植物生理学实验讲义2doc.docx

1、植物生理学实验讲义2doc实验一 植物组织渗透势的测定（质壁分离法）实验目的：观察植物组织在不同浓度溶液中细胞质壁分离的产生过程及其用于测定植物组织渗透势的方法。原 理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。该溶液的浓度称为等渗浓度。当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的溶液浓度。代入公式即可计算出渗透势。器材与试剂：1显微镜 、载玻片及盖玻片、镊子、刀片2100mL浓度为1mol/L蔗糖溶液: 用蒸馏水配成0.1、0.15、0

2、.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mol/L的蔗糖溶液各50mL。称34.23g蔗糖用蒸馏水配成100ml，其浓度为1mol/L（母液）。再配制成下列各种浓度：0.50mol/L：吸母液25ml+水25ml0.45mol/L：吸母液22.5ml+水27.5ml0.40mol/L：吸母液20.0ml+水30.0ml0.35mol/L：吸母液17.5ml+水32.5ml0.30mol/L：吸母液15.0ml+水35.0ml0.25mol/L：吸母液12.5ml+水37.5ml0.20mol/L：吸母液10.0ml+水40.0ml0.15mol/L：吸母液7.5ml+

3、水42.5ml0.10mol/L：吸母液5.0ml+水45.0ml3实验材料 洋葱鳞茎实验步骤：1 将带有色素的植物组织（叶片），一般选用有色素的洋葱鳞片的外表皮、紫鸭跖草、苔藓、红甘蓝或黑藻、丝状藻等水生植物，也可用蚕豆、玉米、小麦等作物叶的表皮。撕取下表皮，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，510分钟。2 从0.5mol/L开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。3 实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓度，和不引

4、起质壁分离的最高浓度。4 在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。将结果记录下表中。测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平均值之后，可按下列公式计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。为细胞渗透势。R为气体常数=0.083105/LP/molK。T为绝对温度，单位K，即273+t，t为实验湿度。I为解离系数，蔗糖为1。C为等渗溶液的浓度，单位为mol/L。则： =0.083105(273+t)1C作业与思考题：1 绘制细胞质壁分离前后的细胞图。2 计算植物细胞的渗透

5、势。实验二 植物组织水势的测定（小液流法）实验目的：了解植物组织中水分状况的另一种表示方法及用于测定的方法和它们的优缺点。实验原理：植物组织的水分状况可用水势来表示。植物体细胞之间、组织之间以及植物体与环境之间的水分移动方向都由水势差决定。将植物组织放在已知水势的一系列溶液中，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势），则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。组织的吸水或失水会使溶液的浓度、密度、电导率以及组织本身的体积与质量发生变化。根据这些参数

6、的变化情况可确定与植物组织等水势的溶液。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度的变化，然后根据公式计算渗透势。仪器药品：试管、毛细滴管、移液管、剪刀、镊子、甲烯蓝、菠菜叶片操作步骤：1首先配制一系列不同浓度的蔗糖溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L）各10 ml注入8支试管中，各管都加上塞子，并编号。按编号顺序在试管架上排成一列，作为对照组。2另取8支试管，编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。然后由对照组的各试管中分别取溶液4ml移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞子。3用剪刀将菠菜叶剪成约0.5cm2大小相等

7、的小块6080片。向试验组的每一试管中各加相等数目（约10片）的叶片小块，塞好塞子，放置30分钟，在这段时间内摇动数次，到时间后，用大头针沾取少许甲烯蓝粉末加入每一试管中, 并振荡, 此时溶液呈蓝色。4用毛细滴管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许，然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部，缓慢从毛细滴管尖端横向放出一滴蓝色试验溶液，并观察小液滴移动的方向。如果有色液滴向上移动，说明溶液从细胞液中吸出水分而被冲淡，比重比原来小了；如果有色液向下移动，则说明细胞从溶液中吸了水，溶液变浓，比重变大；如果液滴不动，则说明试验溶液的密度等于对照溶液，即植物组织的水势等于溶液的渗透势。记录液滴不动的

8、试管中蔗糖溶液的浓度。重复测定一次。按计算水势。式中为细胞水势。作业与思考题：3 计算植物细胞的水势。4 为什么蓝色试验液滴不动说明试验溶液的密度等于对照溶液?实验三 叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定（纸层析法）实验目的：了解叶绿素提取分离的原理以及它们的光学特性在光合作用中的意义。实验原理： 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮提取。并可根据它们在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同, 将它们彼此分离开。 分离色

9、素的方法有多种，纸层析是其中最简便的一种。当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合物中各成分在两相（即流动相和固定相）间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的混合物得到分离。器材与试剂：大试管、台天平、研钵、量筒、烧怀、漏斗、软木层、新华滤纸；丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、碳酸钙、石英砂操作步骤 1称取新鲜叶子2 g，放入研钵中加丙酮 5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮 5 ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。2取准备好的滤纸条（宽2 cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，如图。 3用毛细管取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶

10、液不可过多。如色素过淡，用电吹风吹干后再点1一2次。4在大试管中加入四氯化碳35ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。5经过0.5一1小时后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。6、铜代反应 取上述色素丙酮提取液少许于试管中, 1滴1滴加浓盐酸,直至溶液出现褐绿色, 此时叶绿素分子已遭破坏, 形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许, 慢慢加热溶液, 则又产生鲜亮的绿色。此即形成了铜代叶绿素。作业与

11、思考题：1 绘制叶绿体色素的柱层析图谱2 提取叶绿素时为什么要加入少量CaCO3, 加多了会出现什么问题?实验四 叶绿素 a和b含量的测定（分光光度法）实验目的：熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。实验原理： 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠；在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。如图叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在 663nrn，叶绿素 b在 645nrn，吸收曲线彼此又在重叠。根

12、据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系：A1=Caka1+Cbkb1A2=Caka2+Cbkb2式中：Ca为组分a的浓度，gL。 Cb为组分b的波度，gL。 Al为在波长1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。 A2为在波长2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。 kal为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为 1g/L时，于波长1时的吸光度A值。 kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1gL时，于波长2时的吸光度A值。ka2为组分a（浓度为1 g/L）在波长2时的吸光度A值。 Kb1为组分b

13、（浓度为1 g/L）在波长1时的吸光度A值。从文献中可以查得叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：波长（nm）叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入上式（1）、（2），则得：A663=82.04Ca+9.27CbA645=16.75Ca+45.60Cb经过整理之后，即得到下式：Ca=0.012 7A6632.69A645 (3)Cb=22.9A6454.68A663 (4)CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645 (5)（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算

14、出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度。注：一般大学教学实验室所用的人光光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽值要比中级类型的751型大得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差了。根据公式计算往往会得到叶绿素ab值小于1，这就不很奇怪了。除向学生说明其中原因外，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致。校正可用纯的叶绿素a和b进行，分别在波长650670nm和630650nm之间，每隔12nm测定叶绿素a或b的吸光度A，以确定叶绿素a和b的吸收峰的波长。如果测得

15、的峰值与文献上的峰值663nm和645nm不同，可按照仪器说明书步骤进行校正，或者更方便的方法可以打开仪器盖子，松动波长刻度盘紧固螺丝，调节刻度盘使波长至正确值，而后旋紧螺丝复原仪器。为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的用量是很少的，用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含0.5%丙醇的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿素的叶绿素b，注意剪时尽量避开有可能遭污染的地区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和b。器材与试剂

16、：1 高级型分光光度计, 离心机, 台天平, 剪刀, 研钵, 漏斗,移液管2 实验试剂 丙酮, 碳酸钙3 实验材料 菠菜叶片实验步骤：1. 色素的提取 取新鲜叶片, 剪去粗大的叶脉并剪成碎块, 称取0.5g放入研钵中加纯丙酮5mL, 少许碳酸钙和石英砂, 研磨成匀浆, 再加80%丙酮5mL，将匀浆转入离心管, 并用适量80%丙酮洗涤研钵, 一并转入离心管, 离心后弃沉淀, 上清液用80%丙酮定容至20mL。 2. 测定光密度 取上述色素提取液1mL, 加80%丙酮4mL稀释后转入比色杯中, 以80%丙酮为对照, 分别测定663nm、645nm处的光密度值。 3. 按公式绿素a+叶绿素b的浓度。

17、再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。注意事项：1由于植物叶子中含有水分, 故先用纯丙酮进行提取, 以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。2由于叶绿素a、叶绿素b的吸收峰很陡, 仪器波长稍有偏差, 就会使结果产生很大的误差, 因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。作业：计算叶绿素a和叶绿素b的浓度实验五 过氧化物酶活性的测定比色法实验目的：熟悉测定过氧化物酶活性的常用比色法及灵敏度较高的化学发光法及其测定原理。实验原理：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，此产物在470 nm 处有最大光吸收值，故可通过测4

18、70 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。器材与试剂：1.实验仪器：分光光度计、离心机、秒表、研钵、天平2. 实验试剂 （1）100mmol/L 磷酸缓冲液（pH=6.0）：0.2M的Na2HPO412.3mL和NaH2PO487.7mL混合后稀释2倍（2）反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0) 50ml于烧杯中，加入愈创木酚28l，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19l，混合均匀，保存于冰箱中。3. 实验材料 任何植物材料实验步骤：（1）粗酶液的提取 称取植物材料1g, 加20mmol/LKH2PO4 5mL, 于研钵中研磨成匀浆

19、, 以4000r/min离心15min, 收集上清液保存在冷处, 所得残渣再用5mLKH2PO4 溶液提取一次, 合并两次上清液。（2）酶活性的测定 取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL（或加热煮沸5 min 的酶液），作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上在波长470nm下测量吸光度值，每隔0.5min（30S）读数一次，连续读数3次。结果计算：以每分钟内A470变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（U）式中：A470反应时间内吸光度的变化； W植物鲜重（g）；t反应时间（

20、min）；VT提取酶液总体积（mL）；VS测定时取用酶液体积（mL）。注意事项酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。作业：计算过氧化物酶的活性。实验六 种子活力的快速测定红墨水染色法 种子成熟采收之后, 由于贮藏的条件不合适, 往往会使种子的品质变劣,影响种子的发芽、幼苗的健壮生长, 最终影响产量。这是由于贮藏条件不利,使细胞的结构和生理功能受到损害所致。以下几种方法, 能快速测定种子的正常生理代谢功能是否受到损害, 胚是否存活, 以了解种子是否还具有发芽的潜力。实验目的 熟悉种子活力快速测定的各种方法。实验原理 凡生活细胞的原生质膜具有选择性吸收物

21、质的能力, 而死的种胚细胞原生质膜丧失这种能力, 于是染料便能进入死细胞而染色。器材与试剂 1. 实验仪器 恒温箱, 烧杯, 培养皿, 漏斗, 镊子 2. 实验试剂 5% 红墨水 3. 实验材料 大麦、小麦、籼谷或粳谷的种子实验步骤 1. 浸种 将待测种子在3035温水中浸种米5h,粳谷2h)。 2. 染色 取已吸胀的种子200粒, 沿胚的中线切为两半, 将一半置于培养皿中, 加入5%红墨水，染色后倒去红墨水, 用水冲洗多次, 至冲洗液无色为止。检查种子死活,凡种胚不着色或着色很浅的为活种子; 凡种胚与胚乳着色程度相同的为死种子。可用沸水杀死的种子作对照观察。 3. 计数种胚不着色或着色浅的种

22、子数, 算出活种子百分率。作业：1、 计算活种子百分率。2、 思考还有其他的什么方法可以测量种子的活力。实验七 赤霉素 3的生物鉴定（水稻幼苗第二叶叶鞘伸长的“点滴法”）实验目的 学习并掌握利用水稻幼苗第二叶叶鞘伸长的“点滴法”测定赤霉素3)的方法，了解赤霉素对叶鞘伸长的作用实验原理赤霉素能刺激幼嫩禾本科植株的节间伸长。将GA3 点滴于水稻胚芽鞘与第一叶之间，在一定的浓度范围内，第二叶叶鞘的伸长与赤霉素浓度的对数成正比。通过测定第二叶叶鞘伸长来进行赤霉素含量的生物测定。器材与试剂 1. 实验仪器 光照培养室、移液管, 洗耳球, 高压灭菌锅, 小镊子, 刻度尺, 移液枪 2. 实验试剂 饱和漂白

23、粉溶液, 琼脂, 500mol/LGA3 母液（称取8.6mgGA3 (GA3 相对分子质量:346.38)溶于少量无水或95%乙醇中，再用水湿稀释至50ml；用蒸馏水稀释母液配制0.1、1、10、100mol/L的标准溶液） 3. 实验材料 水稻种子实验步骤 1. 水稻灭菌30min（饱和漂白粉溶液）, 自来水冲洗。将种子置于垫有滤纸的培养皿中, 加水淹没种子,在30培养箱中黑暗萌发2d, 此时大部分种子开始露白。 2. 配制0.9%的琼脂, 高压灭菌, 倒入直径9cm的培养皿中。 3. 选取芽长2mm左右的种子, 胚芽朝上且偏于一侧排放在培养皿中的琼脂上, 每皿30粒。在30、光强5000

24、-10000lx的培养箱或培养室中, 连续光照培养, 注意保持湿度。 4. 2d后, 选取刚伸出第二叶叶尖的幼苗（苗长0.9-1.0cm ) 。用微量移液器将1L不同浓度的GA3 标准溶液分别小心滴于幼苗的偏于一侧的胚芽鞘与第一叶叶腋间与第一叶之间, 主意要使小液滴正好停留在胚芽鞘与第一叶之间，不使滑落, 如小液滴滑落, 立即拔除这株幼苗。 5幼苗继续培养3d后, 测定第二叶叶鞘长度6. 以GA3 标准浓度的对数与叶鞘长度绘制标准曲线, 可以看到在一定浓度范围内, 第二叶叶鞘的伸长与GA3 浓度的对数成比例。 将待测溶液处理后测得的叶鞘伸长数值, 在标准曲线上查得其相应的GA3浓度, 即算得样

25、品中GA3 含量。注意事项：1. 用GA3 处理幼苗时, 一定要使液滴停留于胚芽鞘和叶腋间。2. GA3 母液的配制要精确, 稀释也要准确。作业：1、 绘制GA3 标准浓度的对数与叶鞘长度绘制标准曲线。2、 分别采用小麦和水稻为实验材料，比较和分析实验结果。实验八 植物体内丙二醛含量的测定实验目的：熟悉测定丙二醛（MDA）含量的常用方法实验原理：植物器官在逆境条件下或衰老时, 往往发生膜脂过氧化作用, 丙二醛是其产物之一, 通常将其作为脂质过氧化指标, 用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。 在酸性和高温的条件下, 丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二

26、醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5三甲基恶唑2、4二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中丙二醛(MDA)时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组 织中铁离子的含量为100300gg-1D

27、W-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3的终浓度为0.5nmol L1 。在532nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。 器材与试剂：1. 实验仪器 分光光度计, 离心机, 研磨器, 恒温水浴, 具塞试管，电炉。2. 实验试剂 10%三氯乙酸, 石英砂,硫代巴比妥酸（TBA）溶液（用10%TCA配置0.6%的TBA溶液）3. 实验材料 植物叶片。实验步骤：1. MDA的提取 冬天寒流刺激，植物为抵抗严寒，丙二醛含量会增加，取叶片1g将其剪碎, 加入10%三氯乙酸（TCA）2ml和少量石英砂，研磨；进一步加入8mLTCA充分研磨, 匀浆液以4000g离心10min,

28、上清液即为样品提取液。2. 显色反应及测定 吸取2mL提取液, 加入2mL0.6%TBA液, 混匀,在试管上加盖塞, 置于沸水浴中沸煮15min, 迅速冷却, 离心。取上清液测定532nm和450nm下的OD值。对照管以2mL水代替提取液。 3. 计算 MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532nm，TBA与可溶性糖（以蔗糖为例）的反应产物的最大吸收峰在450nm，吸收曲线彼此又有重叠。根据Lambert-Beer定律, 最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液, 它们的浓度C与OD值之间有如下关系OD1 = Caa1 + Cbb1OD2 = Caa2 + Cbb2式中: OD1 为组分a和组分b

29、在波长1 时光密度值之和; OD2 为组分a和组分b在波长2 时光密度值之和; Ca 为组分a的浓度 Cb 为组分b的浓度 a1、b1分别为组分a、b在波长1 处的摩尔吸收系数。同理, 组分a、b在波长2 处的摩尔吸收系数分别为a2、b2。已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm的摩尔吸收系数分别为85.40、7.40； MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收, 吸收系数为0, 于532nm波长下的摩尔吸收系数为155000。据OD450 = C185.4OD532 = C17.4+155000C2 求解方程得:C1=0.01171OD450C2=6.4510-6OD 532 -0.5610-6OD450式中: C1 为可溶性糖与TBA反应产物的浓度，单位是mol/L; C2 为MDA与TBA反应产物的浓度，单位是mol/L。 根据公式 C2, 然后再计算每克样品中丙二醛的含量mol C2/100)作业：1、 计算植物叶片丙二醛的含量。2、 分别采用两种不同植物叶片（菠菜和小麦）为实验材料，比较和分析两者的结果。