分子生物学之表观遗传学.docx

1、分子生物学之表观遗传学分子生物学：表观遗传学表观遗传学(epigenetics):指非基因序列变化导致的基因表达的可遗传的改变。细胞中生物信息的表达受两种因素的调控 ：遗传调控提供了 “生产维持生命活动所必需的蛋白质的“蓝本”，而表观遗传调控则指导细胞怎样、何时和何地表达这些遗传信 息。表观遗传学研究的主要内容 ：DNA的甲基化，染色质的物理重塑和化学修饰，非编码 RNA基因调节。依赖ATP的染色质的重塑由ATP水解释放的能量可以使 DNA和组蛋白的构象发生改变； 包括DNA的甲基化和组蛋白 N端尾巴上特殊位点的化学基团修饰，同样可以直按或间 接地影响染色质的结构和功能。二者之间相互渗透，相互

2、作用，共同影响着染色质的结 构和基因的表达。此外，近些年发现转录组 (transcriptome)中组有多种非编码 RNA广泛参与基因表达调控，非编码 RNA的基因调节也可属于表观遗传学的研究的范畴。DNA甲基化的概况DNA的甲基化既可以发生在腺嘌呤的第 6位氮原子上，也可以发生在胞嘧啶的第 5位碳原子上。*在真核生物中，DNA甲基化只发生在胞嘧啶第 5位碳原子上。真核DNA甲基化 由DNA甲基转移酶(Dnmt, DNA methyltransferase)催化，S腺苷甲硫氨 酸(SAM, S-adenosyl methionine)作为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶上， 生成5 一甲基胞嘧啶(

3、5-mC)。NH,图2-1 胞囁唏和5-甲基胸戦皈的化学结构在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在 CpG双核苷酸序列，全部 CG二核苷酸中约70%80%的C是甲基化（mCpG）,所以CpG称为甲基化位点。CG抑制:DNA中CG的排列出现的概率小于期望值 1/16 （A42+4=16）,如人的基因组中CG排列小于1%,而非随机期望的约 6%（ 1/16）.基因组中的CpG位点并非均一分布。在某些区域中 （大约有3003 000 bp） , CpG位点出现的密度高（50%或更高），这些区域即所谓的 CpG岛。大部分CpG岛（200bp, C+G含量=/50%. CpG观测值/期望值=/0.6）位于

4、基因的5 端,包括基因的启动子区域和第一外显子区,而且 60%的人类 （哺乳动物 40%）基因组的启动子区都含有CpG岛（几乎所有管家基因都存在 CpG岛）,它们在基因表达调控中可能 发挥着重要的作用。另外，DNA复制起始点也往往与 CpG岛位置相互重合，但是具体的 生物学意义尚待研究。甲基化反应分为 ：维持性甲基化 （maintenance methylation） 和从头甲基化 （de novo methylation） 。从头甲基化：是对DNA上甲基状态的重新构建， 不依赖DNA复制，由DNMT3a/3b催化,在完全非甲基化的位点上由引入甲基。这是甲基化的建立机制。维持性甲基化： 与 D

5、NA 的复制相关联, DNA 复制后,新合成的子代链是非甲基化的, DNMT1识别新生成的DNA双链中亲代单链上的 mCpG位点，催化互补链相应位置的甲 基化,以维持亲代双链甲基化的状态。DNA （CpG岛）甲基化修饰，主要发挥对 DNA的保护作用，抑制基因转录。 这种修饰 已发现这和许多重要的生物现象相关,包括：染色质结构改变、基因印迹、转座子和 X染色体活性抑制、细胞分化、以及包括癌症等疾病发生。DNA （CpG岛）甲基化由各种 DNA甲基化转移酶（DNA methyl transferase, DNMT）完成。 其生物效应则主要通过一些含有与 mCpG结合（methyl-CpG-b in

6、 di ng domai n, MBD）结构 域的蛋白 MBDP 介导。DNMT1:发挥DNA维持性甲基化的重要作用，此外还参与了许多重要生命活动， 如在DNA复制修复过程中发挥要的作用。甲基化 DNA的最小结构单位称为甲基 CpG结合域（Methyl-CpG-b in di ng domai n, MBD）, 甲基化结合蛋白家族据其结构域不同 , 分为三大类：第一类：蛋白质仅含有 MBD 结构域 （有的还有转录抑制结构域 ）,包括 MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3、和 MBD4,共 5 种；第二类：蛋白质除了 MBD 结构域外,其 C 端还有 DDT、 PHD、 bromodomai

7、n 三种蛋白 质结构，包括人类 BA22a和BA22b以及鼠TIP5等；第三类：蛋白质在 MBD的C端有Pre-SET和SET的结构域，如人类的 SETDB1和CLLD8MBD2a的双重作用：抑制CRE甲基化基因的转录；增强 CRE非甲基化基因的转录。(A)当基因启动子区的DNA元件CRE甲基化时，MBD2a可以识别甲基化修饰，通过招募其他蛋白形成 MeCPI复合物抑制基因的表达。(B)当CRE非甲基化时，转录因子 CREB与该元件结合，通过 RHA招募RNA聚合酶，启 动转录，此时 MBD2a可以与RHA结合，增强转录激活的效应。夫屮耳化的CREDNA甲基化模式的建立：1、 在哺乳动物中，D

8、NMT3a/3b催化DNA重新甲基化；但也在一定条件下参与 DNA维持性甲基化，DNMT3a/3b的定位依赖于其本身或相关染色质蛋白与 DNA甲基化的识别；2、 在哺乳动物中，DNMT1在体细胞中维持 DNA甲基化模式的遗传中发挥主导作用； 但DNA甲基化的维持可能是染色质相关蛋白和几种 DNA甲基化转移酶协同作用的结果；3、 DNA甲基化模式的维持不是简单的点对点的精确维持，而是一种“状态”维持 ，即DNA某一区域总体甲基化的状态在细胞分裂过程中是稳定遗传(维持)的，但具体到某个特定的CpG位点，不同细胞克隆或亲代与子代之间可能是不同的。4、 无论基因是激活的还是失活的，体细胞中大部分 Cp

9、G岛是非甲基化的。体细胞内的DNA甲基转移酶可能不是以游离状态而是与染色质结合存在的。5、组蛋白的化学修饰和染色质重塑与 DNA甲基化之间有着密切的联系，染色质相关蛋白的化学修饰和染色质（物理）重塑与 DNA甲基化相互影响。普遍认可的DNA甲基化模式是：DNMT3a/3b催化DNA重新甲基化，DNMT1在体细胞中 维持DNA甲基化模式的遗传。DNA甲基化的维持可能是染色质相关蛋白和几种 DNA甲基化转移酶协同作用的结果（DNA维持甲基化的新模型）维持甲基化的新模型：1、 DNMT1通过PCNA和/或NP95定位在复制叉并识别半甲基化的 DNA,将子链DNA新掺入的胞嘧啶甲基化，当复制叉过后，被

10、 DNMT1遗漏的胞嘧啶可由 DNMT3a/3b甲基化。2、 DNMT3a/3b对半甲基化 DNA和非甲基化 DNA没有选择性，亲代与子代 DNA甲基化 的维持是“状态”而非“点对点”的维持。DNA甲基化的作用机制DNA甲基化参与的生命活动主要包括： 基因调控、DNA的复制与组装、细胞的损伤修复与凋亡，及DNA的转座和重置等方面。（一） DNA甲基化对基因表达的调控作用DNA甲基化对基因表达的抑制活性是多方面的作用共同导致的， 既有甲基化对转录激活因子直接的排斥作用，也包含有甲基化结合蛋白所介导的对基因表达的抑制活性。1甲基化影响一部分转录因子的 DNA结合活性甲基化时，阻碍了转录因子对 DN

11、A序列的识别，不能有效启动转录。2.MBD家族介导的转录抑制（间接抑制）MBD家族蛋白的MBD结构域可以与甲基化或半甲基化的 DNA相互结合；其转录抑制相关的结构域（TRD可以与多种转录抑制因子相互结合以发挥抑制基因表达的活性。RNA3.DNMT 家族介导的转录抑制 通过影响组蛋白的活性而影响基因的表达。这一功能的意义可能在于抑制 DNA 复制过 程伴随的基因转录，从而保证复制过程的顺利完成。4.DNA 甲基化和基因表达抑制之间的关系不仅是单向的（二） DNA 甲基化与 DNA 的复制与染色体的组装在S期早期，由于常染色质 DNA首先进行复制，因而子代产物的组装比较疏松；而在 S 期后期，异染

12、色质的 DNA开始复制，因而组装的子代 DNA结构变得紧密。这种组装的 差异性一部分是通过识别局部甲基化的程度而精密调节的。碱基序列的合成复制， 同时也是维持甲基化的过程，两者的偶联也是依赖一个精密的机 制而实现的。复制初期的复制复合物较小，除了 DNA 复制的基本成分，还有 DNMT1 和 DMAPl（DNAmethyltransferase associated protein l） 结合到复制复合物上，抑制可能伴随发生的基因的 转录，并且催化实现 DNA 的维持甲基化。而在复制晚期， DNA 复制复合物逐渐变大， HDAC2 D NMT3a/3b ， MBD2-MBD3 等都参 与了复制

13、复合物的形成，并促进了异染色质结构的形成。（三） DNA 甲基化与细胞损伤与修复1、 甲基化可以引起 DNA的多种损伤。2、 甲基化参与到DNA损伤修复并可调控相关基因的表达。 （如DNMTI-/-的胚胎往往未 能出生就死去了，可能就是因为甲基化程度降低，导致凋亡基因的活化，以及染色体的 不稳定性增加，从而使细胞对环境变化非常敏感，机体抵抗力下降。 ）3、 在错配修复中，甲基化还起着识别新链和旧链的作用，从而正确指导这一过程。（四）DNA甲基化与DNA的转座真核基因组 DNA 大量的转转座成分的存在，一方面可以缓冲对基因组的打击；另一方 面，其自身也构成基因组的不未定因素，因此，转座子的活性必

14、须得到有效控制。 逆转座子由于缺失了启动子是没有活性， 而少部分有活性的转座子则因为甲基化对它的 抑制作用而失活。在甲基化异常降低的情况下，它们的活性可能增加，而产生逆转录可 能会导致关键基因的失活而引起细胞的死亡或癌变。DNA甲基化的生物效应（一） 甲基化与遗传性疾病的相互关系（二）甲基化在癌症发生、发展中的作用肿瘤细胞的甲基化模式与正常细胞相比有较大的改变。全基因组的甲基化有所下降，但CpG岛的咼甲基化异常增咼。基因组的低甲基化会导致基因组不稳定性的增加；局部的高甲基化会抑制抑癌基因的表达，诱使基因突变，还可以导致基因的丢失。1. 甲基化的胞嘧啶是体内突变的热点： （1）甲基化胞嘧啶自发脱

15、氨基增加了 C转变为T的突变频率。甲基化的胞嘧啶无论是在体内还是体外不需酶的参与就能发生自发脱氨基反应，使m5C转变为T,且不易被修复。（2）甲基化胞嘧啶的外源性的突变概率也会增高。 甲基化胞嘧啶对紫外线的物理损伤更加敏感，而且与致癌物的亲和力也会增加。2.CpG岛异常咼甲基化：抑癌基因 DNA启动子区域的甲基化被看作肿瘤抑制基因失活 的主要机制。3.基因组广泛低甲基化：肿瘤基因组中广泛低甲基化的程度和肿瘤的恶 性程度密切相关，低甲基化在诱导染色体不稳定性中也起了极大的作用。4.癌症演进过程中，甲基化状态的改变：由于不同癌细胞甲基化进展的程度不同，使 之成为癌组织异质性的重要原因之一。DNA甲基化的生物应用5-氮胞苷和5-氮-2-脱氧胞苷是通有效的 DNMT抑制剂。能掺人到DNA直接抑制DNA 合成，并且还能作为胞嘧啶的类似物有效地与 DNITl结合，使其不能够再甲基化其他 DNA 中的胞嘧啶，失去维持甲基化的能力。前者还可掺人 RNA抑制翻译而后者 DNA并与DNMT1不可逆结合，应用性强。DNA去甲基化药物DNA甲基化的检测方法（一）亚硫酸氢钠法：依赖亚硫酸氢钠 （sodium bisulfite）对甲基化和非甲基化的胞嘧啶的化学活性不同把两者区分开来使 DNA中的C在转变为T,仅mC保留为CD