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1、免疫组化教程第一章 免疫细胞化学基本概念及发展简史 一免疫细胞化学的基本概念免疫细胞化学（ immunocytochemistry）是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞特定抗原（或抗体）的定位和定量的技术。应用免疫细胞化学技术可以在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在。从而为生物医学研究生命大分子，特别是那些对细胞化学方法来说尚无作用物或作用物特异性不强的酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的细胞化学手段。二免疫细胞化学的发展简史1941年， Coons等创立了荧光抗体法1959年，

2、Singer创立了铁蛋白法1966年， Nakane等创立了免疫酶技术1971年， Faulk和Taylor 创立了免疫胶体金法1976年， Bayer等提出了亲合组织化学法第二章 免疫细胞化学相关的组织学和细胞学技术一 取材（一） 组织标本的取材1. 活检钳的刃口锋利，以免组织受挤压。2. 取所需组织：主要病变区、病灶与正常组织交界区。必要时取远离病变区的正常组织作为对照。3. 为充分保存组织的抗原性, 取材要快，尽量保持组织新鲜。（二） 细胞标本的取材1 印片法应用：活检标本、手术切除的标本。方法：新鲜标本以最大面剖开暴露病区，载玻片轻压病区，脱落细胞黏附于载玻片上，立即浸入固定液中510

3、分钟，取出自然干燥，低温保存。优点：简便省时，细胞抗原保存较好。缺点：细胞分布不均重叠，影响标记效果。2 穿刺吸取涂片法应用：实质器官的病变区。方法： 穿刺液较少时直接涂片，力求均匀。穿刺液较多时，穿刺液滴入12毫升Hanks液（RPMI 1640液）内，轻搅，500rpm离心510分钟，弃上清，制成细胞悬液（2x106细胞/ml）,吸一滴于载玻片上，轻涂，干后固定。优点：细胞均匀。缺点：细胞易变形。3 体液沉淀涂片法细胞数多，取一滴直接涂片。细胞数少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。4 培养细胞贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中。悬浮生长

4、的细胞：可用离心涂片法制成涂片。5 离心涂片机法 细胞悬液21056， 1000r/min， 2min，50100l。注意事项： 防止脱片, 涂黏附剂，。为节省试剂及便于镜下观察和计数，将细胞集中到直径0.6-1.0cm圆圈内，细胞总数以105为宜。粘液丰富的标本如胃液、痰液等未经特殊处理，不宜作免疫组化。二固定（一）免疫组化的固定法选择最佳固定的标准最好的保存细胞和组织的形态结构。最大限度的保存抗原的免疫活性。固定有：（1）物理固定：血膜空气快速干燥，冻结干燥。（2）化学固定：固定方法1. 浸润法（ immersion method） 424小时。2. 灌流法 ( irrigation me

5、thod )麻醉动物，经动物左心室主动脉插管，生理盐水冲洗，注入固定液，组织在30分钟内取材。（二）重要的固定液1 10中性缓冲福尔马林双功能交联剂。使组织间相互交联，保存抗原于原位。特点是对组织穿透性强，收缩性小，易使组织硬化而浸蜡困难。固定时间不宜过长。2 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 适应性较广泛的固定液，固定时间不宜过长。3 Bouin,s液 对组织固定力强且较均匀。比单独醛类固定更适合免疫组化染色，4 0C。4 Zamboni,s液 可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。采用2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织的穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。618小时。5 丙酮 用于冰

6、冻切片及细胞涂片的固定。固定较好，对组织穿透性很强 ，保存抗原的免疫活性较好，染色效果稍差。4 0C，510分钟，干燥后低温保存。6 95乙醇用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。固定效果差，可和其他试剂混合使用，染色较好。7 AAF液：较常用的固定液。（95-100%酒精85ml, 冰醋酸5ml, 浓甲醛10ml.）（三）固定剂的选择各种抗原的最佳固定剂的选择见表。鉴于10%中性甲醛是国际最通用的固定剂，虽然它对保存Ig抗原方面较差，若采用合适的蛋白酶消化处理，进一步暴露抗原，结合使用敏感的免疫组化方法，如PAP，ABC法，仍不失为一可用的固定剂。固定时间可适当缩短至16-24小时。免疫球蛋白类抗

7、原可选用含汞类的固定液，(如Zenker固定液)，或蛋白沉淀性固定液(如Bouin固定液，甲醛醋酸酒精固定液等)。扁桃体、淋巴结和骨髓还可用甲缩醛(formal-Saline)加2-10%醋酸，石蜡切片，能有效地保存Ig。肿瘤胚胎抗原(如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA)对多种固定均稳定。一般可用中性福尔马林固定，石蜡包埋切片）激素类中的多肽类激素宜选用Bouin。组织之中酶和一些组织特殊抗原(如肌球蛋白、凝血蛋白和第VIII凝血因子等)可用10%中性甲醛。 待测抗原与固定液的关系 抗原 适 用 固 定 液细胞表面抗原 100%丙酮，95%乙醇，10%福尔马林，Bouin液免疫球蛋白 Zenke

8、r固定液,10%福尔马林，95%乙醇，100%丙酮，酶，蛋白类 10%福尔马林，Bouin液，95%乙醇，100%丙酮肽类激素 Bouin液，10%福尔马林，FAA固定液固醇类 10%福尔马林，Bouin液补体 95%乙醇，100%丙酮，10%福尔马林，Bouin液肿瘤胚胎抗原 10%福尔马林，（四）注意事项免疫组化固定方法的原则是：在保持细胞形态完好和所测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定液和最短的固定时间。为此，固定组织时应该：1 组织新鲜，尽早、尽快固定。2 组织块尽量小(300，000)水溶液，涂布载片后，晾干或45 0C烤干，一周内应用。此溶液需冷冻贮藏。（5）APES：3-Amin

9、o propyltriethoxy silaneAPES/丙酮（1/50）涂片晾干。（6）APES 和Poly-L-lysine（PLL）联合应用 适于特别容易脱片的情况。第三章 免疫细胞化学染色 免疫细胞化学的类型根据标记物的性质，可将免疫组化染色法分为以下几种：(1) 免疫荧光法(Immunofluorescence technique)(2) 免疫酶法(Immunoperoxidase technique)(3) 亲合组织化学法（affinity histochemistry）(4) 免疫金银法(Immunogold technique)(5) 其它：放射免疫法。此外，尚有根据染色及抗体

10、滴加步骤，分类为直接法，间接法，桥法等。一免疫细胞化学染色方法及原理（一） 免疫荧光技术 (Immunofluorescence technique)1. 免疫荧光直接法原理：优点：简单、省时、特异性强。缺点：一种标记抗体只能检测一种抗原；敏感性差。2. 免疫荧光间接法原理：优点：一种标记抗体可用于多种一抗（只要一抗是同种动物产生的）；敏感性较直接法高10倍左右。缺点：非特异性着色机会较多；染色时间长。 3.双重免疫荧光标记法标本保存及封片介质及时照相，可050C暗处保存。缓冲甘油液（PH8.5）0.5mmol/lPH8.5碳酸盐缓冲液1份，无荧光甘油9份混匀即用。荧光显微镜标本制作要求载玻片

11、光洁均匀，厚度，在0.8-1.2mm间，无明显自发荧光。有时需石英玻璃载玻片。盖玻片光洁，厚度0.17mm左右。切片不宜太厚。 暗视野荧光显微镜和油镜观察时，使用无荧光镜油，或上述甘油及液体石蜡。（二） 免疫酶标技术(Immunoperoxidase technique)1. 酶标抗体法通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观察。 HRP（POD） ALP直接法 优点：简单、省时、特异性强。缺点：一种标记抗体只能检测一种抗原；敏感性差。间接法优点： 与免疫荧光技术相比，此法终产物可在普通光

12、镜下观察，切片可长久保存，反复观察。2. 非标记抗体酶法(1) 酶桥法优点：提高了敏感性。(2) 过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase anti- peroxidase method, PAP 法） 1970年，Sternberger 优点：敏感，适合于石蜡切片中微量抗原的检测。缺点：步骤多，费时，不适合临床常规检验。（三） 亲合组织化学（affinity histochemistry）1. 抗生物素(亲合素)生物素过氧化物酶复合物技术(Avidin-Biotin.-Peroxidase Complex technique ABC法)基本原理：2 链酶亲合素生物素过氧化物酶复合物技术

13、（Strept Avidin-Biotin -Peroxidase Complex ，SABC） 基本原理： 链酶亲合素是一种从链酶菌Streptomyces Avidinii 培养物中提取的蛋白质，有四个生物素结合位点，亲和力高。是一种接近于更完美的生物素结合蛋白。 生物素是一种水溶性维生素（维生素H）。生物素活化后，可以标记抗体和酶而不影响其活性。链酶亲合素同一定浓度的生物素化酶混合后，形成链酶亲合素生物素酶复合物 。这种复合物至少存在一个尚未被生物素占据的亲和素结合位点，可以和各种生物素标记抗体结合。这种复合物即是SABC。市售的试剂盒中SABC的A液和B液合二为一。 SABC具有下述特

14、点：1 高敏感性。2 低背景。3 简便快速。4 结果稳定。试剂盒分型浓缩型SABC过氧化物酶即用型SABC过氧化物酶：SABC预稀释，可以直接使用。浓缩型SABC碱性磷酸酶 (容易克服组织细胞中内源性酶的干扰，尤其是血液、骨髓、胃肠等富含过氧化物酶的组织，应用SABCAP效果较好。)即用型SABC碱性磷酸酶SABC免疫组化双重染色试剂盒：(同时采用SABCPOD和SABCAP试剂盒进行免疫组化双重染色。) 3葡萄球菌蛋白A技术（Staphylococal Protein A, S P A）4凝集素（组织化学）技术 凝集素(lectin)：是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结

15、合糖的蛋白，因其能凝集红细胞而得名。种类很多，常用的为植物凝集素，如：花生凝集素(Peanut agglutinin) PNA D-半乳糖刀豆素A（Concanavalin ensifomis agglutinin） Con A D-葡萄糖特点：1）能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构（碳水化合物抗原决定簇）2）具有多价结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金及铁蛋白等示踪物结合， 从而在光镜、电镜水平显示其结合部位。 一般认为，细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型及反映细胞在分化、成熟和细胞恶变中的变化。 凝集素本身不是来源或参与免疫反应的产物，放此讲授，是由于凝集素具

16、有某些亲合特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。 (四) 免疫金银法(Immunogold technique)二 免疫组化染色的重要环节1选择最佳的固定方法和制片方法2免疫组织化学中的对照实验 由于影响免疫组化的因素甚多，染色中必须有阳性和阴性对照。1 阳性对照片可选用其它组织标本并行固定、包埋、染色，并且经该抗体证实为中等阳性反应。2 阴性对照片仍用上述相同程序，证实其免疫反应为阴性。待检标本上滴加PBS以及同种非免疫动物血清以代替第一抗体，用以检查抗体的特异性。若仅滴加第一抗体的标本阳性，说明特异性高。免疫组化对照试验及判断标本号试验组阳性对照阴性对照替代抗体对照结论1+ 受检标本含抗原

17、2+受检标本不含抗原3操作错误4+非特异性染色5+非特异性反应6+阳性对照差注：第一批抗血清做一次对照实验即可。必须用连续切片普通染色组进行对照。3. 选择抗体的最佳稀释度最佳稀释度可提高染色的阳性率，获得染色的良好的对比。抗体浓度过高。反而会减弱抗原抗体的结合，甚至出现假阴性结果。抗体稀释的原则是：1 抗体的工作滴度(稀释后的应用浓度)高有助于减少污染蛋白的非特异着色，节省试剂。2 选择所测抗原着色最强、背景着色最弱的滴度。3 根据抗体和待染标本等具体情况，确定最佳工作滴度。4 稀释液中常用0.01M PBS，但不宜放过久。欲放置抗体长久，可用Tris缓冲液稀释，或专用抗体稀释液。直接测定法

18、：其它条件稳定，用于测定一抗最佳稀释度。选择抗体的最佳浓度一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性染色背景强度1:50 1:100 1:200 阴性对照 在1:100与1:200间如上找出最佳稀释度。棋盘（方阵）测定法：欲测知二种以上抗体的免疫反应浓度，可测试比较9张标本的阳性反应和背景着色。从下表可知，应采用1:20的第二抗体，并进一步在1:50-1:100之间寻得第一抗体的最佳工作稀释度。 抗体的最佳滴度测试表第二抗体第一抗体稀释度1:501:1001:2001:20+(+)+()+（）1:40+（）+（）+（）1:80+（）+（）+（）注( )内为背景着色 若应用三种以上抗体的染色法，如PA

19、P法，ABC法，可按上表求得第二、第三抗体的最佳配伍滴度。之后可按商品说明选择第一抗体滴度，或按优选法求得高稀释度，逐步缩小优选范围，选中最佳滴度。稀释中，一般常微量加样品。最常用者为10l、20l、50l、100l、和200l。抗体稀释后应充分混匀。4抗体的孵育时间一般说，抗体稀释度愈高则孵育时间愈长，标本染色对比度愈大。使用高滴度抗体，可将切片置于4度冰箱内过夜(约18小时)，以增强特异性着色而减少非特异染色，提高对比。为节省时间，加强反应亦可于室温下孵育20分钟，37度下孵育5-10分钟。若标本中抗原很强，可适当延长孵育时间。孵育应在湿盒中进行。5其它 注意滴加抗体时应适量。以抗体充分覆

20、盖组织片为准，不可过多或过少。PBS洗涤抗体时应充分，且应防止使用同一PBS容器导致交叉反应。最终标本显色时，应用光镜控制和观察最佳显色反应和时间。一般显色时间约为515分钟。以阳性反应着色最强而背景开始着色为度。免疫细胞化学染色的注意事项11 反应的pH值应以接近体液环境为宜，即组织片与各种标记抗体液应处于同 一酸碱度（pH7.0-7.2）22 为避免非特异沉着和交叉反应，各标记抗体液要在染色前经离心去沉淀33 要特别注意载玻片是否处于水平位置（滴染时），确保染色液覆盖整个切面。44 染色反应要在保湿容器内进行，以防止染色液的蒸发干涸。55 染色的抗原抗体反应要在37度或室温下进行。但对耐热

21、能力差的抗原，要 在4度低温下延长反应的时间。四 免疫组化有关技术（一） 抗体的保存抗体的保存40C保存一年。稀释后40C保存13天、7天后效价显著降低。（二）增强特异性染色的方法1 蛋白酶消化法0.1胰蛋白酶 最常用。用前370C水浴。消化530分钟。04胃蛋白酶370C消化530分钟。2 抗原修复高温高压组织抗原修复适用范围：大量常规福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复，效果优于微波法和直接煮沸法。仪器设备：普通家用压力锅。缓冲液：0.01M柠檬酸缓冲液，PH6.0。 方法：切片水化。缓冲液置于压力锅内加热至沸腾，放入切片，继续加热至喷汽（扣阀至喷汽以46分钟为最佳）、12分钟后，压力锅

22、离开热源、1分钟后，自来水淋压力锅至室温，开盖，取出切片，蒸馏水冲洗3分钟x2次,PBS冲洗3分钟x2次。注意事项：用过的缓冲液弃去。加热时间不宜太长，否则背景加深。组织抗原微波修复适用范围：多数福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复。仪器设备：家用微波炉，进口微波炉置“DEFROST”档。方法：去除内源性酶的切片置入盛有已煮沸缓冲液的耐热容器中，继续加热至981000C，持续810分钟。取出容器至室温。蒸水冲洗3分钟x2次,PBS冲洗3分钟x2次。注意事项：不可将切片从缓冲液中取出冷却。组织抗原直接煮沸修复适用范围：多数福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复。方法：切片水化。置入盛有已煮沸缓

23、冲液的烧杯中继续加热10分钟。加入蒸馏水补充水分损失。烧杯离开热源，置流水槽内冷却至室温。蒸水冲洗3分钟x2次,PBS冲洗3分钟x2次。注：一般，对于不太熟悉的一抗染色石蜡切片时，应比较一下抗原修复、胰酶消化和不做预处理的染色效果。如果石蜡切片无法作出满意的结果，则应考虑用冰冻切片。3 合适的抗体稀释度抗体效价越高，工作液稀释度越高。抗体稀释度越大，孵育时间越长。只有高稀释度时才能防止非特异性背景产生。尽量使用单克隆抗体（MAB）。4 孵育时间370C，3060分钟。40C过夜（约18小时）或室温。5 去污剂0.01-0.1%皂素，或0.04-0.2%Triton X-100处理切片，去除脂类

24、，促进抗体进入细胞中。但是浓度过高会破坏细胞抗原和细胞膜结构。6 显色增敏剂过氧化物酶底物中加入氯化镍、0.1N异吡唑、氯化铵、硫酸镍铵等可增强显色敏感度。（三）非特异染色和内源性过氧化物酶的消除法 在免疫细胞化学染色中，常在非抗原部位出现阳性反应（非抗原抗体反应出现的阳性反应），称为非特异性染色，致背景着色过深。非特异性染色，背景色过深其可能原因有：1粘片剂使用不当。2固定(如可因液中残存的游离醛基所引起)3切片或涂片太厚。4脱蜡不彻底。5未用酶消化处理切片或进行抗原修复。6内源性酶未阻断。7标记抗体、I抗的不纯；抗体浓度过高，抗体的稀释度不够，反应后冲洗不充分。8血清封闭不够或血清溶血。9

25、洗涤不彻底。10底物呈色时间过久。11细胞或组织与血清或酶之间由于静电吸引所致的吸附作用造成。去除非特异染色的方法：1 血清封闭加一抗前，用与二抗同种动物非免疫血清封闭组织上带电荷基团，去除其与一抗的非特异性结合。必要时加入25牛血清白蛋白。也可用除制备一抗以外其他动物非免疫血清。室温或37度，30分钟。2 缓冲液洗涤用缓冲液加入0.9%NaCL成为高盐溶液，充分洗涤切片。3 尽可能高地稀释一抗。在组织中的红细胞、粒细胞含有较多的内源性过氧化物酶，其它细胞和组织中也有少量。为此，实验中设法消除或抑制内源性过氧化物酶。去除内源性过氧化物酶的常用方法：3H 2O2蒸馏水或PBS，或3H 2O2甲醇， 室温30min处理切片。去除内源性生物素的常用方法： 生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节中所产生的羧基的中间载体，它存在于某些组织和细胞内，在应用ABC法，LSAB法，SP法SABC法染色时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织如冰冻切片和肝、肾、脑等组织的石蜡切片，在应用上述染色方法前应预先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分别作用20min左右，以