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1、凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解 凝胶过滤层析技术原理讲解 凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang 凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称 尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用 GFC 或 SEC 表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用 G

2、PC 表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用 GFC 或 SEC 表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。(1)分离机理 GFC 填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原

3、理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。注 1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。(2)应用范围 A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系;C 样品脱盐或溶剂置换。(3)填料要求 一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性(denature)或是其它化学

4、反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的 pH 和温度范围内使用。凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。(4)凝胶过滤常用填料种类 目前常用的凝胶包括 3个主要类型:A:葡聚糖凝胶(Polydextran)，商品名称是 Sephadex Polydextran 几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex G-X，X表示葡聚糖的交联程度，数值越大则交联度越小，但吸水量越高，X值大致是吸水量的 10 倍。以 Sephadex G-2

5、5为例，表示 1 克干燥的 G-25凝胶可以吸水 2.5 ml。Sephadex 的分离范围与填料粒经和交联度密切相关，大概范围如下:型号 粒度(微米)有效分离范围(球形蛋白质)G 10 55,166 700 G 15 60-180 1500 G 25 -1000-5000 G 50 -1500-30000 G 75 -3000-80000 G 100 -4000-150000 G 150-5000-300000 G 200 -5000-600000 Superdex 属于葡聚糖以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶，流速快、反压低。型号 粒度(微米)有效分离范围(球形蛋白质)Superd

6、ex 30 24-44 10000 Superdex 75 24-44 3000-70000 Superdex 200 10000-600000 B 聚丙稀酰胺凝胶(Polyacrylamide)Polyacrylamide 是一种合成凝胶，商品名 Bio-Gel P，干粉颗粒状。依胶的分离范围不同，分成 Bio-Gel P-2至 Bio-Gel P-300，P 后面的数字乘以 1000为最大过滤限度。Polyacrylamide 的化 学性质不活泼，但它在极端的 pH下会被水解，水解后产生的 COOH-具有离子交换的性质，因此 pH值应尽量控制在 2-10 之间。型号 粒度(微米)有效分离范

7、围(球形蛋白质)Bio-Gel P-2-1800 Bio-Gel P-4-800-4000 Bio-Gel P-6-1000-6000 Bio-Gel P-10-1500-20000 Bio-Gel P-30-2500-40000 Bio-Gel P-60-3000-60000 C 琼脂糖凝胶 商品名称 Sepharose，由属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为 Sepharose 2B，4B和 6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量 400,000以上的物质，因 其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏 50 度以上会融化，故

8、需 于较低温的环境中进行层析。Agarose做成 beads 后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。经 2，3,二溴丙醇反应交联而成的凝胶为 Sepharose CL型凝胶 型号 粒度(微米)有效分离范围(球形蛋白质)Sepharose 2B 70000,40000000 Sepharose 4B 60000,20000000 Sepharose 6B 4000000 10000,Sepharose CL-2B 70000,40000000 Sepharose CL-4B 60000,20000000 Sepharose CL-6B 10000,4000000 Superpose琼脂糖经多次交

9、联形成的凝胶。型号 粒度(微米)有效分离范围(球形蛋白质)Superose 6 5000,5000000 Superose 12 1000,300000 其它凝胶:聚丙稀酰胺葡聚糖凝胶，交联聚苯乙烯凝胶，聚乙烯醇凝胶等，还有更多新型号的凝胶。4 操作实例(转载)1)凝胶溶胀 凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖 Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天(溶胀时间因凝胶交联度不同而不同)，或沸水浴中溶胀 3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉

10、下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。4 操作实例(转载)1)凝胶溶胀 凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖 Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天(溶胀时间因凝胶交联度不同而不同)，或沸水浴中溶胀 3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。2)装柱与平衡 装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约 1/3 柱容积的洗脱液，然后在搅拌下

11、，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约 23cm 后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约 5cm 处时停止装柱，关闭出水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。通过 23倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。3)上样与洗脱 样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面 1,2mm 时，关闭出口

12、，用滴管将 1ml 样品慢慢地加至柱床表面，应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算流出体积，当样品滲入床中接近床表面 1mm 时关闭出口。按加样操作，用少量(约 1ml)洗脱液冲洗管壁 2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面 3,5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min 流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床容积的 1-2%;制备用量为柱床容积的 20%30%。4)收集与鉴定 用自动部分收集器收集流出液，每管 4ml，紫外检测仪 280nm 波长处检测，最高的一个 OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积 Ve。5)凝胶柱的处理 凝胶用过后，反复用蒸

13、馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用 0.5mol/LNaCl洗涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥状态保存。计算 分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质量的 Ve，并以它们的相对分子质量的对数(logMr)对 Ve作图得一直线，再测出待测样品的 Ve，即可从图中确定它的相对分子质量。注意事项 各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠

14、正。始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。蛋白质凝胶过滤层析动画,原创版 该动画由生化工程国家重点实验室和国家生化工程技术研究中心(北京)提供，引用请注明出处:凝胶渗透色谱(GPC/SEC)技术 一、凝胶渗透色谱的概述 1.凝胶渗透色谱的简单回顾 凝胶渗透色谱GPC(Gel Permeation Chromatography)也称作体积排斥色谱(Size Exclusion Chromatography)是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。利用多孔性物质

15、按分子体积大小进行分离，在六十年前就已有报道。Mc Bain 用人造沸石成功地分离了气体和低分子量的有机化合物，1953 年 Wheaton和 Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质。1959年 Porath 和 Flodin 用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的是制备出适用于有机溶剂的凝胶。二十世纪 60年代 J.C.Moore在总结了前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高 灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分

16、子量及分子量分布的测定仪，从而创立了 液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。凝胶渗透色谱的应用 2.三十多年来，凝胶渗透色谱的理论、实验技术和仪器的性能等方面有了突飞猛进的发展。尤其是随着新型柱填料的诞生、高效填充柱的出现(目前其理论塔板数已超过10000/米)以及计算机的普及，凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。例如:常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型;

17、相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数 D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能最佳的高聚物产品。另外，除了快速测定分子量及其分布以外，凝胶渗透色谱还广泛用于研究高聚物的支化度，共聚物的组成分布及高聚物中微量添加剂的分析等方面。如果配以在线的绝对分子量检测器(如:LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS 等)，凝胶渗透色谱 可以测定高聚物的绝对分子量。凝胶渗透色谱作为一门新兴的科学，随着各种新型检测器的出现(如 UV、FT-IR、LS、Viscometer

18、等)，它的应用范围也逐步从生物化学、高分子化学、无机化学等向其它领域渗透，成为化学领 域内必不可少的分析手段。二、凝胶渗透色谱的基本概念 1.凝胶渗透色谱的分离机理 目前关于凝胶渗透色谱的分离机理存在着以下几种基本理论:1.立体排斥理论;2.有限扩散理论;3.流动分离理论。除上述理论外，尚有分子热力学理论和二次排斥理论等。由于应用立体排斥理论解释凝胶渗透色谱中的各种分离现象与事实比较一致，因此立体排斥理论已为人们普遍采用。即:它的分离基础主要依据溶液中分子体积(流体力学体积)的大小来进行分离。凝胶渗透色谱的分离过程是在装有多孔物质为填料的色谱柱中进行的，一个填料的颗料含有许多不同尺寸的小孔(这

19、些小孔具有一定的分布)，这些小孔对于溶剂分子来说是很大的，它们可以自由地扩散出入。由于高聚物在溶液中以无规线团的形式存在，且高分子线团也具有一定的尺寸，当填料上的孔洞尺寸与高分子线团的尺寸相当时，高分子线团就向孔洞内部扩散。显然，尺寸大的高聚物分子，由于只能扩散到尺寸大的孔洞中，在色谱柱中保留的时间就短;而尺寸小的高聚物分子，几乎能够扩散到填料的所有的孔洞中，向孔内扩散的较深，在色谱柱中保留的时间就长。因此，不同分子量的高聚物分子就按分子量从大到小的次序随着淋洗液的流出而得到分离。图 1 是高聚物分子和固定相颗粒间相互作用的示意图。图 2 是不同尺寸的高聚物分子分离过程的示意图。图 1.高聚物

20、分子和固定相颗粒间相互作用 图 2.不同尺寸的高聚物分子分离过程 2.凝胶渗透色谱谱图的构成 实验上，在色谱柱后面配以(通用型/选择型)浓度监测器，便可以记录出高聚物的GPC 图，如图 3所示。图 3 高聚物的 GPC 图 当聚合物样品的色谱图完成以后，经处理的数据，可作多方面的应用。通过观察色谱图可获得很多有用的信息。色谱图中不同的区域与聚合物样品中各成分有关，如果对高分子材料作一次全分析，就可以发现高分子材料的 GPC 谱图 4中:A是高聚物的图谱;B是齐聚物的图谱;C 是各种类型添加剂的图谱;D是低分子化合物杂质的图谱。图 4 高分子材料全分析 GPC 谱图中各部分组成的示意图 3.凝胶

21、渗透色谱中几种常用平均分子量的定义 由于应用统计方法的不同，即使对同一个试样，也可以有许多不同种类的平均分子量。下面是四种最常用的平均分子量的定义。式中:Ni:分子量为 Mi的分子的个数 Wi:分子量为 Mi 的组分的重量 :特性粘度,分子量方程中的常数 其中，数均分子量是按分子数目统计平均而得;重均分子量是按分子重量统计平均而得。这两种平均分子量的物理意义比较明确，而粘均分子量和 Z均分子量的物理意义却不太明确。一般情况下，多分散样品的平均分子量有以下次序:图 5为高聚物四种平均分子量在 GPC 谱图中的示意图。4.高聚物多分散性的表征 高聚物的分子量分布是指样品中各种分子量组分在总量中所占

22、的各自的分量，它可以用一条分布曲线或一个分布函数来表示。分子量分布曲线有两种形式:1.用重量分数 W 对分子量作图的曲线叫做微分分布曲线;2.用累积重量分布对分子量作图的曲线叫做积分分布曲线。样品间分子量分布宽度的比较，最直接的方法是将实验所得到的分子量分布曲线作对比。还有一种更一般化且最 常用的定量方法就是重均数均比，即:Mw/Mn。目前实验上能够合成的单分散样品、一般多分散样品、分子量分布比较宽的样品的 Mw/Mn 值如表 1所示。表 1.几种合成高聚物的 Mw/Mn 值 高聚物 样品举例 Mw/Mn 单分散样品 聚苯乙烯标样 1.021.10 一般多分散样品 聚氯乙烯，聚碳酸酯 1.53

23、.0 分布比较宽的样品 聚乙烯，聚丙烯 2030或更高 图 6是样品的 GPC 图及样品的分子量分布的微分分布曲线、积分分布曲线的示意图。图 6.GPC 谱图、微分分布曲线、积分分布曲线示意图 5.高聚物的分子量及其分布的测定 用凝胶渗透色谱测定高聚物的分子量及其分布是种相对的测试方法。首先要制取适合被测样品的 logM-Ve标定线(工作曲线)。目前人们制定标定线比较常用的方法主要是以下两种:1.单分散标样制定标定线 所谓单分散标准样品是指高聚物的 Mw/Mn 值在 1.051.10以内。此方法类似于其它化学分析上的工作曲线法。它的前提是能够获得一系列(不同分子量)被测样品的单分散标样，用这些

24、单分散标样来制得 logM-Ve标定线;然后，以此来测定样品。图 7所示为单分散标样的校正线绘制过程 示意图。图 7 单分散标样的校正线 2.普适校正法 这种方法是用流体力学体积?M 作为通用校正参数，也被称作普适校正法。不同高聚物在同样实验条件下进行凝胶色谱的实验，若淋洗体积 Ve相同，则这两个高聚物的流体力学体积相等。即:1?M1=2?M2 attachimg1734/attachimg 上式中 K1、K2、1、2在固定条件下是常数，只要知道两种高聚物在该条件下的参数 K1、1及 K2、2值，就可由第一种高聚物(标准样品)的 logM-Ve标定线，应用?式直接求出第二种高聚物(被测样品)的

25、 logM-Ve标定线。目前，人们普遍采用市售的单分散聚苯乙烯(PS)标样来作为第一种高聚物，然后查取(或采用其它的实验方法测得)聚苯乙烯标样及被测样品在测定条件下的 K值(K1、K2)和 值(1、2)，经过上述转换便可求出被测样品的分子量。目前由于计算机的引进，上述转换可在测定样品的同时由 GPC 软件实行自动转换。除上述两种常用的方法外，还有，窄分布的高聚物级分订定的标定线;渐近试差法订定的标定线;无扰均方末端距 h02用作通用校正参数;高分子链有扰均方末端距 h2 用作通用校正参数等。三(凝胶渗透色谱仪的基本结构 简单地说，凝胶渗透色谱仪由以下四部分构成:1.输液系统(包括溶液储存器、输液泵。进样器等)，2.色谱柱系统(包括柱温控制箱)，检测器(RI、UV等)，3.4.数据收集及数据处理系统(包括模数转换器、计算机、打印机/绘图仪等)。其流程图如图 8 所示。图 8.凝胶渗透色谱仪的流程图(图中:-:液路，:电路)总之，大量的数据证明，任何材料的宏观性能都与其微观结构有着密切的联系。高聚物的分子量及其分子量分布是高聚物结构中两个重要的参数。凝胶渗透色谱技术的发展，大大推动了高聚物分子量、分子量分布与其性能间关系的研究，同时，GPC已成为分离分析科学家族中不可缺少的一名成员。