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1、生物工程复习资料生物工程概论生物工程：也叫生物技术，是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。先进的工程技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程发酵工程部分第一节 发酵工程概况（绪论）第二节 微生物发酵过程第三节 液体深层发酵第四节 固体发酵第五节 典型实例（啤酒的发酵、青霉素发酵）第一节 绪 论一、基本概念（一）发酵工程的定义是利用微生物某种功能，通过现代工程技术手段，生产有用物质并直接将微生物应用于工业生产的一种生物技术。又称微生物工程讨论各单元操作中的工艺和设

2、备的一门科学。微生物学、生物化学、和化学工程学的基本原理有机结合起来的科学。 微生物(microorganism)：形体微小具有单细胞或简单的多细胞结构，或没有专一细胞结构的一群最低等生物。 特点：体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。微生物的种类三型九大类真核细胞型微生物细胞核分化程度高，有核膜和核仁，细胞器完整。如酵母菌、霉菌。原核细胞型微生物细胞核的分化较低，仅有原始核，无核膜、核仁。细胞器很不完善。DNA和RNA同时存在。这类微生物众多，有细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体。非细胞型微生物是最小

3、的一类微生物。无典型的细胞结构，只能在活细胞内生长繁殖。核酸类型为DNA或RNA。病毒属之。在自然界分布的特征种类多 10万多种，目前人类认识的不足10%，开发利用不足1%；分布广 空气，土壤，水及极端环境中；繁殖快 世代时间短，几十分钟至一百多分钟。对发酵工业有重要的意义；代谢强 吸收多，转化快，效率高，消耗自重几百至上千倍食物；易变异 单细胞或结构简单易受到外界影响，有好有坏。（可以利用此特征将产量提高或增强菌体的抗药性）微生物与人类的关系绝大多数微生物对人类和动、植物是有益的，而且有些是必需的。1.在自然界中元素的循环2.在工业方面的作用3.在农业方面的作用4.在医药方面的作用只有少数的

4、微生物对人类和动、植物是有害的。（二）发酵的概念传统概念：指酵母作用于果汁或发芽谷物，进行酒精发酵时产生CO2的现象。生物学概念：发酵是指微生物在无氧条件下分解代谢有机物质释放能量的过程。（生化）工业生物学家概念：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程现代概念：培养生物细胞（含动植物和微生物）来制取产物的所有过程（三）发酵工业的概念发酵工业（Fermentation Industry）是利用微生物生命活动产生的酶，对无机或有机原料进行酶加工而获得各种发酵产品的工业。其主体是利用微生物进行生物化学反应的工业。二、发酵工业分类、条件及特点主体是利用微生物进行生物化

5、学反应的工业分类： 食品发酵工业（food fermentation industry） 非食品发酵工业（non-food fermentation industry）我国，通常把由复杂成分构成的，并有较高风味要求的发酵食品，如啤酒、白酒、酱、醋、腐乳、腌菜等副食调味品的生产过程称为酿造工业（brewing industry） 把经过纯种培养，提炼精制获得的成分单纯、无风味要求的酒精、抗生素、柠檬酸、谷氨酸、酶制剂、单细胞蛋白等的生产叫做发酵工业（fermentation industry）发酵过程应具备的条件从发酵和发酵工业的定义可知，要实现发酵过程并得到发酵产品必须具备以下条件：具有某种适

6、宜的微生物 要保证控制微生物进行代谢的各种条件（培养基组成、温度、溶氧浓度、酸碱度等） 要有进行微生物发酵的设备 要有将菌株或代谢产物提取，精制成产品的方法和设备三、发酵工业的发展历史（History of applied microbiology）（四次转折）1.（Ancient times）天然发酵阶段food preservation (vinegar, cheese)flavour (bread, soy sauce)brewing (beer, wine) 特点： 多数产品为嫌气性发酵 非纯种培养 单凭经验传授技术，使产品质量不稳定 （不了解微生物与发酵的关系）2、近代发酵工程时期纯

7、培养技术1665 英国物理学家 Robert Hooke（罗伯特胡克）细胞壁1680 荷兰列文虎克(Antonie vanLeeuwenhoek) 活细胞 人类认识到微生物的存在1850-1880 法国科学家Louis Pasteur 揭示了发酵的秘密，确定了微生物与发酵的关系否定“微生物的自生说”，发明了一种有效的灭菌法-巴斯德灭菌法 (a)无菌营养液通向空气，则出现微生物。巴斯德认为是空气中微生物进入烧瓶，而反对者认为是空气中生命力进入烧瓶；(b)烧瓶被加热和密封后，无生命出现。巴斯德认为是热杀死了微生物，而反对者认为是热破坏了生命力，且生命的产生需空气；(c)烧瓶开口，通入的空气被加热，

8、无生命出现。巴斯德认为是热杀死了空气中微生物，而反对者认为生命力被破坏；(d)雁颈使空气自由进入烧瓶，但微生物被截留，无生命出现。巴斯德观点被证实。 19世纪70-80年代，微生物纯种培养技术取得了很大的进步1872年 Brefeld（布雷菲尔德）进行了霉菌纯种分离和培养1878年 Lister（李斯特）纯培养乳酸菌并测定了菌数1881年 德国Robert Koch（科赫）发明用明胶斜面分离和坚 定菌种的纯培养技术，并发现了多种致病菌，还提 出科赫条件，证明了特定的微生物引起特定的疾病Koch postulate1.在患病的动物体内总能发现特定微生物，而健康的动物体内则没有2.在动物体外可以纯

9、培养此微生物3.将该培养物接种到易感动物体内会引起同样的疾病4.从试验动物及实验室培养物种重新分离得到的微生物应该是同种微生物1887年 Petri （皮特里）改用玻璃平皿取代试管进行分离培 养单菌落，Petri皿（皮式培养皿）（一直使用）上述研究成果使发酵技术的最基本手段微生物的分离和纯种培养方法建立起来。 使发酵技术由天然发酵阶段转向纯培养发酵（ 第一次转折）此阶段特点：产品的生产过程较为简单，对生产要求不高，规模不大产品： 乳酸、酒精、面包酵母、丙酮酸、柠檬酸、淀粉酶、 蛋白酶3、近代发酵工程时期深层培养技术 出现于20世纪40年代，以抗生素的生产为标志 青霉素的发现与大量需求 表面培养

10、法(surface culture) 效价40U/mL，纯度20%，收率30% 二战期间，青霉素发酵生产成功青霉素发酵生产的成功，给发酵工业带来两大功绩： 开拓了以青霉素为先锋的庞大抗生素发酵工业 建立深层培养法（submerged fermentation），把通气搅拌技术引入发酵工业。它使得需氧菌的发酵生产从此走上了大规模工业化生产途径。通气搅拌液体深层发酵技术是现代发酵工业最主要的生产方式深层培养技术的意义 机械搅拌通气发酵 40-50年代，链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等相继问世，使这一时期成为抗生素工业的黄金时代 促进了其他发酵产品的出现，如氨基酸发酵工业 好氧发酵，初级、次

11、级代谢产物机械搅拌通气发酵技术的建立是第二次转折4、近代发酵工程时期代谢控制发酵技术定义：以动态生物化学和微生物遗传学为基础，将微生物进行人工诱变，得到适合于生产某种产品的突变株，再在人工控制的条件下培养，即能选择性地大量生产人们所需要的物质。1956 日本人Kinoshita（木下祝郎） 谷氨酸发酵 已有22种氨基酸用发酵法生产，其中18种直接发酵，4种酶法转化 已用于氨基酸、核苷酸、有机酸以及一部分抗生素的发酵 代谢控制发酵技术的建立是第三次转折5、近代发酵工程时期连续化、自动化发酵技术学科交叉之间的应用：数学、动力学、化学工程原理、电子计算机技术、自动化控制新设备层出不穷 -大大提高生产

12、效率6、近代发酵工程时期开拓发酵原料时期1960-1970期间，为解决粮食危机，出现了以正烷烃为原料生产单细胞蛋白即石油蛋白的研究和生产石油代粮发酵 粮食生产工业化纤维素代粮发酵 7、现代发酵工程时期现代分子生物学技术 （1972）DNA 重组技术、原生质体融合技术等应用 1982，第一个基因工程产品利用工程菌生产的人胰岛素问世 现有许多种类的产品: 红细胞生成素 ( 治疗贫血) 生长激素 ( 促进生长) 胰岛素 (治疗糖尿病) 干扰素 (抗病毒、抗肿瘤) 定义：应用分子生物学和分子遗传学的方法，人为的将任意生物的特定又有用的遗传基因组合到特定微生物的基因中去，在分子水平上选育新的物种，创造新

13、的微生物，从而达到定向改变自然界微生物所不能合成的产物。（基因工程阶段）现代分子生物学技术的应用是第四次转折四、微生物工程的应用（一）微生物工程应用领域1、在食品工业的应用微生物技术最早开发应用的领域，至今产量和产值仍占微生物工程的首位微生物技术最早开发应用的领域，至今产量和产值仍占微生物工程的首位食品加工：单细胞蛋白（酵母、真菌等）含醇饮料：葡萄酒、黄酒、白酒、啤酒、白兰地、威士忌发酵乳制品：奶酪、酸奶调味品：味精、肌苷酸、酱油、醋等2、在医药卫生中的应用 抗生素：12 000余种青霉素、金霉素、四环素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、螺旋霉素、头孢霉素等 氨基酸：可发酵生产的有谷、赖、

14、丙、组、异亮、亮、苯丙、脯、苏、色、酪、缬、瓜、鸟氨酸（国内40亿元，占发酵业产值12%）维生素：VB2 、VB12、Vc、VA、VD等 生物制品：亚单位疫苗、重组疫苗、DNA疫苗等 酶抑制剂： 棒酸（可抑制b-内酰胺酶对青霉素的破坏） a-淀粉酶的抑制剂可治疗糖尿病 胆固醇抑制剂可治疗高血压高血脂3、在轻工业中的应用糖酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基酰化酶、甘露聚糖酶等4、在化工能源中的应用醇及溶剂：乙醇、甘油、异丙醇、丙酮、丁醇、丁二醇等有机酸：醋酸、丙酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、水杨酸等多糖：黄原胶、海藻糖等清洁能源：氢气、微生物燃料电池等5、在农业中的应用生物农药： 杀虫

15、剂（Bt、白僵菌、病毒、微孢子虫） 防治植物病害（假单孢菌、木霉、弱病毒、庆丰霉素）生物除草剂：利用杂草的病原微生物生物增产剂：根瘤菌、蓝细菌、钾细菌、磷细菌等6、在环境保护中的作用污水处理（厌气法、好气法）7、在高技术领域中的应用基因工程的各种工具酶等（二）微生物工程产品类型1、微生物菌体的发酵SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳制剂细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段2、微生物酶发酵1894 日本高峰 米曲霉高峰淀粉酶各种酶制剂糖化酶、氨基酰化酶（DL氨基酸光学拆分）、蛋白酶、脂肪酶等与动植物酶相比：易于进行大规模生产易

16、于改善工艺3、微生物代谢产物发酵初级代谢产物：F 指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质，如氨基酸、核苷酸、脂类、有机酸、糖等，即为初级代谢产物次级代谢产物： F 指某些微生物在一定的生长时期（通常是稳定期），能合成一些具有特定功能的产物，而这些产物与微生物的生长繁殖无明显关系，如抗生素、色素、生物碱、胞外多糖等，即为次级代谢产物比较初级代谢产物和次级代谢产物初级代谢产物：F 与菌体生长相伴随的产物，F 氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂F 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累次级代谢产物： F 与菌体生长不相伴随，以初级代谢产物为原料而合成

17、 F 抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等 F 结构常较复杂对环境条件敏感4、微生物的生物转化 利用微生物细胞的一种或几种酶，作用于一些化合物的特定部位（基团），使它变成结构相类似，但具有更大经济价值的化合物的生化反应。如脱氢、氧化、脱羧、脱水、氨化、异构化等。最突出的生物转化是甾体转化。 反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性5、微生物特殊机能的利用利用微生物消除环境污染（污水、废料处理）保持生态平衡（生物固氮）探矿冶金（硫化细菌）石油脱蜡（深层石油由于吸附在岩石空隙间，难以开采，微生物分解蜡质 增加石油流动性而使石油产量增加）利用基因工程菌开拓发酵工程新领域五、

18、发酵工业的特征 1、发酵原料的选择和预处理2、微生物菌种的选育及扩大培养3、发酵工艺控制及设备选择4、发酵产物的分离提取5、发酵废物的回收及利用六、微生物工程面临的挑战和发展趋向(一）面临的挑战1、化学合成工业的竞争 有机溶剂，如丙酮、丁醇 发酵法产品所占份额已很少 当然也有多种原来通过化工合成的产品逐渐被发酵法所取代，如乳酸2、农业生物工程的冲击 转基因植物中表达生产 PHB、抗体、药物、植酸酶（将饲料中的有机磷转变为动物可以利用的形式，减少粪便中的磷，降低饲养场地区的污染）等二）微生物工程发展趋向1、利用基因工程等先进技术，人工选育和改良菌种，提高现有发酵工业水平 利用基因工程技术，可以根

19、据人们的意愿创造新的物种，这些新物种将为人类做出不可估量的贡献2、利用发酵技术进行高等动植物细胞培养3、固定化酶和细胞技术广泛应用将酶固定在不溶解的膜状或颗粒状聚合物上，使其在连续的催化反应中不流失，从而可以回收并反复利用4、广泛应用于环境工程5、开拓极端酶极端酶由于极端酶的极端稳定性，为开拓新的生物催化和生物转化提供了广阔的应用前景。本章重点重要概念：发酵、发酵工程、微生物工程、发酵工业、初级代谢产物、次级代谢产物、代谢控制发酵技术、了解发酵工业的分类、应具备的条件和特点了解发酵工程的发展史，掌握四个转折点熟悉微生物工程产品的类型第二节 微生物的发酵过程定义：由微生物在生长繁殖过程中所引起的

20、生化反应的过程。又叫微生物反应过程。分类(三种分类方式)：微生物的种类（好氧、厌氧、兼性厌氧）培养基状态发酵设备根据微生物的种类不同，微生物发酵过程可以分为：好氧性发酵：在发酵过程中需要不断的通入一定量的无菌空气。黑曲霉 柠檬酸发酵棒状杆菌 谷氨酸发酵黄单孢菌 多糖发酵厌氧性发酵：在发酵时不需要供给空气。乳酸杆菌 乳酸发酵梭状芽孢杆菌 丙酮、丁醇发酵 根据培养基状态的不同，微生物发酵分固体发酵液体发酵根据发酵设备的不同，微生物发酵分敞口发酵：设备简单，繁殖快，好氧密闭发酵：密闭设备，要求严格，工艺复杂浅盘发酵：（表面培养法）深层发酵：（常用）（重点）液体深层发酵同其他发酵方法相比，优点：液体悬

21、浮状态是很多微生物的最适生长环境易于扩散；易于扩大生产规模液体运输方便，易于机械化操作厂房面积小，生产效率高，易进行自动化控制，产品质量稳定产品易于提取、精制等等因此，液体深层发酵在发酵工业中被广泛应用本节主要内容一、发酵工业中常用的微生物二、培养基三、发酵的一般过程一、发酵工业中常用的微生物 已经探明的微生物有10万种之多，用到的只有10，常用的仅有100多种，能代谢出产物1300种，形成工业生产的有150多种；微生物产生的酶有1000多种，形成工业生产的酶有40多种。常用的工业微生物菌种有： 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌（一）细菌自然界中分布最广、数量最多的一类，单细胞原核生物基本结构：细胞

22、壁、细胞膜和核区繁殖：主要是二分裂方式菌落：菌种鉴定的重要方式发酵工业中常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等主要用于生产：淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸、肌苷酸等1,细菌的结构2、细菌的繁殖：细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖3、细菌的菌落1定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。2特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。3功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。4举例：如金黄色葡萄球菌落、枯草芽孢杆菌落等。（二）放线菌自然界中分布最广，在有机质丰富的微碱性土壤中大

23、量存在。属原核生物类群。大多腐生，少数寄生。结构：营养菌丝（基内菌丝）、气生菌丝、孢子丝繁殖：主要是无性孢子繁殖，菌丝断片繁殖（液体）发酵工业中常用的放线菌有：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等主要用于生产：链霉素、金霉素、土霉素、庆大霉素等2、放线菌的结构3、放线菌的工业应用（三）酵母菌单细胞真核生物，主要分布在含糖质较多的偏酸性环境。结构：单个细胞，细胞壁，细胞膜，细胞质，细胞核繁殖：通常是出芽繁殖鉴定方式：主要是生理生化特性学、分子生物学发酵工业中常用的酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、毕氏酵母等主要用于生产：酿酒、制造面包、生产可食用、药用和饲料用的酵母菌体蛋白等1、酵母菌的形状、大小基本

24、特征：单细胞, 椭圆形、圆形或柱形。 宽1-5um,长5-30um。2、酵母菌的结构3、酵母菌繁殖特殊形态：假菌丝假菌丝是由酵母菌细胞与其子细胞连接而成的链状丝。 4、酵母菌的菌落特征（四）霉菌在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性，多腐生，少寄生繁殖：主要是无性孢子繁殖生长方式：菌丝末端的伸长和顶端分支发酵工业中常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等主要用于生产：霉制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等1、基本特征：菌丝：管状根据菌丝的基本形态分 有隔膜菌丝根据

25、菌丝的分布和功能分2、霉菌的繁殖方式：3、菌落形态：其它的微生物 担子菌、藻类等担子菌即是通常所说的菇类；藻类是自然界分布极广的一大群自养微生物资源，如螺旋藻等；二、 培养基定义：人们提供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。成分和配比：生长、发育、代谢及产物积累，乃至发酵工业的生产工艺都有很大影响。1、培养基的类型：根据营养物质来源 天然培养基： 采用化学成分还不清楚不稳定的植物浸出物，水解液制成合成培养基： 化学成分和数量完全不同的物质配成的半合成培养基：一部分天然有机物体作碳、氮源，再加入一些化学药品作无机盐。根据在生产中的用途不同分（重点）孢子培养基：制备孢子用。

26、要求：能形成大量优质孢子，且不能引起菌种变异通常：基质浓度（特别N）要低，否则影响孢子形成； 无机盐浓度要适量，否则影响孢子的数量和质量。常用Medium：麸皮培养基、大（小）米培养基等种子培养基：供孢子发芽和菌体生长繁殖用要求：营养成分应是易被菌体吸收利用的，同时比较丰富和完整通常：N和维生素略高些，总浓度略稀薄培养基组成随菌种的不同而不同。应考虑种子培养基与发酵培养基组成的内在联系发酵培养基：供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物要求：组成丰富完整；浓度、粘度适中；利于菌体生长，合成大量代谢产物培养基组成须考虑菌体在发酵过程中的各种生化代谢的协调，在产物合成期，使发酵液pH不出现大的波动2、发酵

27、培养基的组成：1碳源：构成菌体和产物的碳架及能量来源。 单糖、多糖；玉米淀粉及其水解液等等2氮源：凡是构成微生物细胞本身的物质或代谢产物中氮素来源的营养物质。 有机氮和无机氮3无机盐和微量元素：微生物的生长、繁殖和产物形成需要各种无机盐和微量元素。生理功能：构成菌体原生质的成分（如磷、硫等）；作为酶的组成成分或酶的活性（镁、铁、锰、锌、钴等）；调节细胞的渗透压和影响细胞膜的通透性（NaCl、KCl等）；参与产物的生物合成等。对微量元素要求是极微的（ug/ml）4生长因子：是一类微生物维持正常生活不可缺少，且自身又不能合成的微量有机化合物。 维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物以及脂肪酸等5水：是

28、培养基的主要组成成分。构成菌体细胞的主要成分一切营养物质传递的介质直接参与许多代谢反应6产物形成的诱导物、前体和促进剂：许多胞外酶的合成需要适当的诱导物存在前体：被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质在有些发酵过程中，添加促进剂能刺激菌株，提高产量三、发酵的一般过程以霉菌发酵为例，发酵的一般过程为：培养基原料培养基配制 培养基灭菌 储备种子 摇瓶 种子罐 生产罐 培养液 产品精制、包装产品提抽 无细胞醪液 菌体分离 菌体1、菌种：菌种来源：自然界中分离、纯化及选育得到经基因工程改造后的“工程菌” 保持稳定的高产菌株 选育更高产、更高质量的优良菌株2、种子扩大培养：定义：将保存在砂土管

29、、冷冻干燥管或冰箱中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面培养基上活化后，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种，这个全过程称为种子扩大培养，这些纯种培养物称为种子。种子制备的方式：菌丝进罐培养孢子进罐培养3、发酵：是在无菌状态下对微生物进行纯种培养，本阶段微生物合成大量的产物，是整个发酵工程的中心环节。要求无菌培养基空气中间补料发酵条件的控制温度pH值罐压空气流量搅拌 等等4、下游处理： 发酵结束后，要对发酵液进行分离和提取精制，将发酵产物制成符合要求的成品第三节 液体深层发酵本节主要内容：1发酵的操作方式2发酵工艺控制3发酵设备4下游加工过程发酵的操作方式 液体深层发酵主要有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型1. 分批发酵定义：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。特点： 操作简单，除了控制温度和pH及通气以外，不进行任何其他控制 从细胞所处的环境看，发酵初期营养物质过多，可能抑制微生物生长；发酵中后期又可能因为营养物减少而降低培养效率 从细胞的增殖来看，初期浓度低，增长慢；后期浓度高，但营养物浓度低，也生长不快