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1、中南大学生物科学与技术学院中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教 案授课科目: 医学分子生物学授课内容: 基因工程与体外表达授课对象：临床医学七年制、八年制授课时数：6 学时授课教师：授课地点：湘雅医学院新教学区授课时间：授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材），胡维新主编，北京：科学出版社，2007年2月，第一版；医学分子生物学（卫生部8年制规划教材），冯作化主编，北京： 人民卫生出版社，2005，第一版第八章 基因工程与体外表达一、目的要求：掌握：常用克隆载体；基因克隆的基本过程；外源基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的原理和方法。熟悉：限制性核酸内切酶和其他常用工具酶的概

2、念和特点；定点诱变技术原理。了解：昆虫表达系统；酵母表达系统。二、讲授重点：基因克隆的基本过程。三、讲授难点：互补筛选；阳性转染细胞的筛选；定点诱变技术原理。四、教学方法：多媒体教学五、教 具：多媒体课件六、讲授内容：第一节 基因工程中的工具酶一、限制性核酸内切酶（restriction enzyme） 限制性核酸内切酶是基因克隆中最重要的工具酶，主要从原核细胞中提取。它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。1限制性核酸内切酶的分类 型酶具有限制和DNA修饰作用。这种酶在非特异性位点,通常在识别位点下游100到1 000bp处切割DNA。型酶 能在DNA分子内部的

3、特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 型酶与型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。2限制性内切酶的命名 EcoR E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株3限制性内切酶的识别和切割位点 通常是46个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5或3粘性末端（sticky end）。 如EcoR切割后产生5粘性末端.Pst切割后产生3粘性末端.有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Blunt end）, 如Sma.二、其他常用的工具酶1. DNA聚合酶

4、(DNA polymerase I) 有聚合酶活性, 35核酸外切酶活性, 53核酸外切酶活性。 2. DNA聚合酶大片段DNA聚合酶大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 有53聚合酶活性, 35核酸外切酶活性, 无53核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途有：(1) 补齐双链DNA的3末端。(2) 通过补齐3端，使3末端标记。(3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。(4) DNA序列分析。3. 逆转录酶（r

5、everse transcriptase） 是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA，合成时需要四种脱氧核苷酸及3-OH引物，合成方向为53延伸，无35外切酶活性。广泛用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。 4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷酸根形成35磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。6

6、. 末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT），简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。第二节 基因克隆的载体 外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效的方法将导入了外源DNA片段的细胞和没有导入外源DNA的细胞区分开来。此外，外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，即没有自主复制能力，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就

7、需要有一个能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的载体(vector)来携带。外源DNA片段与载体在体外连接，构成重组分子，然后导入宿主细胞，使之进行扩增或表达。 一、质粒（plasmid） 质粒是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。 质粒含有复制起始点，此复制起始点与其他一些顺式调控因子构成复制子，能利用细菌染色体DNA复制和转录的同一套酶系统，在细菌体内独立地进行自我复制及转录。 作为克隆载体的质粒应具备下列特点： （1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。 （2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶基因（La

8、c Z）等。 （3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。二、噬菌体 噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种：一种是噬菌体，另一种是M13噬菌体。 野生型噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。 噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。 目前应用较广的是EMBL系列、gt系列和Charon系列等。gt10和gt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。 g

9、t11为表达型载体。三、粘性质粒（cosmid） 粘性质粒是由噬菌体的噬菌体的粘性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达4050kb。 四、M13噬菌体 M13噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。当每个细菌体内的复制型M13拷贝数积累到100200后，M13的合成就变得不对称，只有其中一条链进行复制，产生大量的单链DNA，并被包装到成熟的噬菌体颗粒中，然后从细菌中排出。M13噬菌体的最大优点在于从细菌体内释放出的颗粒中所含的单链DNA。

10、五、病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。第三节 基因克隆的基本过程 基因克隆主要分为以下几个步骤：制备目的基因和相关载体；将目的基因和有关载体进行连接；将重组的DNA导入受体细胞；DNA重组体的筛选和鉴定；DNA重组体的扩增、表达和其他研究。 一、 目的基因的获得（一）从基因组文库中获得 一个生物体的基因组用限制性内切酶部分酶切后 ,将酶切片段克隆在载体分子中 ,所有这些插入了基因组片段的载体分子的集合体 ,将包含了这个生物体的整个基因组 ,也就是构

11、成了这个生物体的基因文库。（二）从cDNA文库（cDNA library）中获得 cDNA文库是指某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆.（三）PCR扩增特定基因（四）人工合成二.载体的选择与准备根据目的基因的大小和研究的目的选择合适的载体。三、DNA分子的体外连接（一）黏性末端（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接 四、外源基因导入宿主细胞 将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞，常用的方法有转化（transformation）感染（infection）和转染（transfection）. （一）转化（transformation） 转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于

12、感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在CaCl2溶液中，并置于低温（05）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞（competent cell）。 （二）感染（infection） 噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（transduction）。（三）转染（transfection） 转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源

13、DNA片段而获得新的表型的过程。 常用的方法有电穿孔法（electroporation）、CaPO4沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。 五、目的基因的筛选与鉴定 将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。（一） 遗传学方法 1. 抗生素筛选法(1) 单抗生素筛选 大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）、四环素(Tetracycline,Tet)、卡那霉素(kanamycin, Kan)抗性基

14、因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。用该法可筛选出转化子，但不能区分含目的基因的转化子和不含目的基因的转化子。（2）双抗生素筛选含有两个或两个以上选择标志的载体,如pBR322带有Amp和Tet抗性基因，将外源基因插入Tet基因内，则Tet基因失活，所构建的重组质粒转化菌落能在含Amp的培养板中生长，而不能在含Tet的培养板中生长。 2. 蓝-白筛选（互补）用图表示 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编

15、码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为互补。因此，当载体的多克隆位点没有插入外源DNA片段时，互补能正常进行，产生有活性的-半乳糖苷酶。当在诱导剂IPTG（isopropyl-D- thiogalactopyranoside，异丙基-D-硫代半乳糖苷）和人工底物X-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D- galactopyranoside，5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）存在时，产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多克隆位点插入了外源DNA片段，导致产生无互补能力的氨基端片段

16、。在IPTG及X-gal存在时，带重组体的细菌形成白色菌斑或菌落。 （二） 免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。 （三） 核酸杂交法 对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。 进行原位杂交时，先将重组质粒或重组噬菌体的细菌生长在琼脂平板上，形成单个菌落或噬菌斑，再把圆型硝酸纤维膜或尼龙膜覆盖于长有菌落或噬菌斑的琼脂平板的表面，定好位，把膜轻轻揭起，这样就有部分细菌或噬菌体吸附于膜上，再用碱处理膜

17、上的DNA，使之变性。烘干固定DNA，然后用32P标记的DNA或RNA探针杂交、洗膜、用X光片曝光。凡是含有与探针DNA互补序列的菌落或噬菌斑，在放射自显影后，会在X光片上产生阳性斑点。然后根据斑点在平板上的相应位置，找出阳性克隆。（四） PCR技术 PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。 (五) 酶切鉴定 用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。 第四节 真核细胞转染一. 真核细胞转染的方法与基本原理（一）磷酸钙共沉淀法（calcium phosphate

18、co-precipitation） 使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，并加入到宿主细胞中，使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细胞摄取这些颗粒。 （二）电穿孔法（electroporation） 是一种将外源DNA导入宿主细胞的常用方法。操作时将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA能进入宿主细胞，并整合至宿主细胞基因组中，以建立稳定的转化细胞株。（三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法 外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合

19、，并粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源DNA进入细胞。此法简单、快速、有效，常用于外源基因的短暂表达研究。 （四）脂质体（liposome）介导的基因导入 利用脂质体将外源基因导入到真核细胞是一种常用的简单而快速的基因导入方法。其原理是阳离子脂质体与DNA混合后，形成一种稳定的复合物。这种复合物可直接加到培养的细胞中，然后粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。 这种温和的基因转移的方法，对细胞无损伤，因而其转移效率高。 （五）显微注射法（microinjection） 在制备转基因动物时，将外源基因通过毛细玻璃管，在显微镜下直接注射到受精卵的细胞核内。二. 转染细胞的筛选

20、( 一) TK-细胞突变株筛选转染细胞细胞内TTP的合成有两条途径 从头合成 可被氨甲喋呤阻断 补救合成 胸苷激酶(TK)是关键酶TK+: 细胞生长TK- 细胞 + 含TK基因的载体: 细胞生长（二）药物筛选转染细胞 哺乳动物细胞中最常用的选择性标记物中包括有细菌新霉素抗性基因（neor）。此基因具有对氨基糖苷抗生素G-418（新霉素衍生物）的抗性。G-418是用于阻断细胞内的蛋白质合成，从而达到杀伤真核细胞的目的。如果将带有neor基因的质粒导入细胞，并在含有G-418的培养基中培养，未转染的细胞被杀死，而存活的细胞便是转染细胞。 第五节 基因的改造 一. 基因定点诱变技术 (一)寡核苷酸介

21、导的定点诱变法的建立 （二）含U模板法 （三）PCR介导的定点诱变法二、基因定点诱变技术的应用 在工业生产上，常常希望所用的酶具有更长的半衰期、更高的稳定性，能够适应更广的酸碱度范围。在临床医学方面，希望所用的蛋白质或多肽药物的疗效更高、副作用更小，代谢半衰期更长。显然，天然蛋白质还不能完全满足上述各种需要。因此，要求对自然界存在的蛋白质进行改造。第六节 克隆基因的表达 基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。

22、一、大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架, 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定.大肠杆菌表达外源基因的劣势1.缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 如糖基化或磷酸化等修饰作用 2. 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白, 造成表达产物不稳定 （一）基因表达的基本要素1目的基因和密码子(1) 目的基因 目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA 。 cDNA的始密码子（ATG）上游部分（5端非编码区）必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分。(2) 密码子1 生物体对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白编码基因，对于同一氨基酸

23、所对应的简并密码子，使用频率并不相同，也就是说生物体基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱性。决定这种偏爱性的因素有三：A. 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高，而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。B. 密码子与反密码子相互作用的自由能适中的作用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进行；弱配对作用可能使氨酰基tRNA分子进入核糖体A位需要总费更多的时间；而强配对作用则可能使转肽后核糖体在P位逐出空载tRNA分子耗费更多的时间。如GGG、CCC、GCG、GGC、

24、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多； C. 细胞内tRNA的含量。 密码子偏爱性对外源基因表达的影响由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： A. 外源基因全合成 B. 同步表达相关tRNA编码基因 2载体的选择 所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子（如PL、tac、T7等）和SD序列。 (1

25、)核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） (2)大肠杆菌核糖体结合位点的特征 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； (3)

26、核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列的影响：一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低 SD序列与起始密码子之间的序列的影响SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或

27、AGG取代之，则酶的表达水平低20倍SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低起始密码子及其后续若干密码子的影响：大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构

28、，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的 3目的基因与载体的连接 （1）以限制酶Nde I或Nco I 位点引入ATG，有些载体的SD序列3下游的适当位置构建了一个Nde l（CATATG）或Nco I（CCATGG）位点。因此，切割、修饰目的基因后，利用合适的接头进行连接，Nde I或Nco I位点中的ATG即可作为起始密码子。这种构建方式适合在大肠杆菌中表达非融合蛋白。（2）融合蛋白： 融合蛋白是指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起。有些载体的SD序列后面带有一段大

29、肠杆菌蛋白质的结构基因（一般由几十个氨基酸到一、二百个氨基酸不等），此结构基因的3端为多克隆位点，便于目的基因插入，经转录和翻译之后，即产生融合蛋白。表达融合蛋白的优点：融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解；如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物.可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化.原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性4受体菌株和诱导表达 (1) 根据载体所携带的启动子选择特定的菌株如带有PL启动子的载体，要求宿主菌能表达cIts857阻抑物。带有T7启动子的

30、载体，则需要宿主菌带有T7噬菌体RNA聚合酶基因。对于一个特定的蛋白质来说，并不是在所有的菌株中都能获得相同的表达效率，有时需要试几种菌株，以选择最好的一种。 (2)诱导表达 不同外源基因的诱导表达所需的条件并不完全一样。因此，应摸索不同外源基因最佳的诱导表达条件。即应检测不同的IPTG浓度(0.11.0 mmol/L)，不同的诱导时间(如1 h，2 h，4 h，6 h等)，对外源基因表达的影响。有时还需要检测不同的诱导温度(2037 )对外源基因表达的影响。不同的培养基也会导致表达水平的不同。因此，对诱导表达条件经过优化处理后表达水平仍然很低时，则可试用其他种类的培养基，如M9、YT、NZC

31、YM等培养基。5. 表达蛋白的种类(1)分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的重组异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整 分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多(2) 包涵体及其性质 外源基因表达产物在细菌内的存在形式有可溶性和不可溶性两种方式。表达产物在宿主中的存在形式是可变的。培养基的营养状况好，诱导表达的时间短，降低表达效率