基因工程在番茄育种中应用.docx

1、基因工程在番茄育种中应用摘要：文章简单介绍了基因工程的概念，特点及其意义，并对基因工程在番茄 抗虫害，抗病害，抗除草剂，抗逆性，雄性不育，改善番茄品质和终结种子育 种上的原理，应用级研究进展进行了综述，同时探讨了基因工程在番茄育种中 存在的问题，解决方法和发展前景，并且对基因工程在番茄育种中的应用进行 了简单总结与概括。关键词：基因工程；番茄；育种基因工程是指用人工方法把不同生物的遗传物质分离出来，在 体外进行切割、拼接，然后按照人们的意愿重新组合成重组体，再 把重组体放回到宿主细胞内进行大量复制，并使遗传信息在新宿主 细胞或个体中高效表达，最终获得基因产物。这种人工创造新生物 并给与生物新功

2、能的过程称为基因工程，或称为分子水平上的遗传 工程。基因工程又称作DNA体外重组技术。这种DNA分子的新组合克服了 固有的生物种间的限制，扩大和带来了定向创造新生物的可能。这 是基因工程的最大的特点。此外，基因工程还已经深入到细胞水 平、亚细胞水平，特别是基因水平来改造生物的本性，同时大大的 扩大了育种的范围，打破了物种之间杂交的障碍，加快了育种的进 程。1学科起源基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于 20世纪70 年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在 基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物 的遗传物质 -DNA 大分子提取出来，在离体条

3、件下用适当的工具酶 进行切割后，把它与作为载体的 DNA 分子连接起来，然后与载体一 起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其 中 安家落户 ，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新 的育种技术。这个定义表明，基因工程具有以下几个重要特征：首 先，外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物 种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生 物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重 要特征。第二个特征是，一种确定的 DNA 小片段在新的寄主细胞中 进行扩增，这样实现很少量 DNA 样品拷贝出大量的 DNA ，而且 是大量没有污染任何

4、其它 DNA 序列的、绝对纯净的 DNA 分子群 体。科学家将改变人类生殖细胞 DNA 的技术称为 “基因系治疗 (germlinetherapy),通常所说的基因工程”则是针对改变动植物生 殖细胞的。无论称谓如何，改变个体生殖细胞的 DNA 都将可能使其 后代发生同样的改变。据统计至少已有 35个科 120多种植物转基因获得成功,其中包括番 茄、辣椒、茄子、马铃薯等一批重要的蔬菜作物。番茄作为一种蔬 菜作物,在基因工程拓宽种质资源上得到了极大的发展。一方面是 因为它栽培广泛；另一方面是因为它在遗传理论上的研究较为深 入,为基因工程的拓宽研究打下了坚实的基础。迄今，利用基因工程进行番茄品种特性

5、改良的研究取得了很大的进 展，已经获得抗虫害、抗病毒病、抗真菌病、抗除草剂、抗逆、延 长贮藏期、改善风味和雄性不育转基因番茄。文章概述了利用基因 工程技术进行番茄育种的研究进展。1.番茄抗虫基因工程 由于常规育种方法在抗虫育种中难以在短时间内奏效，因此，育种 家近年来把抗虫育种的重点放在利用基因工程选育抗虫新品种上， 且取得了重大进展，尤其是在番茄等蔬菜上。1.1Bt 毒蛋白基因 在蔬菜抗虫育种中，苏云金杆菌晶体毒蛋白 (Bt) 基因应用最为广 泛，不同类的 Bt 基因具有不同的杀虫谱，其抗虫机制是诱导细胞膜 产生非特异性小空，扰乱细胞的渗透平衡，引起细胞膨胀，裂解， 最后导致昆虫死亡。最早是

6、美国 Monsanto公司研究人员1987年报 道的将 Bt.Kurstaki HD-B 缺失的 CryIAd 导入番茄，转基因植株对 烟草天蛾、烟草夜蛾、番茄果蝇螟显示出了不同的抗性。大田实验 结果证明，在转基因番茄两个株系上的虫害可得到有效的控制。印 度的Mandaokar A D等通过子叶外植体与农杆菌共培养，将 Bt基因转入番茄，PCR佥测及Southern杂交分析证明，目的基因已被整合 到番茄的基因组中，抗性实验及酶联免疫分析结果显示，外源毒素 水平可占总可溶性蛋白的0.04%0.41%，外源基因表达水平高的转 基因植株对番茄螟虫的幼虫的致死率可达 100%，外源基因表达水平低的转基

7、因植株对番茄螟虫幼虫也有不同程度的抗性。同时 T。代转基因植株自交得到的Ti进行抗虫实验，结果表明，部分 Ti代对番茄 螟虫仍具有较高的抗性。 Vander 等将修饰的毒蛋白基因 CryIA(b) 和 CryIC 转入番茄中，从而产生对甜菜夜蛾、烟草夜蛾的抗性。 Jansens 等通过转 CryIA(b) 基因得到抗番茄钻心虫的转基因植株。 Rhim等将毒蛋白基因和能与内毒素抗体发生交叉反应的一种 74000u蛋白质的基因整合转化番茄，转化植株能抗马铃薯甲虫的幼虫。梁 小友将抗病毒的CMV-C基因和抗虫的Bt-toxin基因依次插入植物 表达载体上，以土壤农杆菌介导转化番茄，并证明得到表达。

8、目前已经有近 i80 个经过改造的 Bt 基因被克隆和测序，经过改造的 Bt基因，其抗虫效果比改造前的提高 100多倍。Crickmore等将这些已经克隆的基因划分为 30大类， CryI 基因作用于鳞翅目昆虫， Cry H基因作用于鳞翅目和双翅目昆虫， Cry皿基因作用于鞘翅目昆虫；CryW基因作用于双翅目昆虫，现已经导入了很多植物中，包括 番茄、马铃薯、青花菜、结球甘蓝、白菜、菜心等。i.2淀粉酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因主要有两类，一是来源于小麦，一是来源于 菜豆(BAAI)。将BAAI导入豌豆中，抗豆象(Callosobruchus spp.) 的能力增强了。这种淀粉酶抑制剂是通过阻

9、断幼虫中肠的进食而起 作用的。 Williamson 等将野生番茄品种的抗线虫基因 Mi 转入普通 番茄中，转化的植株能抗根结线虫i.3凝集素凝集素是另外一大类通过抗虫基因工程改造的昆虫毒素蛋白家族， 也叫做糖蛋白 (Glycoprotein) 。近年来比较关注的一种凝集素来自 雪花莲(Galanthus nivalis , GNA它能抵抗蚜虫的侵害。通过基因 工程的方法在多种植物中 (如马铃薯，番茄，油菜 )等已经成功的表 达了这种编码凝集素蛋白的基因。这种蛋白的一个重要特性就是能 组织昆虫在植物上的穿刺和吸吮树汁，但不利的方面是只有当凝集 素的表达量很高的时候才起作用，如在昆虫食物中需要含

10、毫克级的 量才能进行生物学鉴定。吴昌银等通过根癌农杆菌，采用叶盘法将 雪花莲外源凝集素基因导入番茄，获得了含 GNA基因的43株转化植 株。抗蚜虫实验证明，转基因番茄具有一定的抗蚜虫能力，同时证 明了所导入的外源基因在后代中稳定遗传。目前，虽然已经克隆了 许多凝集素基因并在转基因植物中得以表达，但是杀虫性能依然很 低。2.番茄抗病基因工程2.1番茄抗病毒基因工程 在抗病基因工程中，抗病毒基因工程进展最快，取得的成果最 多，尤其是通过导入病毒外壳蛋白基因 (cp) 获得的抗病毒蛋白基因 植株方面，获得了很多转基因蔬菜作物，其作用机制是利用原无毒 的病毒外壳蛋白抑制病毒的复制。华盛顿大学 Powe

11、ll 等通过植物基 因工程技术，首次将烟草花叶病毒 (Tobacoo Mosaic Virus,TMV) 外 壳蛋白(Coat protei,cp) 基因转入烟草和番茄，培育出能稳定遗传 的抗病毒植株。随着研究工作的不断深入，发现马铃薯 丫病毒、烟 草蚀纹病毒(Tobacco EtchVirus , TEV)、马铃薯卷叶病毒(Potato Leaf RollVirus , PLRV和番茄斑萎病毒(Tomoto Spotted WithVirus, TSWV)缺失的不完整的外壳(缺失AUG密码子)或者黄瓜 花叶病毒外壳基因的反义基因整合到植物染色体上后，能使转基因 植株获得很好的抗性，甚至达到完

12、全免疫。抗病毒型可通过自交稳 定的遗传给子代，Tumer等用苜蓿花叶病毒(Alfalfa Mosaic Vitus AIMV)外壳蛋白基因序列转化的番茄植株作实验，其自交后代对 AIM V感染表现出高水平的保护抗性。除此外壳蛋白基因外，将病毒基因反义 RNA卫星RNA病毒复 制酶基因和来源于植物的抗病毒基因导入植物都取得了一定的进 展。卫星RNA是依赖于病毒才能复制的一类低分子量的 RNA它能 干扰病毒的复制和使症状减轻。赵淑珍利用 CMVS星RNA-1 的 cDNA单体基因转化番茄，接种实验发现转基因番茄的症状减轻，田间实 验也表现了对CMV勺抗性。此外，人们还利用其他的抗病毒基因获 得了转

13、基因番茄，姜国勇等双抗表达载体的构建及番茄的转化鉴 定，利用天然花粉蛋白基因(TCS)和GUSS因偶联，通过农杆菌介 导，获得了 TCS-GUS6因双双表达的再生植株，转基因植株对 TMV 和CMV匀表现出较高的抗性。现在，人们还试图从病毒蛋白基因、 核酸裂解酶基因、病毒复制基因等方面寻找更好的抗病毒新途径。2.2番茄抗真菌和细菌基因工程 番茄的真菌病害种类较多，且影响面积大、农药防效差、产量损失重，因此培育抗真菌病害的品种显得尤为重要。抗真菌的植物 基因工程目前正处于基因分离与鉴定阶段，已鉴定出几丁质酶基因、（3 -萄聚糖酶基因等。Logemann等从烟草中分离出I级几丁质 酶（1.5%4.

14、0%可溶性蛋白）和H级3 -I , 3萄聚糖酶（0.1%2.0%可 溶性蛋白 ） ，将其在转基因番茄中同时表达，显著提高了植物对尖镰 孢菌的抗性，在胡萝卜中也得到了类似的结果。这是因为几丁质酶 和3 -I ， 3 萄聚糖酶可分别催化几丁质和 3 -1 ， 3 萄聚糖的水解反 应，这两类物质是许多真菌细胞壁的主要成分，其结果导致真菌生 长受阻。此外，植保素对某些真菌病害是有毒的，不同的植物产生 不同的植保素，真菌对非寄主植物产生的植保素很敏感，目前已经 鉴定出了 200多种植保素，其中研究的最深的是类黄酮与类萜类植 保素，从葡萄中分离出的3，4X, 5 -三羟芪合成酶基因导入烟 草后，转基因植株

15、与对照相比表现出对灰霉病 （Botryitis cinerea） 更强的抗性。转基因番茄对灰霉病和早产疫病 （AIternaria soIani） 的抗性都比对照强。在抗病番茄基因工程的研究中，也做了一些抗细菌病害的研究 工作。 TansIey 等从秘鲁番茄中克隆出抗细菌斑点病病菌的基因 pto ，该基因编码的产物是色氨酸 / 苏氨酸激酶型的蛋白质，可与该 菌非毒性基因产物作用，转 pto 基因的番茄植株能抗细菌斑点病。3.番茄抗除草剂基因工程 在现代农业中，除草剂在控制杂草的生长繁殖方面起着重要的 作用，已经用于农业生产的除草剂至少有 180种，通过使用除草 剂，大大提高了劳动效率。利用基因

16、工程技术培育抗除草剂植物主要有两种策略：修饰除草剂作用的靶蛋白促使其过量表达或者对 除草剂不敏感，以便植物吸收除草剂后能正常生长发育，这类基因 有抗草甘膦、磺酰尿类、均三氮苯类的阿特拉津除草剂基因。导 入解毒蛋白基因，降解除草剂分子，这类基因有乙酰 CoA 转移酶基 因 (bar) 、 2，4-D 单氧化酶基因 (TfdA) 和腈水解酶基因 (bxn) 等。3.1修饰除草剂的靶蛋白 草甘膦是目前使用最广泛的非选择性有机磷类除草剂，能有效抑制 76种杂草，草甘膦通过抑制细胞中 5-烯醇丙酮酰莽草酸 -3- 磷 酸合成酶(EPSPS)舌性发生作用，当除草剂草甘膦与该酶结合时，阻 断了芳香族氨基酸的

17、合成，细胞中缺少芳香族氨基酸，导致植株死 亡，EPSPSS因突变体产生对草甘膦的抗性。Fillatti 将aroA突变 基因经农杆菌转入番茄，获得了抗草甘膦的转基因植株。实验结果 表明转基因植株及后代可耐受有效浓度为 0.84kg hm-2的草甘膦。 Bedbrook等将烟草SURB-Hra基因导入番茄、甜菜、油菜、苜蓿、 生菜、甜瓜，获得不同程度的抗磺酰脲除草剂的转基因植株，一些 转基困烟草植株在田间喷施 32g - hm-2的药量下无毒害出现，而对照 野生型植株在8g hm-2的药量已经出现毒害。3.2解毒蛋白草丁膦 (G1ufosinate) 除草肽和 Basta( 商品名 )属于同一类

18、有机 磷类除草剂，其作用机理是抑制谷氨酰胺合成酶 (GS)的活性，使细 胞内氨离子含量积累，引起叶绿体降解并导致植物死亡。 Murakami发现潮霉菌(Hygroscopicas)中的bar基因编码的乙酰CoA转移酶具 有使草丁膦代谢失去活性的功能，将 bar 基因导入番茄中，当叶片 乙酰CoA转移酶表达量达到叶蛋白总量的 0.0001%的水平，转基因 番茄就能抗草丁膦除草剂。4.番茄抗逆境基因工程 世界性的寒冷、高温、干旱、水涝、盐渍、土壤、水质和空气 污染以及农药、除草剂的残留等，构成了植物的生存逆境，它们对 农业生产破坏性极大。解决这些问题的途径，除了改善生产条件和 控制环境污染以外，改

19、变植物使之适应环境即进行抗逆育种是一条 经济有效的途径。4.1 抗干旱和盐碱 干旱和盐碱对植物生长影响的共同特点是渗透胁迫。植物抗渗 透胁迫的基因工程在于调节渗透压分子及其基因相关的研究上。Singh 首次从耐盐烟草细胞中分离出相对分子质量为 26ku 酸性蛋白 质，其含量高达细胞总蛋白的 12%以上，后来，在番茄、马铃薯、 小麦、大豆、胡萝卜、棉花和水稻中都发现了与烟草 26ku 渗透蛋白抗血清有交叉反应的蛋白，其相对分子质量均在 26ku左右。一些植物在受到盐胁迫和病原体等侵犯时，体内的草酸氧化酶大量积累， 并能通过其催化的反应产物H2Q,诱导促使植物的系统抗性增加。 根据这一原理， De

20、ssalegne 等将草酸氧化酶基因转入番茄中，得到 的转基因番茄在盐胁迫情况下其产量高于对照。4.2抗寒Hightower 等利用农杆菌将比目鱼体内的抗冻蛋白基因转入番茄， 发现转基因番茄不但稳定转录 AFP的mRNA还产生一种新的蛋白 质。这种转基因番茄的组织提取液在冰冻条件下能有效阻止冰晶的 增长。转基因植株经温室鉴定，抗冻能力明显提高。这是首例由基 因工程提高番茄抗逆性成功的报道。此外抗冻蛋白也研究的较多。 在南极或者北半球高纬度海域中生活的一些鱼类如美洲黄盖鲽鱼 (Pseudopleuronectusamericanus) 、床杜父鱼 (Myoxocophalusscorpius)

21、等具有很强的抗寒性，这与这些鱼的血液 中存在的抗冻蛋白有关。黄永芬等采用花粉管和子房注射将美洲拟 鲽afp基因转入番茄，转基因植株的致死温度比对照降低 2C。5.番茄雄性不育基因工程 雄性不育系的获得最初主要是利用自然变异和人工选育。随着 花粉发育分子生物学研究的深入和基因工程技术的发展，人们开始 利用基因工程的手段来创制植物的雄性不育系。其基本策略是通过 导入外源基因，在特殊启动子的调控下，干扰、抑制花粉的正常发 育或表达毒性基因破坏花粉发育，来获得雄性不育系。 1915年， Crane首次在番茄上发现雄性不育现象， Mariani将P-TA29特异启动子和糖核酸酶基因 Barnase 连接

22、导人番茄，培育出雄性不育的工 程植株，为杂交制种提供了方便。张宏等首先获得了番茄的基因工 程雄性不育株。他们利用 TA292 barnase 基因，用根癌农杆菌介导 法，以子叶为受体，获得了番茄的雄性不育转基因植株。番茄雄性不育基因工程作为一个近几年发展起来的新兴技术， 还不够成熟。但随着理论研究的深入和技术上的发展，这些缺陷必 将得以解决。同传统获得雄性不育技术相结合，基因工程技术将会 在番茄育种中发挥更为重要的作用。6.改变番茄成分来提高番茄品质的基因工程 对于不同蔬菜作物品质的要求是不一样的，归纳起来主要是蛋 白质成分、淀粉和糖类含量、脂肪酸组分、维生素水平和果实成熟 期等。目前，番茄品

23、质研究已经取得了较大的进展， Oeller 等将 ACC合成酶cDNA勺PtACC2反向插入表达载体并转化番茄，转基因 番茄果实内乙烯合成降低 99.5%。果实在自然条件下不能成熟、无 香味、不变红、不变软、在外源乙烯勺处理下，番茄果实能成熟。 首次商业化应用勺改良转基因食品是 1994年美国 Calgene 公司开发 勺转基因晚熟番茄“ Flavr Savr ”，这种番茄能够在货架上摆放 2 周以上不变软。7.终结种子基因工程终结者技术 (Terminator technology) 是在有限勺时期内终止种 子勺生育能力或者可育性勺技术，其中相关勺基因被称为终结基 因。这项技术是专门针对一些

24、已知勺并可用来终结控制植物在第 1 代或者以后几代中特定性状表达勺基因。终结者技术原理在于应用 合适勺致死基因导致第 2代种子不育。终结者技术应用了 3种具有 不同作用勺基因：致死基因、重组酶基因、可抑制基因。据报道， 通过终结种子基因，对细胞进行遗传修饰，植株可以采用组织培养 的方法进行繁殖。当第 l 代种子成熟以后，经过某种化学物质 ( 如四 环素)处理才通过市场出售给农民。结果这些种子在农民的田间可以 正常萌发成健壮的第 2 代植株。当第2代植株开始产生种子时，在晚期胚胎发育阶段， LEA启动子被激活，导致大量的核糖体失活蛋白合成，从而反馈抑制细胞 中蛋白质合成的机器一核糖体，结果产生的

25、第 2 代种子不可育。这 些种子可以被用作粮食，但是不能萌发成植株。这一技术依然处在实验性阶段，最可能出现在棉花、番茄、马 铃薯和大豆等植物的转基因种子或者杂交种子中。8.番茄转基因育种存在的问题及展望 基因工程在蔬菜遗传育种、品种改良上的应用前景十分诱人， 但从总体上看，转化成功的作物种类尚少，而且由于存在基因沉默 (Gene silencing) 现象，转基因的表达水平不高，尤其在 F1 和 F2 植 株上表达不高甚至差异很大。基因沉默主要是转化基因的多拷贝、 甲基化和重组。另一个问题是一些转化基因的组成型表达导致植物 生长发育受到一定程度的影响。因此目前转基因工程的主要任务是 寻找阻止基

26、因沉默的有效途径和发展可诱导的启动子，开发更多有 重要应用价值的目的基因，建立高效的再生和转化系，完善多种转 化技术等，以达到蔬菜生理抗病虫的目的。目前，番茄的基因转化研究已由单一性状向多性状转化，并且 向生产医药保健品的方向发展。我国国家基因工程中心已获得高抗 TMV CMV马铃薯X病毒和抗早疫病、晚疫病两种真菌病害的番茄。随着植物基因工程的发展，植物体可望用于生产异源蛋白，如疫苗、酶、激素等，用这种方法可省去昂贵复杂的细胞培养和发酵 等常规生产步骤，且由植物生产的抗原作为食物时引起的人体免疫 应答比注射疫苗产生的反应要强。分子标记技术的发展促进了多种 生物物种基因的定位与克隆工作，为有目的

27、地寻找和发掘番茄内外 源基因工作奠定了基础。随着转基因技术的深入发展和转基因植物 的安全性进一步得到保障，番茄基因转化必将更好的弥补传统育种 方法的不足，促进蔬菜新品种改良的进步和发展。参考文献：1王琴芳，薛爱红，黄大。转基因植物产业化现状与发展趋势J.中国农业科技导报.2000 (2): 332-3362许亦农，麻密主译 .植物生物技术导论 M. 北京：化学工业出 版社， 2005:337-335.3梁小友， M 景久，朱玉贤，等，双抗(抗病毒机抗虫)植物表达载体的构建及番茄的转化鉴定J.植物学报，1994,36 ( 11): 849-854.4吴昌银，叶志虨，李汉霞，等。雪花莲外源凝集素基因转化番茄，植物学报， 2000,42(7): 719-723.5王傲雪，李景富。转基因番茄的机理及现状。辽宁农业科学， 1998.33-36.6XX文库。课程论文学院 农学院专业 农学 班级姓名 阿曼古丽卡德尔江 学号农学091班093131107