红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验.docx

1、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验 红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验 流感病毒表面的血凝素(HA)蛋白,含有识别与结合宿主细胞表面受体的结构,能使一些特定的红细胞发生凝集现象。当红细胞与病毒按适当的比例混合后,由于病毒的作用使红细胞发生凝集,此为凝集现象。含有特异的抗流感病毒 HA蛋白的抗血清,能抑制红细胞凝集现象的出现,即抗体与病毒结合后,可以使血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上,此为红细胞凝集抑制(HAI)。微量红细胞凝集抑制试验就是目前最常用的一种鉴定流感病毒型/亚型及分析流感病毒 HA抗原性变异的试验方法,也可以用于对一般人群抗体水

2、平的检测与疫苗效果的评价等方面。用于 HAI试验的标准参照血清必须及时更新,用于鉴定流感病毒型/亚型应包括当年的国际疫苗株或国内流行代表株的抗血清,可以用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物的抗血清;用于抗原分析的抗血清建议包括同一型别与亚型不同毒株免疫的标准参考抗血清,由于用雪貂制备的抗流感病毒血清特异性高,易将不同毒株间抗原性差异显示出来,因此常用免疫雪貂的抗血清进行抗原分析。HAI试验中所用的血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。(一)生物安全要求 所有有关试验操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行,必须遵守生物安全规定,严格执行标准操作规程与废弃物管理规定,做好个人防护要求。

3、季节性流感病毒病毒或经完全灭活的高致病性禽流感病毒操作可以在 BSL-2实验室里进行,高致病性禽流感病毒的操作在 BSL-3级实验室中进行。(二)实验所用试剂 1.标准参考抗原:以国际疫苗株与国内流行株作为标准参考抗原,新分离的毒株作为待测抗原。2.标准参考抗血清:以国际疫苗株与国内流行株制备的抗血清作为标准参考血清。血清要经 RDE处理。(三)其她试剂/材料/仪器 1.红细胞悬液 2.PH7、4的 PBS 缓冲液 3.RDE(日本生研)4.水浴箱(37,56)5.台式离心机 6.多道可调加样器、单道可调加样器 7.离心管 8.96孔微量血凝板(使用豚鼠与人红细胞进行实验须用“U”底板,使用火

4、鸡红细胞进行实验用“V”底板)9.200L、1000LTIP 头、水槽 表 1、流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较 红细胞 火鸡 豚鼠 人“O”型血 终浓度 0、5 0、5 0、5 孔底部形状 V型 U型 U型 孵育时间 25-30min 45-60min 45-60min 红细胞沉积形状 细胞沉积成点状,倾斜时细胞向下流成泪滴状 细胞沉积成环状 细胞沉积成环状 (四)流感病毒鉴定与抗原分析步骤 1.实验前准备（1）标准参考抗血清的处理 1）去除血清中的非特异性抑制素 a）所谓抑制素就是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似的物质,它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素

5、所识别与结合。目前所知道的非特异性抑制素,除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊的非特异性抑制素,还有三种:、与。在 HAI试验中,必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净,才能准确地测定出 HAI的抗体效价。常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液(RDE,受体破坏酶的一种)清除法,过碘酸钾清除法等。b）RDE处理步骤:用 25mL生理盐水稀释 RDE;在 1体积血清中加入 3体积RDE(如 0、1mL血清+0、3mLRDE),37水浴 16-18h;56水浴 30 min;加入 6体积生理盐水(在 0、4mL RDE 与血清混合物中加入 0、6mL生理盐水)。2）去除非特异性凝集素 a）向 2

6、0体积 RDE 处理后的血清中加入 1 体积的纯血球。b）完全/彻底混匀,在 2-8孵育,每 15 min 重新混匀一次。c）1h后,2000 转离心 5min。吸出血清上清液。d）取出一块 96孔血凝板,在第一列每孔加入 50uLPBS 缓冲液,吸出 50uL处理好的血清,做 2倍稀释,加入 50uL红细胞悬液,室温静置 30-60min,观察试验结果,如果红细胞沉积,证明血清中非特异性凝集素去除干净(去除非特异性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致)。（2）红细胞悬液配制 1）A、S 液全称为 Alsever氏液。配制方法为葡萄糖 2、05g、柠檬酸钠 0、8g、柠檬酸 0、055

7、g、氯化钠 0、42g、去离子水加至 100mL,微热溶解,将 pH值调到 6、1,8 磅20min 高压灭菌,4贮存备用。2）将含有红细胞的 A、S 液,离心 5min(火鸡/鸡红细胞 1800rpm;人“O”型、豚鼠红细胞 2000rpm,不同离心机转速稍有不同),弃上清。3）加入等量的 PBS 缓冲液洗涤,充分混匀,离心 5min(转速同上),弃上清。PBS 缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后,离心 10min(转速同上),弃上清。4）吸出适当体积的红细胞,用 PBS 缓冲液配制成工作浓度为 1%红细胞悬液。2.流感毒株 HA滴度的测定（1）在微量血凝板的第 212列加入 50L PBS 缓

8、冲液。（2）在第一列(A1G1)中加入 100L病毒悬液。（3）H1加入 100L PBS,作为红细胞阴性对照。（4）从第一列各孔吸 50L病毒液,由第 1 列至第 12列做 2倍系列稀释,最后一列每孔弃去 50L。（5）在每孔中加入 50L红细胞悬液,轻拍血凝板,充分混匀。（6）室温孵育,鸡与火鸡红细胞静置 25-30min 后观察结果,人“O”型与豚鼠红细胞45-60min 后观察结果,并记录。3.HA试验结果判断 引起全部红细胞凝集为完全凝集,以“+”记录;只有部分红细胞凝集记录为“+/-”;无凝集记录“-”。血凝滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点,其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴

9、度。表 2、HA滴度判定举例 病毒稀释度 HA滴度 :1:2:4:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 245678 9 10 11 12 +-2+-8+-16+-32+-64+-128+2048-1 4.制备用于红细胞凝集抑制试验的 4个血凝单位的抗原（1）一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用 4 个血凝单位的病毒量。（2）制备 4个单位血凝抗原时,首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每种血清做 8孔稀释,每孔用抗原 25L,则测定一份血清需 0、2mL抗原。根据标准抗

10、血清的份数计算出实验所需病毒抗原总量。（3）其次,计算出病毒稀释度。用病毒的 HA 滴度除以 8,得到的商即为配置 4个血凝单位所需的稀释度。如,某病毒的 HA滴度为 64,除以 8等于 8,则 1:8(1mL病毒液加7mLPBS 缓冲液)稀释该病毒即可得到 4个血凝单位的抗原。注:红细胞凝集抑制试验中所用的 4 个血凝单位就是指每 25L病毒液中含有 4个血凝单位(等于 50L病毒液中含有 8 个血凝单位)。表 3、所需抗原总量为 1600L时,4个血凝单位配置对照表 HA滴度 病毒液(L)PBS(L)16 800 800 32 400 1200 64 200 1400 128 100 15

11、00 256 50 1550 512 25 1575 1024 12、5 1587、5 2048 6、25 1593、75 5.4个血凝单位抗原的复核滴定（1）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误,新配置的 4 个血凝单位抗原需复核滴定。操作方法同 HA实验步骤。（2）如果只有前 4孔出现凝集,表明每 50L病毒含有 8个血凝单位,该病毒稀释准确,可以用于红细胞凝集抑制试验。如第 5孔也出现凝集,说明每 50L病毒含有 16个血凝单位,该抗原必须等量稀释。如只有前 3孔凝集,表明每 50L病毒仅含 4个血凝单位,病毒量需加倍。此外,4 个血凝单位抗原必须每次现用现配。6.红细胞

12、凝集抑制试验(HAI)（1）利用 HAI方法进行流感病毒的鉴定 红细胞凝集抑制试验(HAI)鉴定未知病毒,每块 96孔血凝板可以检测两株未知病毒。1）在血凝板的第 1-5、7-11列每孔加入 25L PBS 缓冲液,第 6与 12 列每孔加入50LPBS。然后在 A1-A4、A7-A10各孔分别加入:抗 A(H1N1)pdm09 流感病毒标准参考血清、抗季节性 A(H3N2)流感病毒标准参考血清、抗 B-Yamagata 系流感病毒标准参考血清、抗 B-Victoria 系流感病毒标准参考血清 25L,用多道移液器从 A1-A4、A7-A10行每个孔分别取 25L,由 A至 H行做 2 倍稀释

13、血清,最后一行弃去 25L。2）第 1至 4 各列每孔加入 25L4血凝单位待检抗原 1,A7至 A10各列每孔加入25L4血凝单位待检抗原 2。第 5 与第 11 列加入 25LPBS 缓冲液,作为红细胞对照。第6 与第 12 列第一孔分别加入 50L8血凝单位待检抗原 1与 2,由 A至 H行做 2倍稀释,最后一行弃去 50L,此处做法的目的就是 HAI实验同时验证所配置 4单位抗原的准确性,确保实验结果准确。a）阳性对照:将试剂盒中的各型/亚型流感病毒标准参考抗原按照上述步骤进行检测。3）轻拍,混匀,室温孵育 30min。4）每孔加入 50L配置好的红细胞悬液,轻拍混匀,室温静置 30-

14、60min,观察血凝抑制实验结果(具体孵育时间根据使用的不同种类血球来定,详见表 1)。（2）利用 HAI方法进行流感病毒的抗原分析 1）验证 4血凝单位抗原步骤同以上,如果 4 血凝单位结果不准确需重新配置,直至回滴结果准确为止,在进行抗原分析时 4血凝单位抗原一定要配制准确,保证病毒之间抗原分析结果有可比性。2）在微量血凝板的第 1-11 列每孔加入 25LPBS 缓冲液,第 12列每孔加入50LPBS 缓冲液。在第一行(A1-A11)每孔加入 25L对应待检流感病毒型/亚型的抗原分析用参考抗血清及阴性对照血清。3）从第一行(A1-A11)各孔混匀之后吸取 25L血清,由第 1 行至第 8

15、 行做 2倍系列稀释,最后一行每孔弃去 25L液体。4）在微量板的第 1-11 列每孔加入 25L配制好的 4 血凝单位抗原,第 12列 A12孔加入 50L配置好的 8 血凝单位抗原,由第 1 行至第 4行做 2倍系列稀释,最后一行每孔弃去 50L液体。第 12 列的 E、F、G、H孔做红细胞对照,轻拍微量板,室温孵育30min。5）在微量板的每孔加入 50L的红细胞悬液,轻拍微量板,使红细胞与病毒充分混合。6）室温静置 30-60min(具体孵育时间根据使用的不同种类血球来定,详见表 1)。观察血凝抑制实验结果。7.结果判读 红细胞凝集抑制效价就是指血凝现象完全被抑制时血清的最高稀释度的倒

16、数。如1:80 稀释的血清孔不出现凝集(凝集现象完全被抑制),1:160稀释的血清孔出现凝集(凝集现象没有被完全抑制),该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为 80。（1）利用 HAI方法进行流感病毒鉴定的结果判断 1）标准参照抗血清对待检抗原的抑制效价20 才可以算为阳性。2）待检抗原与标准参照抗血清有交叉抑制,但与一种型/亚型的标准参照抗血清抑制效价大于其她型/亚型参照抗血清 4 倍以上时,便可以判定为此种亚型的流感病毒。（2）利用 HAI方法进行流感病毒抗原分析的结果判断 1）当待检病毒与参考雪貂抗血清的 HAI效价低于参考病毒与参考抗血清自身HAI效价的 8倍(含 8倍)或以上时,则认

17、为待检病毒就是该参考抗血清检测到的低反应株;反之,当相差 8倍以内时(不含 8倍),则认为待检病毒就是参考病毒的类似株。2）抗原分析试验时,每次都必须同时加入标准参考抗原进行检测,它既就是结果判读的依据,也就是试验的质控。确保实验结果准确,结果更具有可比性。每次阳性对照的血凝抑制效价上下一孔浮动,在试验质控的范围内,如果超出此范围之外本次试验结果不成立,需重复试验。(五)注意事项 1.红细胞凝集抑制试验必须用 4个血凝单位/25L的抗原,抗原必须现用现配。2.红细胞悬液的配制必须标准化。3.正确存放试剂,避免反复冻融及污染。4.冻干的试剂应按照说明溶解,保存。5.血凝抑制试验包括以下对照:（1）红细胞对照,用于准确判断读结果的时间,同时排除血球问题引起的错误结果;（2）阴性对照血清,以防其它非特异性抗体的影响;（3）阳性对照:防止非特异性凝集素及抑制素的干扰;结果判读标准。