浅论壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞的抑制作用.docx

1、浅论壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞浅论壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞的抑制作用的抑制作用 浅论壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞的抑制作用【摘要】目的：观察壳聚糖对白血病细胞的作用。方法：以不同浓度的壳聚糖处理白血病细胞 K562后，运用 RT PCR 方法检测实验组 K562细胞中多肽：N 乙酰氨基半乳糖转移酶 2mRNA表达差异。另用不同浓度的壳聚糖分别作用于白血病 K562细胞和 SHI 1 细胞，MTT法检测壳聚糖对两种细胞的相对抑制率。结果：与阴性对照组比较，实验组 K562细胞的 ppGalNAc T2表达降低，且随壳聚糖浓度升高，表达量

2、进一步减少；MTT实验显示不同浓度的壳聚糖对 K562细胞和 SHI 1 细胞均有抑制作用，并呈浓度依赖性。结论：壳聚糖对肿瘤细胞有一定的抑制作用，同时还可以减少ppGalNAc T2在 mRNA 水平的表达。【关键词】多肽：N 乙酰氨基半乳糖转移酶 2；壳聚糖；RT PCR；白血病细胞 Abstract Objective:To observe the effect of chitosan on leukemia cells(K562,SHI 1).Methods：The leukemia cells were treated by different concentration of ch

3、itosan.The expression of ppGalNAc T2 on K562 cells were determined by RT PCR method.The leukemia cells were treated by different concentration of chitosan，and the relative inhibition rate was determined by MTT assay.Results：With adding the chitosan to compare with the negative group,the expression o

4、f ppGalNAc T2 in the experimental group K562 cells reduced,and had the inverse ratio with the chitosans concentration.In the MTT assay,the chitosan with various concentrations had the inhibitory action on the K562 cells and the SHI 1 cells.Conclusion：The chitosan suppressed the K562 cells and the SH

5、I 1 cells multiplication,and its action advanced along with the concentration.Chitosan influenced the expression of ppGalNAc T2 in leukemia cell K562 reduced its expression quantity.Key words ppGalNAc T2;chitosan;RT PCR;leukaemia cell 壳聚糖化学名：N 乙酰 D 葡萄糖胺是甲壳素经脱乙酰化得到的产物，又名甲壳胺、脱乙酰壳多糖等，是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有良好

6、的生物相容性和生物可降解性，在体内能被溶菌酶等降解，降解产物能完全被人体吸收，无毒副作用1。近年研究表明壳聚糖及其衍生物有抗肿瘤和增强机体免疫功能作用。杜昱光等2发现壳寡糖在体外可抑制肝癌、宫颈癌、白血病和 S180 腹水癌等多种癌细胞的生长，并抑制肿瘤细胞的 DNA合成，在体内壳寡糖可抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长其生存期。本实验以慢性髓源性白血病细胞 K562的多肽：N 乙酰氨基半乳糖转移酶 2 作为研究对象，对不同浓度壳聚糖作用 48 h后的白血病细胞 ppGalNAc T2 的 mRNA表达变化进行探索，同时利用 MTT法检测壳聚糖对 K562和急性单核细胞白血病细胞SHI 1 的相对

7、抑制率，为壳聚糖作为抗肿瘤辅助药物提供依据。1 材料与方法 材 料 壳聚糖胶囊由中科院大连化学物理研究所馈赠，RPMI 1640 培养基为美国 Gibco产品，Taq DNA聚合酶,dNTP MIX 为 MBI公司产品，MTT购自 Sigma公司，PCR 仪为美国 MJ 产品，酶联免疫检测仪为 Bio Tek 产品。壳聚糖的配制 从壳聚糖胶囊中获得壳聚糖，用无血清培养基配成相应浓度。细胞的培养与处理 白血病细胞 SHI 1 由苏州大学附属第一人民医院血液研究所提供，K562 细胞由本教研室复苏后常规培养检测 ppGalNAc T2表达 反转录 cDNA反应体系 六碱基随机引物 1 l；ddH2

8、O12 l；2510 min 预热；细胞株 RNA 5 l；dNTP MIX 1 l；上下颠倒混匀并离心，655 min；迅速置于冰上至少 1 min，再加入 5 first band 缓冲液 5 l；反转录酶 1 l；上下颠倒混匀并离心，4250 min，7020 min，3720 min 后进行 PCR 反应。扩增 PCR 反应体系 10 PCR 缓冲液 5 l；MgCl2(25 mmol/L)3 l；dNTPs(10 mmol/L)1 l；Taq E(5 U/l)l；引物 1+1 l；上述反转录生成的 cDNA 2 l；无RNase ddH2O l；反应条件：94预变性 5 min，94

9、 变性 45 s，55 退火 50 s，72 延伸 1 min。35 个循环,72 再延伸 7 min。%琼脂糖凝胶电泳 RT PCR 扩增产物 20 l 与上样缓冲液 4 l 混合上样，与 pUC MIX DNA 标准参照物一起在%琼脂糖凝胶上电泳分离。在 1 TAE 电泳缓冲液中 100 V恒电压电泳 45 min，溴化乙啶染色，UVP 图像分析仪摄像并分析结果。MTT比色法 实验在 96孔塑料培养板中进行，K562细胞和 SHI 1 细胞以浓度为 1 105/ml 铺板。阴性对照组以培养基代替药物；实验组药物终浓度为 50，100，200，400，800 g/ml。每组设 3个复孔，设

10、3 个空白调零孔。常规培养，于 44 h加入 MTT，继续培养 4 h，加入 SDS/HCl终止反应，并于 37放置约 4 h，使结晶溶解，用酶联免疫检测仪于 570 nm 波长处测光密度，计算 3个孔 D的平均值，按下式计算不同浓度壳聚糖对细胞的抑制率。相对抑制率=阴性对照组 D值-实验组 D值阴性对照组 D值 100%2 结果 壳聚糖对 K562细胞中 ppGalNAc T2表达的影响 从条带的亮度可以看出，阴性对照组的 ppGalNAc T2 表达量最高，加入壳聚糖后表达降低，且随药物浓度增加，表达逐步减弱。软件计算 ppGalNAc T2 与内参 actin条带亮度的相对值，得到 pp

11、GalNAc T2的相对表达柱形图，随着壳聚糖浓度的升高，ppGalNAc T2的表达量明显下降。14：壳聚糖浓度依次为 0，50，100和 200 g/ml；M：标准参照物 图 1 K562细胞 ppGalNAc T2 的表达 Fig 1 Expression of ppGalNAc T2 on K562 壳聚糖对 K562细胞增殖的相对抑制率 壳聚糖在体外能抑制 K562细胞的生长。低浓度壳聚糖对细胞的抑制作用不明显，低于 200 g/ml 浓度时其对细胞的抑制率小于 10%，但随着壳聚糖浓度的升高，细胞的生长抑制率迅速升高，当壳聚糖浓度为 800 g/ml 时有多数细胞生长明显受到抑制，

12、抑制率达%。14：壳聚糖浓度依次为 0,50,100和 200 g/ml 图 2 K562细胞 T2 的相对表达 Fig 2 Relative expression of ppGalNAc T2 on K562 图 3 壳聚糖对 K562 细胞的抑制作用 Fig 3 Inhibition effect of chitosan on K562 壳聚糖对 SHI 1 细胞增殖的相对抑制率 壳聚糖在体外同样能抑制 SHI 1 细胞的生长。低浓度壳聚糖对细胞生长抑制作用不明显，但随浓度升高抑制率迅速升高。浓度在 200 g/ml 时，抑制率为%，而当浓度达 800 g/ml 时抑制率为%。相对于 K5

13、62细胞，壳聚糖对 SHI 1 细胞的抑制作用较弱。图 4 壳聚糖对 SHI 1 细胞的抑制作用 Fig 4 Inhibition effect of chitosan on SHI 1 3 讨论 肿瘤细胞中的糖蛋白糖链结构异常与肿瘤的生物学行为，如恶性转化、转移和浸润等密切相关，而糖链结构异常的基础是糖基转移酶的变化4。因此，研究肿瘤细胞的糖基转移酶表达差异，有助于了解肿瘤的生物学行为机制。通过研究浸润性不同的白血病细胞株的糖基转移酶表达差异，有助于揭示糖基转移酶与白血病细胞株浸润能力的关系，从而为从糖生物学角度治疗白血病提供思路。白血病是一种造血组织的恶性疾病，俗称“血癌”，是某一类型的白

14、血病细胞在骨髓或其他造血组织中的肿瘤性增生，可浸润体内各器官、组织，使各个脏器的功能受损，产生相应的症状和体征。糖基化是真核细胞蛋白质转录后修饰方式中的一种。这些糖蛋白与一系列的生物学功能有着广泛的联系，如细胞间的黏附，自我与非自我的识别，分子运输与清除，受体激活，细胞的内吞作用等。某些糖基转移酶活性升高或降低,就会产生癌变，故一些糖基转移酶活性被视为癌变的重要标志。本实验用RT PCR 方法检测壳聚糖作用于 K562细胞后 ppGalNAc T2 的 mRNA 表达变化，ppGalNAc T2在未处理组 K562细胞中表达较高，随着加入壳聚糖浓度的提高，表达量逐渐降低。结果表明壳聚糖可抑制白

15、血病细胞 K562的 ppGalNAc T2 表达。甲壳素作为一种天然的碱性多糖，具有抗癌作用。实验证明，特别是甲壳素六聚糖具有很强的抑制肿瘤作用，它通过增强机体非特异性免疫对肿瘤有抑制作用，其机制是促进巨噬细胞活性，作用途径是影响非杀伤性细胞活性 IL 2 的分泌6。本实验采用 MTT法，用不同浓度壳聚糖作用于白血病细胞 K562，SHI 1，于 48 h 后检测 D值，发现随壳聚糖浓度升高，其对细胞的抑制率逐渐增加。但在低浓度时有波动，可能由于实验是微量操作，细胞浓度和加样量的极微差异都会导致实验结果的波动。实验结果显示壳聚糖对细胞有抑制作用，但对低浓度壳聚糖的抑制作用，还需调整实验中多糖

16、浓度进一步研究。通过本次实验发现壳聚糖对白血病细胞 K562和 SHI 1 都有抑制作用，其机制可能是带阳离子的壳聚糖，直接作用于带负电荷比正常细胞多的肿瘤细胞，从而抑制了实验中两种细胞的生长。但也不排除其他的可能。近年来,研究发现细胞凋亡的异常在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用,许多抗肿瘤药物都是通过诱导细胞凋亡而发挥其作用。新近研究表明壳聚糖也具有诱导细胞凋亡的作用，Hasegawa等7研究发现壳聚糖可诱导膀胱癌细胞凋亡,从而抑制其增殖。肿瘤细胞的凋亡受许多因素的影响,其中癌基因、抑癌基因、细胞因子在其中起着重要作用。因此,诱导肿瘤细胞凋亡也可能是壳聚糖抑制肿瘤细胞生长的重要机制。多肽：N

17、乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc T)催化 O 聚糖合成的第一步反应，将UDP GalNAc上的 GalNAc基团转移至蛋白多肽链上特定序列中的 Thr或 Ser从而合成GalNAc O Ser/Thr。ppGalNAc T 及其家族作为黏蛋白 O 糖基化的起始酶，在一些蛋白质上，O GlcNAc和 O 磷酸化相互竞争同一或邻近的位点8，可能与肿瘤的生长和转移，细胞的信号传导等密切相关。肿瘤细胞表面可有类似黏蛋白的糖蛋白，含有丰富的 O 糖基化结构域，在肿瘤的转移和浸润生长过程中黏蛋白起着重要的作用，ppGalNAc T可能通过各种途径调节细胞的生长及浸润转移，在肿瘤的发生发展中起着重要

18、的作用。通过本次实验结果，初步推测壳聚糖降低白血病细胞 K562 的糖基转移酶ppGalNAc T2的表达，同时 ppGalNAc T2的表达降低可能影响 K562细胞的生长与转移浸润，使细胞的生长受到抑制，正如 MTT试验结果显示，加入壳聚糖后细胞生长受到不同程度的抑制。但白血病细胞 K562的糖基转移酶 ppGalNAc T2表达的降低与细胞增殖受到抑制，这两者之间是否存在某种联系，还需进一步实验研究探讨。【参考文献】1 Angnihotri SA,Mallikarjuna NN,Aminabhavi TM.Recent advances on chitosan based micro a

19、nd nanoparticles in drug delivery J.J Control Re1ease,2004,100(1):5-28.2 杜昱光,白雪芳,金宗濂,等.壳寡糖抑制肿瘤作用的研究J.中国海洋药物,2002,21(2):18-21.3 仇 灏,陈克平,周嘉梁，等.Northern 杂交检测多肽：N 乙酰氨基半乳糖转移酶 2 在不同肿瘤细胞中的表达水平J.江苏大学学报：医学版,2005,15(1):14-16.4 赵 凝,杨 静,郭向红，等.全反式维甲酸对 SHI 1 细胞株糖基转移酶表达的影响J.江苏大学学报：医学版,2005,15(6):465-469.5 Ohtsubo

20、K,Marth JD.Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease J.Cell，2006,126:855-867.6 玉顺子.甲壳素及其衍生物药理作用的研究进展J.时珍国医国药,2006,17(10):2072-2073.7 Hasegawa M,Yagi K,Iwakawa S,et al.Chitosan induces apoptosis via caspase 3 activation in bladder tumor cellsJ.Jpn J Cancer Res,2001,92(4):459-466.8 Hart GW,Housley MP,Slawson C.Cycling of O linked beta N acetylglucosamine on nucleocytoplasmic proteins.J.Nature，2007,446:1017-1022.