本科毕业设计蛹虫草子实体中天然色素的提取工艺.docx

1、本科毕业设计蛹虫草子实体中天然色素的提取工艺摘 要蛹虫草又称为北虫草，或北冬虫夏草，属真菌类子囊菌物质，其子实体具有很高的药用价值和营养价值，至今对蛹虫草子实体中的虫草素，虫草酸，虫草多糖，SOD等生物活性成分的研究项目比较多，但对蛹虫草子实体中天然色素的研究甚少。本实验以蛹虫草子实体为原材料，以天然色素的提取率为考察指标，比较了酸热法，研磨法，超声波提取法和微波提取法对蛹虫草子实体中天然色素的提取效果，并利用紫外-可见分光光度法测定其含量。实验结果表明，酸热法对蛹虫草子实体中天然色素的提取效果最佳，其次是研磨法，最后是超声波提取法和微波提取法。采用响应面分析法对影响有效成份提取的工艺条件进行

2、了优化，最终确定蛹虫草子实体提取天然色素的最佳工艺条件为：盐酸浓度0.05mol/L，盐酸用量10.5mL，热处理时间5min。在此最优工艺条件下，天然色素的提取率为2747.71g/g。同时讨论了光照和温度对蛹虫草子实体中天然色素稳定性的影响，结果表明，日光对天然色素有明显的破坏作用，温度升高对天然色素有一定的破坏作用。关键词：蛹虫草子实体；天然色素；酸热法；响应面优化Abstract Cordyceps Militaris, also known as Cordyceps,or North Cordyceps are fungus ascomycetes substances. he fr

3、uiting body has high medicinal value and nutritional value.Now,there are more and more research projects about cordycepin in Cordyceps militaris, Cordyceps acid, Cordyceps polysaccharide,SOD and other bio-active ingredients , but the Cordyceps militaris natural pigment are less than them. In the exp

4、eriments, Cordyceps militaris are the raw materials,and we regard the rate of the natural pigment extraction as the indexes, compared the extractions of Cordyceps militaris natural pigment by acid calorimetry, grinding method, ultrasonic extraction and microwave extraction .Then we use ultraviolet-

5、visible spectrophotometry to determine its content. Experimental results show that the acid-heat method of Cordyceps militaris natural pigment is the best way in the optimum extraction methods, followed by grinding method, and finally ultrasonic extraction and microwave extraction. Finally we use th

6、e Response surface methodology to optimize the process conditions which affect the active ingredient extraction and ultimately determine the optimal conditions for Cordyceps militaris extract natural pigment,the concentration of hydrochloric acid is 0.53mol/L,the amount of hydrochloric acid is 10.25

7、mL.the heat treatment time is 4.56min.Finally we conclude the effects of light and temperature on the impact of natural pigment extraction of Cordyceps Militaris.Keywords: Cordyceps militaris; natural pigments;acid calorimetry; response surface optimization experiments第1章 前言蛹虫草最早源于中国，俗称北冬虫夏草或北虫草，由于其

8、药用价值与冬虫夏草极其相似，故药典中记为“北冬虫夏草”。味甘、性平，具有益肺补肾，止血化痰的功效。近些年的研究表明：蛹虫草与冬虫夏草极其相似，无毒副作用，可做为冬虫夏草的良好代用品。其在治疗老年痴呆，清除人体自由基，降血脂，保护肝肾及呼吸系统，调节内分泌与免疫系统，抗肿瘤、抗疲劳、抗病源微生物，镇静抗惊厥作用等方面有极佳的功效。蛹虫草天然色素作为蛹虫草子实体中的生理活性物质之一，也是研究的重点。所以，随着对蛹虫草子实体中天然色素研究的不断深入，利用蛹虫草子实体中天然色素开发的保健品，功能性食品添加剂和药品的市场前景为人研究者们所看好。为了研究出有利于人们身体健康的、经济效益高的蛹虫草子实体中天

9、然色类的深加工产品，就需要我们广大的食品科学家、生物学家和医学家们的共同努力，从而带动整个研究的快速发展。因此，本实验开展对蛹虫草子实体中天然色素提取工艺的研究和优化，为工业化规模性生产蛹虫草子实体天然色素提供理论依据。第2章 文献综述2.1 蛹虫草子实体2.1.1 生长条件 蛹虫草子实体是蛹虫草生殖细胞“孢子”（相当于植物的种子）随风飘散粘上某些昆虫的蛹后，萌发菌丝并侵入蛹体内吸取养分，而后从蛹体上长出的金黄色、或橘黄色、或橘红色的棍棒状物体，是产生生殖细胞“孢子”的生殖体（相当于植物的果实体）。 图2.1 人工培养的蛹虫草子实体 图2.2 蛹虫草菌丝体2.1.1.1生长史 蛹虫草是一类复型

10、真菌，在生活史中有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。蛹虫草的菌丝是一种子囊菌，当子实体成熟后可以形成子囊孢子，孢子散发后随风传播。如果孢子落在适宜的昆虫蛹（虫）体上，特别是幼虫的虫体上后，便开始萌发形成菌丝体1。菌丝体以昆虫蛹体或虫体的体内组织和器官作为其生长发育的物质和能量来源，很快布满整个昆虫蛹体或虫体的内部，最后将蛹体或虫体内部各种组织和器官完全分解。自此以后，菌丝体由营养生长开始转为生殖生长，菌丝体扭结，并从虫体空壳的头部、胸部、近尾部等处伸出，形成金黄色、橘黄色或橘红色的、顶部略膨大的棒状子实体。在子实体的顶端，着生许多表面呈乳头状突起的子囊壳，每个子囊壳内产生许多子囊

11、孢子，当子囊孢子成熟后放射出来，又开始下一轮生活史。2.1.1.2 生长地域 蛹虫草寄主的专一性不强，可寄生于鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫的幼虫、成虫和蛹，并且大多数寄生于蛹。其寄主昆虫共有3目11科19种。野生蛹虫草是一种世界性分布的广布种，其地理分布区域遍及全世界。在我国，野生蛹虫草主要分布在吉林，辽宁、河北、陕西、安徽、广西、云南、广东、四川、贵州、湖北、湖南、山西、山东、江苏，河南等十几个省区2。主要表现出以下分布规律：多生长于春夏季节的47月份，或秋冬季节的811月份；海拔高度一般在1002000左右；年均气温为212，最高气温36，最低气温-36，在蛹虫草大量产生的411月份，气温

12、较高，平均气温为928；蛹虫草产区多属温带湿润气候，年均降水量在650毫米以上，空气相对湿度为6095%，土壤湿度为2065%；野生蛹虫草多产生在针阔混交林地上，土壤多为棕壤土、紫红壤土等腐殖质土壤，一般土壤腐殖层39厘米的林地中较多3。2.1.2功能作用 蛹虫草含有虫草素、虫草酸、虫草多糖、蛋白质、超氧化物歧化酶（SOD）、麦角甾醇、氨基酸、维生素及多种微量元素，与冬虫夏草的化学成分基本相同4。另外还包含虫草素在内的腺苷、尿苷、尿嘧啶、腺嘌呤等物质。2.1.2.1 虫草素1951年，加拿大的Cunningh等观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，随后从中分离到一种腺苷类活性物质，命名为虫草素

13、(Cordycepin)，并确定其结构式为 3-脱氧腺苷(3-Deoxyadenosine)，虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。虫草素又称虫草菌素、蛹虫草菌素、3-脱氧腺苷。在已报道的400多种虫草中，蛹虫草是唯一能大量产生虫草素的虫草。 分子生物学和现代医学的研究发现，虫草素具有多方面作用5：免疫调节、抗肿瘤、抗真菌；增加脾脏重量、加快肝脏核酸和蛋白质更新速度，抗缺氧、增加心肌营养血流量及降低血清胆固醇和B酯蛋白，刺激糖酵解导致ATP合成增加，增强肝脏功能和肌肉中CPK的活性，对由于激素失调引起的性功能损伤有修复作用，能明显增加冠脉血流量，降低冠脉、脑及外围血管阻力。丁向萍6等的

14、研究报告虫草素诱导人肝癌Hep G-2 细胞凋亡及对端粒酶活性影响的研究中指出，虫草素有抗肿瘤的作用。2.1.2.2 虫草酸 虫草酸(Cordycepic acid)是冬虫夏草主要活性成分之一，又名甘露醇(Mannitol )，化学分子式C6H14O6，为1,3,4,5四羟基环已酸。施英7等在蛹虫草药理作用研究进展中提到，虫草酸能抑制各种病菌的成长，可预防与治疗脑血栓、脑出血、心肌梗塞、长期衰竭；虫草酸含量的高低是衡量虫草质量的主要标准之一，一般认为虫草酸含量高的虫草的药用价值高。黎颖8在甘露醇的性质、生产与发展建议中提到：甘露醇（虫草酸）由于能部分吸收、并发生代谢，是一种较强的自由基清除剂，

15、以及其渗透性脱水和利尿的作用。2.1.2.3 虫草多糖 虫草多糖是一类高分子复合物，在蛹虫草中含量为410%，是蛹虫草中含量最高的主要药理活性物质。它的抗癌活性和免疫活性已引起人们的极大兴趣。从1977年开始，日本和中国的科研人员开始对虫草多糖开展研究，已从天然冬虫夏草以及人工培育的虫草真菌中分别分离纯化出了多种多糖组份，并对其理化性质和药理活性进行了详细研究。 大量研究表明，虫草多糖有着多种生物活性功能，被医学界和药物学界认为是当前世界上非常好的免疫促进剂之一9，具有广泛的药理作用：可活化巨噬细胞刺激抗体产生，提高人体免疫能力，改善呼吸系统，可使肾上腺重量、血浆皮质醇、醛固酮及肾上腺内胆固醇

16、含量增加，有促进肾上腺的作用，抑制肿瘤生长，并具有抗肿瘤10、抗辐射、降血糖和脂蛋白、止咳、化痰、润肺和延缓衰老等药理作用，此外,虫草多糖还能抗心律失常，抗心肌缺血，扩张外周血管，降压，降血脂，抑制血小板聚集。 李连德11等在虫草多糖研究进展（综述）中总结道：多糖是存在于自然界的醛糖和酮糖通过糖苷键连在一起的多聚物，是一切有生命的有机体必不可少的成分，同维持生物机能密切相关。多糖作为药物始于1943年，并广泛作为广谱免疫抑制剂。多糖是非特异性的免疫调节剂（生物效应调节剂BRM），它主要影响网状内皮系统（RES）、巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞以及RNA、DNA、蛋白质的合成、CAMP（环化腺苷-磷

17、酸）的含量，抗体的生成、补体的形成以及干扰素的诱生，并具有抗肿瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等活性。2.1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质12。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。赵勇13在超氧化物歧化酶（SOD）的应用研究进展中验证：超氧化

18、物歧化酶（SOD）广泛存在与一切生物机体内，通过催化超氧阴离子自由基发生歧化反应、减轻或消除超氧阴离子自由基对机体的损害。超氧化物歧化酶还可以被应用在医药、食品、农业和化妆品等领域14。2.1.2.5 麦角甾醇 麦角甾醇是生产维生素D2的前体，也是生产激素类药物的中间体，可用来生产可的松、黄体酮，有维生素D2的作用。邓玉清15等人在微生物麦角甾醇的研究进展中印证了：角固醇是微生物细胞膜的重要组成部份，对确保细胞膜的完整性，膜结合酶的活性，膜的流动性，细胞活力以及细胞物质运输等起着重要作用。 高虹16等人在巴西菇麦角甾醇抗肿瘤活性及作用机理初探结果表明：巴西菇子实体中提取的麦角甾醇在剂量10mg

19、/kgd、50mg/kgd和100mg/kgd时的瘤重抑制率分别为62.75%、77.61%和79.18%，说明麦角甾醇有较强的抑瘤活性。2.1.2.6 其他成分 除上述成分外，还包含多种微量元素以及虫草素在内的腺苷、尿苷、尿嘧啶、腺嘌呤等物质。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷是用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。蛹虫草富含硒，硒被称为微量元素中的抗癌之王，是谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)的必需组分，GSH-P

20、X可引起人体不断产生可致癌自由基的破坏。此外，蛹虫草子实体中含有的氨基酸、维生素对蛹虫草的功效开发也有一定作用。2.1.3 药用价值2.1.3.1 提高免疫力 蛹虫草子实体中含有的虫草多糖是提高免疫力的最主要的原因。虫草的82.2%为不饱和脂肪酸，此外，尚含有维生素B12、麦角脂醇、六碳糖醇、多种生物碱等，具有调节免疫系统功能，提高细胞能量、抗疲劳的功效。徐廷万17等实验得出：人工蛹虫草胞外多糖可增强免疫功能被抑制的非特异性免疫功能和体液免疫功能，还有抗疲劳作用。戴瑛18等实验得出：蛹虫草提取物可调节小鼠机体组织的免疫功能，可以缓解由于内毒素或类似物质造成的肺部炎症，具有一定的肺保护作用。刘海

21、燕、魏本征19等也通过实验表明：柞蚕蛹虫草对小鼠机体的非特异性免疫功能有明显的增强作用。2.1.3.2 抗癌作用 蛹虫草有良好的抗癌作用，而发挥最大功效的就是蛹虫草子实体中的虫草素。孙艳等通过对荷肝癌小鼠的实验得出，人工蛹虫草子实体具有抑癌作用，除直接作用外，还可使宿主特异性免疫功能增强而获得明显的免疫保护效应。孙科峰20等实验表明：蛹虫草子实体可明显延长S180 腹水型小鼠的生存率,对S180 实体瘤小鼠的肿块生长有一定的抑制作用;对S180 荷瘤小鼠的肿瘤免疫活性因子TNF-和IL-2 有明显的促进作用。汤新强21等将人工蛹虫草胞外多糖与治疗剂量的卡铂合用，可增强卡铂的抗肿瘤作用。2.1.

22、3.3 抑菌、抗炎作用 虫草素对葡萄球菌、链球菌、鼻疽杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌等均有抑制作用。蛹虫草煎剂对须疮癣菌、絮状表皮癣菌、石膏样小芽孢癣菌、羊毛状小芽孢癣菌等真菌及鸟结核杆菌、枯草杆菌、鼻疽杆菌等结核杆菌也均有抑制作用。宾文等22实验表明，人工培养蛹虫草多糖具有抗炎作用，对细胞免疫没有明显的影响。2.1.3.4 镇静、抗惊厥作用 陈桂宝23等研究表明，蛹虫草有明显的镇静、耐缺氧、抗炎等作用，对异丙肾上腺素诱发小鼠心肌耗氧量增加也有明显的保护作用。陈敬民24等发现蛹虫草能明显减少小鼠的自主活动,拮抗戊四氮所致的小鼠惊厥和一定程度协同戊巴比妥钠诱发小鼠睡眠,表明蛹虫草具有镇静催眠

23、作用。2.1.3.5 抗衰老作用 年龄的增长和某些体外因素会造成机体和皮肤组织自由基产生超过机体正常清除自由基的的能力，从而使皮肤组织造成伤害，导致衰老。由于SOD能够清除自由基，因而可以延缓衰老。人之所以会衰老，老化迹象一点一滴出观，如色素沉淀、体力衰退、是因为体内产生氧化作用，所谓“氧化作用”就类似于生锈，抗氧化剂的补充有助于降低氧化的速度，减慢衰老的脚步。 王琦25等实验结果表明，蛹虫草能明显降低老年大鼠体内的过氧化脂质（LPO）含量和自由基水平，进而保护细胞免受O2-损害，延缓器官和整个机体的衰老。张桂英等也做了这方面的实验，结论是柞蚕蛹虫草具有提高老龄大鼠超氧化物岐化酶（SOD）、谷

24、胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和明显降低LPO含量的作用。2.1.3.6 降血脂 赵鹏26等用不同剂量的蛹虫草菌丝体粉对大鼠的灌胃实验得出：蛹虫草菌丝体具有降低血脂的作用。2.1.3.7 其他作用 除以上功效外，蛹虫草子实体还有其他功能，例如：抗病毒、抗菌、明显抑制肿瘤生长、干扰人体RNA 及DNA合成，预防治疗脑血栓、脑溢血、肾功能衰竭，利尿，同时还有抑制血小板积聚防止血栓形成，消除面斑，抗衰防皱的功效。2.2 天然色素色素可分为天然色素和合成色素两大类。而来源于天然植物的根、茎、叶、花、果实和动物、微生物等的色素，称为天然色素。由于天然色素对人体无毒无害，营养价值高，且有些具有一定的

25、生物活性，而从添加量上看食用色素在食品中占的比例很小，一般为产品，饮料、酒类、糕点、糖果、医药等的千分之几、万分之几甚至是十万分之几。2.2.1 天然色素的种类天然色素按来源和性质，可分为植物、动物、微生物和矿物色素。矿物色素大多对人体有害，现已不再用于食品着色，动物、微生物色素的应用也较少。天然植物色素可根据化学结构，形态来源和溶解性进行分类，最常用的方法是按照化学结构来分类。2.2.1.1 多酚类色素 多酚类色素主要包括：茶黄色素、多穗柯棕、儿茶黑色素、金樱子棕等。2.2.1.2 类胡萝卜素类 类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，属于化合物。普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类和细菌中的

26、黄色、橙红色或红色的色素，主要是-胡萝卜素和-胡萝卜素，因此而得名。不溶于水，溶于脂肪和脂肪溶剂，亦称脂色素。主要包括：番茄色素（番茄红素）、天然胡萝卜素、混合类胡萝卜素、玉米黄、胭脂俗橙色素、藏红花色素、栀子黄色素、栀子绿色素、辣椒红色素、甜椒红色素、辣椒橙色素、南瓜黄色素、沙棘黄、密蒙黄色素、柑橘披黄色素、苜蓿色素、万寿菊色素、柑橘黄、枸杞色素、银杏黄色素、苦瓜色素、蒲公英色素等。2.2.1.3 酮类色素 酮类色素主要包括：姜黄色素、姜黄油树脂、姜黄、姜黄素、郁金色素、郁金香红色素等。2.2.1.4 醌类色素醌类色素主要包括：茜草红色素、紫草红、紫草色素、紫蓝红色素、紫草素、虎杖色素、凤仙

27、花红色素、决明子红色素等。2.2.2 天然色素的性质2.2.2.1 副作用小，安全性高 绝大多数天然色素来自动物、植物组织。因此无毒副作用，安全性高。天然植物色素大多为花青素类、类胡萝卜素等，因此天然色素不但是无毒无害的物质，而且还含有很多人体必须的营养物质和微生物物质，例如番茄红色素，-胡萝卜素等。2.2.2.2 色调比较自然，能较好的模仿天然物的颜色 植物色素的着色色调比较自然，既可增加色调，又与天然色泽相近，是一种自然的美。植物色素在植物体中含量较少，分离纯化较为困难27，其中有的共存物存在时还可能产生异味，因此生产成本较合成色素高。2.2.2.3 部分天然色素对热、氧、金属及pH值等敏

28、感，稳定性较差2.2.2.4 天然色素的种类繁多，性质复杂2.2.3 天然色素的结构特点 按照化学结构不同可分为四吡咯类色素(如叶绿素)、类胡萝卜色素(如辣椒红色素)、花青类色素(如葡萄红色素)、黄酮类色素(如高粱红色素)、醌类色素(如紫草色素)、其它类色素(如焦糖色素、姜黄色素、甜菜红色素等)。2.2.3.1 四吡咯类色素 目前应用于食品着色的四吡咯类色素主要有叶绿素、血红素、胆红素和蓝藻素28。这类色素的基本结构都是由四个吡咯环的-碳原子通过次甲基相连而构成的复杂共轭体系，该共轭体系一般与金属离子(Mg2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+)结合。四吡咯环共轭结构比较稳定，这类色素的性能主要由

29、共体系结合的金属离子和衍生的外围结构决定。2.2.3.2 类胡萝卜色素 系共轭烯烃（或共轭烯烃的含氧衍生物），能有效的防止自由基对脂质内侧生物膜的损害，而且还是有效的氧自由基捕获器29。例如：-胡萝卜素食维生素A的前体，可提高机体的免疫功能，可防治中风、心血管疾病的作用30；番茄红素可以清除自由基，并能有效预防前列腺癌的发生，还可以激活免疫细胞，防止心脑血管疾病的发生；玉米黄色素是单线态氧，可防止脂质过氧化反应的链式传递，从而可以清除膜内的自由基，维持生物膜的完整性；栀子黄色素具有抗氧化能力和解热、消炎、利胆的功效。2.2.3.3 类黄酮类色素 黄酮类色素是带有C6-C3-C6的水溶性酚类物质

30、，可以切断体内产生衰老和疾病的过氧化链式反应。黄酮类色素还可以保护血管，调节血管的扩张，防止动脉硬化和栓塞。2.2.3.4 花色苷类色素 花色苷类色素由糖苷和糖组成，一般情况下为水溶性，能强烈的吸收紫外线，使细胞分化和其他生命过程正常进行，还可以预防冠心病和心急缺损等。徐清海31天然色素的提取及其生理功能中提到：从我国食药两用的紫苏中提取的紫苏色素，有解毒、散寒、行气和胃的功效。2.2.3.5 醌类色素 醌类色素因其结构中有多个酚羟基，所以具有一定的抗氧化活性以及抗菌、抗癌、抗病毒的作用。2.3 天然色素提取方法2.3.1一般提取法蛹虫草子实体天然色素的提取一般是采用研磨的方法32。通常先用石

31、英砂协助研磨，再加入丙酮作助磨剂浸提后得到天然色素。由于不同研究者用的提取方法不同，所以蛹虫草子实体中天然色素的得率也不同。 张志军33等人称取1g蛹虫草子实体的样品，加入0.5g石英砂后研磨，并同时加入20mL丙酮作为助磨剂，在研磨15min之后，将所得的混合物直接用于浸提处理。稍后再室温下振荡30min，之后经过4000r/min的离心机离心10min，最后取得蛹虫草子实体中的天然色素提取液。最后经紫外-可见光吸收光谱法测得天然色素的产量为718g/g。 适用范围：溶于丙酮的色素2.3.2 酸热提取法2.3.2.1 原理主要是由于酸热法使用了对细胞壁中原来结构紧密的某些成分(多糖和蛋白质等

32、)具有强力疏松作用的盐酸，并配合沸水处理及速冷处理，使细胞壁结构得以破坏，胞内物质溶出。2.3.2.2 特点该法设备简单、能耗小、成本低 2.3.2.3 适用范围 对热和pH值不敏感的色素 参照郭鹏飞34等的方法，每克蛹虫草子实体的样品加2mol/L盐酸10mL，在室温下浸泡40min，随后在沸水浴中处理4min，迅速冷却后，再3000r/min的离心机中离心10min，弃上清液后，将沉淀用蒸馏水洗涤2次后加20mL丙酮，室温下振荡30min以浸提虫草子实体中的天然色素，然后再在4000r/min条件下离心15min，得上清液即为天然色素的浸提液。最后经紫外-可见光吸收光谱法测得天然色素的产量为2736g/g。2.3.3 微波提取法2.3.3.1 原理微波所产生的电磁场使被萃取的部分向萃取溶剂界面扩散