DNA提取实验报告.docx

1、DNA提取实验报告生物学大实验(二）实验名称:质粒扩增、提取和鉴定实验实验目的 通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作,加深对分子生物学基本技术的理解和掌握.实验仪器设备:电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性 而质粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的dn

2、a系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。当对提取的质粒dna进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。实验步骤：一 质粒扩增（1）普通lb固体培养基制备：制备lb培养基,倒入灭菌瓶中高压灭菌,待完全冷却后，保存备用。（2）将大肠杆菌接种于lb培养基中,37振荡培养过夜(200转/分）二 质粒dna的提取（碱法)1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中, 12000rpm离心一分30秒,弃去上清液,以得到较多的细菌沉淀；2、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上,使离心管底部的液体流尽。3、 加入100l用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5

3、分钟。4、 加入200l现配的溶液ii,盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免dna断裂），使混合物混匀,冰浴510分钟。5、 加入150l预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液iii中，冰浴5分钟.6、 取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4，12000rpm离心10min.7、 弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后,加 入预冷的1ml 70%乙醇。8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽,置dna干燥510分

4、钟.9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥.10 、 将沉淀溶于34lte缓冲液或灭菌水（ph8.0）中，储于20冰箱中三dna酶切反应1、 将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管（最好0。5ml）编号,用微量移液枪分别加入dna（l)和相应的限制性内切酶反应10缓冲液2l,将管内溶液混匀后加入0。5l酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加.使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡

5、沫塑料板上），37水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。3、 每管加入2l0。1mol/l edta（ph8。0），混匀,以停止反应，置于冰箱之保存备用。四 dna的琼脂糖凝胶电泳1、 取5tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5tbe稀释缓冲液，待用。2、 胶液的制备:称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中，加入300ml 0。5tbe稀释缓冲液,加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化,取出摇匀，此为1琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发.3、 胶版的制备:想冷却至5060的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(eb）溶液使

6、其终浓度为0.5lg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀,速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5tbe稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面4、 加样：取20l的酶解液与2l10载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿5、 电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80v，电流在40ma以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳6、 观察和拍照五 实验结果六 实验结论通过本次试验加深了对分子生物

7、学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果.结果显示，第三条中酶切效果良好，rna被降解的很完全，第四根没有被酶切,质粒dna跟rna同时存在，出现了两条亮带,质粒dna跟rna分离效果较好。本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项:（1) 取出梳子之前,一定要耐心等待琼脂糖凝胶的凝固,拔梳子是一定要手稳，而且要垂直拔出；（2） 点样要细心，枪头不要碰到凝胶，以免点样枪刺破凝胶；（3） 电泳时，电极一定要连接正确(4） 染色剂溴化乙锭是强诱变剂,有致癌性和强毒性，使用时一定要带一次性手套，使用后废液不可不可随意丢弃。生物科学 071班 姓名：刘欢 学号:20

8、073305篇二：dna的提取和电泳实验报告基因组dna的提取和电泳(实验五）实验报告一、实验目的了解dna提取的方法,以及琼脂糖凝胶电泳分析dna技术。二、器材和试剂1.器材水平琼脂糖电泳仪，离心机，水浴锅，研钵，离心管、移液枪、水稻幼苗等2.试剂1.1mol/l tris.cl（ph8。0) 的配制：称取12。11g 的tris,置于80 ml的ddh20，加入浓盐酸(约4.2 ml），调节ph值至8.0，定容至100 ml。2.0.5 mol/l edta（ph8.0)的配制:18.61g na2edta2h2o，加入80 ml的ddh2o，用naoh颗粒调ph值至8。0（约需2 g），

9、定容至100 ml。3.提取缓冲液的配制: 100 mmol/l tris。cl(ph8.0）， 20 mmol/ledta, 500 mmol/l nacl，1.5%sds4. 80/4/16氯仿:异戊醇:乙醇5. 6？loading buffer：0.15溴酚蓝，0.15%二甲苯青ff，5 mmol/l edta，50甘油三、实验步骤1.在15ml的离心管中加入5ml的提取缓冲液，60水浴预热。2.植物叶12g，剪碎，在钵体中加入石英砂，加入预热的提取缓冲液，磨成粉末状,60水浴保温20 min，其间不时缓慢摇动。3.5000 rpm离心5分钟，仔细吸取上清液至另一离心管中，4.加入5 m

10、l 氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止皮肤损伤），室温下静置5-10分钟,使水相和有机相混匀。5.室温下离心5000 rpm离心5分钟。6.仔细吸取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状沉淀。7.离心5000 rpm，离心5 min，弃去异丙醇，室温晾干。8.视沉淀多少，加入1ml左右ddh2o溶解，可在60水浴中放置15分钟以上助溶。9.取dna样品5 l，加入1 l6？loading buffer，混匀,加入0。7的琼脂糖凝胶加样孔中，电泳，检测dna的分子大小。4、实验结果和讨论实验分析：本次实验由于种种原因我是和植保102班的同学一起做的，

11、我们组3人，实验过程比较严谨，受到了老师的表扬,实验结果也很令人满意.下面是实验过程中的注意点:1、研磨不能太久太用力，会导致dna片段断掉.2、实验室的某些试剂，如氯仿，有毒性，应带手套进行.电泳的时候不知是时间的原因还是都做得不错，结果相差不是很远（如上图），第五组和第六组是我们的,第六组是我自己加的。实验过程中要耐心细心，这样才能得到满意的结果。园艺101石颖20100107011篇三:浙大生化实验报告dna的提取实验报告课程名称: 生化实验甲 指导老师： 成绩：_ 实验名称：植物基因组dna的提取 实验类型： 生化定性实验 同组学生姓名： 及纯度与含量的测定 一、实验目的和要求(必填）

12、 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握植物基因组dna的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组dna结果的初步分析； 4、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 5、学习并掌握紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量的方法。 二、实验基本原理 植物基因组dna的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（ctab）法、十二烷基硫酸钠 (sds）法。十六烷

13、基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚,从而使dna得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性,并使抽提液分相，因核酸（dna、rna)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使dna沉淀，沉淀dna溶于te溶液中,即得植物基因组 dna溶液.由于植物中的次生代谢产物-多酚类化合物可介导dna降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及dna聚合酶等分子生物学酶类的生物活性.传统的ctab-dna提取法步骤多，较烦琐，dna产率低，而且由于酚很难完全去除

14、，容易影响以后的酶切等工作的效率.sds法操作简单，温和，也可提取到较高分子量dna，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响dna的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类）对dna的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。本实验采用十二烷基硫酸钠 (sds）法提取植物基因组dna，基因组dna提取后， 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组dna分子量大小、纯度；用紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量。dna的琼脂糖凝胶电泳鉴定:dna分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。dna分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它

15、在电场中向正极移动.在一定的电场强度下,dna分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的dna片段泳动速度不同.dna片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（eb)染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定dna片断在凝胶中的位置.紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量核酸dna和rna所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质,它们在260nm处有最大的吸收峰.因此，可以用260nm波长进行核酸含量的测定.波长为260nm时，dna或rna的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1g / ml时，dna钠盐的od

16、2600.02.当od2601时，双链dna含量约为50g / ml单链dna含量约为37g / mlrna含量约为40g / ml寡核苷酸含量约为30g / ml（由于底物不同有差异）1、核酸样品dna、rna含量的测定:如用1cm光径石英比色皿，用 h2o稀释dna或rna样品n倍并以h2o为空白对照，根据此时读出的od260值即可计算出样品稀释前dna的含量：dna（g/l）=50od260读数 dna样品稀释倍数/1000rna(g/l）=40od260读数 rna样品稀释倍数/1000若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。

17、当dna样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响dna吸光度的准确测定.由于 dna在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处.所以，一般情况下同时检测同一样品的od260、od280和od230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。2、核酸样品纯度判断的一般标准： dna纯度:od260/od2801。8，表示为纯的dna；od260/od280 1。9,表示有rna污染；od260/od280 1.6，表示有蛋白质、酚等污染. rna纯度：1。7 od260/od2802.0，表示为纯的rna；od260/od280 1。7时，

18、表示有蛋白质或酚污染;od260/od280 2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。 od230/od260的比值应在0。4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在.若样品不纯,则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和pcr的效果。三、实验材料与试剂1、实验材料：植物幼嫩叶子2、实验试剂（1)基因组dna提取缓冲液（2）氯仿：异戊醇:乙醇抽提液（3）te缓冲液(4）平衡酚:（5）rna酶a（6）酚/氯仿（7)氯仿/异戊醇（8）异丙醇、无水乙醇、70乙醇。(9） 3mol/l naac(10） 5tbe缓冲液（11） 6电泳上样缓冲液（

19、12) 1。0%琼脂糖凝胶（13) eb（14） dna分子量markers:125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.（15） ddh2o；四、实验器材与仪器1、研体2、离心机、离心管（7ml、5ml）及离心管架；3、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头；4、恒温水浴箱65 5、制冰机；6、冰箱;7、恒温水浴箱 37;8、微波炉；9、电泳仪及电泳槽;10、紫外检测仪.11、紫外分光光度计;12、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul)。（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna1、制胶（1琼脂糖凝胶)（此

20、步骤由实验室老师准备)在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖,置于250ml锥形瓶中，加100ml 0。5tbe电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至5060后，加入eb，使其终浓度为0.5mg/l，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后,放入电泳槽中，倒入适量0.5tbe（刚好淹过胶面)，拔去梳子备用。（注：eb为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作）2、加样取5ul纯化的dna原溶液样品，与1ul 6电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔,勿带入气泡)。若dna含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要换枪头

21、以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。3、电泳加完样后，盖上电泳槽盖,立即接通电源，使电压调到100v，恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需3060min）。4、观察和拍照取出胶块置于紫外灯下观察，dna存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。(注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。 紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量将提取的植物基因组dna样品吸取20ul,加到新的5ml离心管中，再加一定量的ddh2o 或te缓冲液（ph 8.0）稀释100倍，用0。5cm光径石

22、英比色皿(约需1.6ml样品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nm、260nm、280nm处的吸光度.计算植物基因组dna样品溶液的dna的含量以及dna样品的纯度.六、结果与分析(一)这是电泳后得到的照片，其中从右往左数第七条带为我所做样品的基因组。（二）紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量1、植物基因组dna样品溶液的dna的含量：dna（g/l ）=959.328ng/ul2、植物基因组dna样品溶液的dna的纯度:od260/od2801.97od230/od2602。073、样品纯度判断： od260/od280 1.8，表示为纯的dna； od260/od280 1

23、。9，表示有rna污染； od260/od280 1。6，表示有蛋白质、酚等污染。由od260/od2801。97可知，样品含有rna杂质.七、讨论、心得注意事项：影响dna泳动速率(迁移率）的因素有： dna分子质量的影响：双链dna分子迁移的速率与dna分子量对数成反比。分 子量越大，迁移率越小。 dna构型的影响：超螺旋dna线状dna开环dna 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为12； 电场强度的影响:电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压，(一般5v/cm）（电场强度) 。而对于大片段电泳，

24、甚至用0。51.0v/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 eb的影响：溴化乙锭（eb）插入双链dna造成其负电荷减少、刚性和长度增加. 电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用tae、tbe、tpe三种缓冲系统，但它们各有利弊.tae价格低廉,但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。tpe在进行dna回收时，会使dna污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用tbe缓冲液。在缓冲液中加入edta，可以鳌合二价离子,抑制dnase，保护dna。缓冲液ph常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电,向正极移动。 碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大在dna提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：

25、（1）dna的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性，因此抽提时避免使用变性的条件。（2)抑制内外源dnase的活力。dnase就象一把刀，它能把大分子的dna切成碎片,所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节ph,使偏碱（ph8.0）；c、抽提液中加表面活性剂;d、加螯合剂(edta）除去酶的铺助因子（mg2+）,使酶活性丧失。（3)防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使dna降解，一般综合考虑，取ph8.0左右为宜。（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，dna分子

26、特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使dna断裂,所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数,也不要剧烈摇动。(5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用.因此,一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取dna的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，dna含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的.由结果可知,在加入rna酶的时候可适当多加一点,以免造成得到的dna样品含较多rna杂质。篇四：dna提取实验报告注：1、报告内的项目或内容设置，可根据实际情况加以调整和补充。2、学生提交实验报告时间为实验

27、后10日内.篇五：dna提取及pcr扩增实验报告pcr扩增及dna琼脂糖凝胶电泳刘琳 1131428 环境科学一、实验目的1学习并掌握pcr扩增的基本原理与实验技术。2对扩增后的dna进行琼脂糖凝胶电泳试验,并分析相应结果。二、实验原理1.pcr扩增多聚酶链反应（pcr）技术的原理类似于dna的天然复制过程.在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板dna、四种脱氧核苷酸（dntp)、耐热taq聚合酶及两个合成dna的引物，而后加热使模板dna在高温下(94）变性,双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度,使合成引物在低温(55）与模板dna互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度

28、升至中温（72），在tap酶作用下,用四种dntp为原料，引物为复制起点,模板dna的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复,在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和dna合成这一循环,使产物dna重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物dna可作为后一循环的模板dna而参与dna的合成，使产物dna的量按指数方式扩增。经过3040个循环，dna扩增即可完成。2.dna琼脂糖凝胶电泳实验dna分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,dna分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。dna分子的迁移速度与其相

29、对分子量成反比。不同构型的dna分子的迁移速度不同.该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用dna分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。三、实验材料仪器:pcr扩增仪、0。2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪.试剂： tapdna聚合酶、dntp、buffer、两种引物、16s全长dna样本、无菌ddh2o、模板dna 、tbe、琼脂糖、eb、显色剂.四、 实验步骤1.pcr扩增本次试验选择细菌16s rdna v3区片段进行扩增。1.1.根据计算，首先取1。5ml离心管按照2.5ul 10buffer 、1 ul dnt

30、p、0。5 ul 341gc、0。5 ul 534、0。125 ul taq、19。375u ddh2o的比例配置足量的pcr反应体系。1.2.分别向9个薄壁管中分别加入24 ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddh2o作为阴性对照。1.3.将薄壁管放入pcr扩增仪中，按照预定程序进行pcr扩增。其中循环过程需要达到3040次。程序如下：预变性： 94 3min循环： 94 变性30s55 退火30s72 延伸30s末次延伸：72 5min1.4.pcr扩增完成后，将样品取出并保存于15环境中。2.dna琼脂糖凝胶电泳实验3.1称取0.2g琼脂糖粉末,放到一锥

31、形瓶中，加入适量的0.5tbe电泳缓冲液.然后置微波炉加热至完全溶化,溶液透明。摇匀，待冷却至60左右,在胶液内加入适量的eb.2。2 取有机玻璃制胶板槽,在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面.2.3 待胶凝固后，小心拔起梳子,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。2.4 在槽内加入0.5tbe电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面。取1l缓冲液和5l待测dna样品混合后,用移液枪滴加至凝胶的加样孔中.2.5 接通电泳仪和电泳槽,并接通电源,调节稳压输出，电压最高不超过5v/cm,开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。2.6 观察溴酚兰的带（蓝色)的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。2。7 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。五、实验结果与讨论如图所示：从左至右，分别是模版1-8号,第9列为阴性