：可选方法是玻璃

13、奶/纯化填料胶回收试剂盒，电洗脱小片段级(DNA片段Millipore回收范围：100bp-10kb推荐指数：价格指数：特点：. 时间短：10分钟spin. DNA保存完整. 试剂盒包括做为过滤装置的凝胶喷雾器(nbulizer)、离心瓶和TAE gel extraction buffer使用心得：这一款胶回收试剂盒不同于之前提到的凝胶回收方法Montage利用的是从凝胶中抽取(compression)DNA片段的方法：通过离心力解离凝 胶的结构，驱使琼脂糖在gel nebulizer中穿过小孔，这样形成的胶泥就被甩进样品过滤盖中。因此无需其它多余的操作，直接将切下来的凝胶放进去，经过5000

14、g/10min， 即可得到回收DNA片段(见下)。回收率见下：Typical DNA Recoveries from Agarose GelsDNA Size (bp)Percent DNA Recoveries10078700711000772027474361359416322313029Millipore先进的膜技术使得Millipore纯化系列其实在自动化高通量 领域有相当好的口碑，价格实惠质量可靠。4.经济实惠的国产之选在普通级胶回收中应该提及的是一些国产品牌，毕竟在现今胶回收技术成熟并得到了广泛应用的基础上，一些国产品牌也提供了经济实惠的胶回收试剂盒，比如天 根，杭州维特洁，深圳天

15、地人，等等。低廉的价格，使得平时用起来也挥洒自如不心疼，如果说进口产品打开的实验自由化之门，那么跟进的国产产品则实实在在让 国内科研经费紧张的实验室也能分享简化实验的快乐，穷人的孩子也有春天。在国内，价格还是最有杀伤力的。天为时代已经被Qiagen收购并改名天根，而在 国产品牌中口碑很好的维特洁也被Axygen收购。生物通在这里列举了部分国产产品的对比，当然，要注意参数是厂家提供的，标准有差别的。品牌天根(天为时代)杭州维特洁(已被Axygen收购)深圳天地人Omega产品普通琼脂糖凝胶回收试剂盒AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒小量胶回收试剂盒琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段大小100bp-1

16、0kb75bp-10kb50bp-20kb回收率80%(100 bp的DNA片段回收率为50 %以上)6085%(根据长度不同)85%产品描述可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从TAE或TBE琼脂糖凝胶上回收DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及 寡核苷酸引物等杂质。采用优化的试剂和方便的DNA制备管，适合从各种电泳凝胶(TAE或TBE)中提取多至8 ug线性DNA。独特的缓冲液体系，在保证凝胶完全融化的同时，防止了DNA片段的损坏和降解。纯化后的DNA保持完整的生物活性，适用于多种用途:如连 接、体外转录、PCR、测序、微注射等分子生物学研究。应用:

17、酶切,连接,PCR等用途样品: 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段时间: 15分钟结合能力:25μg洗脱体积:30-50μ价格50包装270元200包装980元约5元/反应50包装350元250包装1570元约7元/反应50包装160元100包装240元200包装380元500包装750元约3元/反应50包装299200包装1100约6元/反应(Q-spin)大片段级：指的是片段大小超过10kb的DNA片断，由于越长的DNA分子和纯化膜的结合力越强，洗脱力越差，在离心过柱时可能被“扯断”，因此常规的离 心过柱的方法并不适合对付这些大家伙。在凝胶电泳的大片断回收，特别是几十kb的大片断，经

18、典方法是生物通前文提到的电洗脱。此外，低熔点琼脂糖和琼脂糖 酶消化也是常常有人选用的方法，新兴的方法是用玻璃奶或者纯化填料，生物通在此一并介绍。其实无论用什么方法，在回收大片断时一定要牢记你对付的是大片 断，操作时一定要小心注意，粗暴的操作，最后结果也是自己来承受的。这些方法中，速度最快的就是玻璃奶或者纯化填料珠的试剂盒了。毕竟，谁愿意为一个小小 的胶回收浪费2个多小时呢有那功夫干点别的不好我最早用的其实是当时的Pharmacia(后来改为Amersham，现在是GE Healthcare Life Science s)的一个玻璃奶(Glassmilk)试剂盒。现在记得Glassmilk的人应

19、该不多了，在当时却是我们眼中的神奇宝贝半个多小时就可以完成本来 要搞2个多小时的活：溶胶液溶胶后，加入10ul混匀的玻璃奶溶液，混匀静置吸附后，离心去上清，再清洗12次，干燥，最后用洗脱液洗脱，离心取上清即 可。 II产地：Qiagen回收范围：40bp-50kb推荐指数：价格指数：(150次反应2,106，500包装4,860，约14元/反应，半价活动开始以来，这个试剂盒的性价比就很高啦)特点：. 通用性高：一般或者低熔点琼脂糖凝胶，TAE或TBE，以及聚丙烯酰胺凝胶. 无NaI干扰后续实验. 大片段DNA保存较好，不会被剪切使用心得：这个试剂盒不同于Qiagen其它的胶回收试剂盒，利用的是配合高离液盐(chaotropic salt)的silica-gelparticles