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1、荧光原位杂交技术样本硕 士 学 位 论 文荧光原位杂交技术及其在环境领域内应用Fluorescence in situ hybridization technology and its application in the field of environment作 者 姓 名： * 学科、专业： 环境科学与工程 学 号： * 指 导 教 师： * 完 成 日 期： /3/26 大连理工大学Dalian University of Technology摘 要荧光原位杂交（FISH）是当代分子生物学及基因工程中广泛应用新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。总结了某些实验核心

2、环节操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面应用做了综述。运用FISH技术在环境样品上直接原位杂交，不但可以测定不可培养微生物形态特性及丰度，并且可原位分析它们空间及数量分布。并且展望了FISH技术将来。核心词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测AbstractFluorescence in situ hybridization （FISH） is a new technology which is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summari

3、zes the experimental principle，process and technical issues of FISH .Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps，and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples，can not only measure

4、the morphology and abundance of uncultured microorganisms，but also analyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the future of FISH.Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology；Probe；Environmental microbes；monitoring1 荧光原位杂交技术简介荧光原位杂交（fluorescence in situ hy

5、bridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术基本上发展起来一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成一种新原位杂交办法，探针一方面与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH技术是将DNA（或RNA）探针用特殊核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上定性、定位、相对定量分析。具备安全、迅速、敏捷度高、探针能长期保存、能同步显示各种颜色等长处。同步在荧光原位杂交基本上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤

6、维荧光原位杂交技术。1.1 FISH发展历史1986年人们用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行分析，从而建立了荧光原位杂交技术。1988年，Giovannoni等1初次将原位杂交技术引入细菌学研究中，使用放射性标记rRNA 寡核苷酸探针检测微生物。然而由于放射性物质对人体有害，加上实验周期长，操作比较繁杂，人们开始研究使用非放射性物质取代同位素来标记探针，如使用生物素和地高辛标记探针，由此建立了非放射性原位杂交技术。1989年，Delong2初次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。从此，人们越来越多地使用荧光原位杂交技术来检测环境中微生物样品。进入20世纪90年代后来,F

7、ISH技术在办法上逐渐形成了从单色向多色- FISH发展趋势，敏捷度和辨别率也有了大幅度提高。多色荧光原位杂交（M- FISH）最大特点是可将多次繁琐FISH实验和各种不同基因定位在一次FISH实验中完毕。Cremer等3用生物素和汞或氨基乙酰荧光素标记探针建立了双色FISH技术。 近来，各种标记探针和荧光染料可以同步测各种靶序列，最新多色FISH可同步用7种颜色进行检测。荧光染料具备不同激发和散射波可以同步检测一种或更多微生物。FISH技术由于敏捷度高，具备较好辨别力，实验周期短，操作安全，特别是可以同步分析一种以上探针，它将成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究

8、有力工具，同步FISH技术自身也得到迅速发展。1.2 FISH原理荧光原位杂交是运用荧光标记特异核酸探针按照碱基互补原则，与细胞内相应靶DNA分子或RNA分子杂交，形成可被检测杂交双链核酸，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观测荧光信号，来拟定与特异探针杂交后被染色细胞或细胞器形态和分布，或者是结合了荧光探针DNA 区域或RNA 分子在染色体或其他细胞器中定位，图1.1显示是荧光原位杂交原理。图1.1荧光原位杂交原理图FISH技术目的分子普通是16S rRNA，由于它在微生物体内具备较高拷贝数，分布广泛、功能稳定，并且在系统发育上具备恰当保守性。依照待测微生物体内16S rRNA中某段特异性

9、序列，设计相应寡核苷酸探针，就可实现对目的微生物原位检测，而选用在分子遗传性质上保守性不同特异序列，就可在不同水平（如属、种等） 上进行检测。当前，公共和商业数据库中已发布16S rRNA序列逐渐增多，因而，基于16S rRNAFISH技术应用也越来越广泛，对环境样品中微生物原位研究也越来越以便和精确。除16S rRNA 外，还可以23S rRNA 或mRNA 等作为研究目的分子。1.3 FISH基本过程荧光原位杂交技术基本过程如图所示，重要涉及探针制备、探针标记、杂交、荧光检测与成果分析。图1.2所示是荧光原位杂交办法标记细胞基本流程： 图1.2荧光原位杂交办法标记细胞基本流程1.3.1 探

10、针制备进行荧光原位杂交实验一方面需要有荧光探针。它是一段带有荧光色素核酸序列。探针有诸各种，涉及：DNA探针，RNA探针，寡核苷酸探针等。每种探针特点如表所示。表1.1各种探针优缺陷4探针类型长处缺陷DNA探针制备简朴，放射比活性好，信号特异性强，杂交体稳定变性后才干使用，要基因克隆，穿透性差，易于退火RNA探针信号特异性强，不需变性，信噪比高，杂交体非常稳定易被降解，易吸附于器皿上，穿透性差，要做亚克隆寡核苷酸探针易制备，使用以便，穿透力强 ，不用克隆，不会退火需核酸合成仪，需明确mRNA序列，杂交体不稳定，信噪比低寡核苷酸探针是一种人工合成、依照探针靶序列碱基顺序用化学办法合成单链DNA，

11、其长度为15-50个核苷酸。由于分子小，因而更容易渗入到细胞目的区域，但也正由于分子小，限制了其所能携带荧光基团或报告分子数目，并最后导致杂交后荧光信号较弱。1.3.2 探针标记对探针标记是通过把荧光素标记核苷酸引入探针序列来实现，依照引入过程不同，标记办法可分为缺口平移法、随机引物法、PCR法等；缺口平移法：基本办法是通过酶作用在5-3核酸链上产生随机缺口，再通过酶将核苷酸添加到缺口3端，从而把带有荧光色素核苷酸引入核酸链。随机引物法是以变性后探针DNA链为模板，在随机引物引导下，运用酶活性把标记核苷酸引入DNA链。PCR法是把荧光色素标记核苷酸引入DNA链中。FISH 技术目的分子普通是

12、16S rRNA，由于它在微生物体内具备较高拷贝数，分布广泛、功能稳定，并且在系统发育上具备恰当保守性。依照待测微生物体内 16S rRNA中某段特异性序列，设计相应寡核苷酸探针，就可实现对目的微生物原位检测，而选用在分子遗传性质上保守性不同特异序列，就可在不同水平（如属、种等） 上进行检测。1.3.3杂交前解决（1） 增强细胞通透性荧光原位杂交实验程序中，如何增强细胞通透性，保证核酸探针能与目的核苷酸结合是一种重要问题。该环节依照应用固定剂种类，杂交样品种类和核酸探针长度来决定。某些固定剂能影响细胞通透性，因而需要运用某些试剂如稀释后酸、乙醇等进行解决。此外，使用表面活性剂对样品解决可以较好

13、地增长细胞通透性。（2）减少背景荧光原位杂交中背景染色是由各种因素导致，杂交后洗涤可以减少背景染色。预杂交也是减少背景染色一种有效手段，预杂交液与杂交液不同是在于前者不具有探针。将玻片浸入到预杂交液中可达到封闭特异性杂交点目，从而减少背景染色。（3）变性单链DNA/RNA探针不需要变性。双链DNA探针杂交前需要变性为单链，一种方式是样本与探针分别变性，其中双链DNA变性是在70-80条件下变性10分钟左右，然后立即转移到冰浴中。而样本是放置在70-80变性液中5-10分钟，用70%，85%，100%系列乙醇脱水，吹干。另一种方式是共同变性：样本通过70%，85%，100%系列乙醇脱水迅速吹干后

14、，将探针溶液加至玻片上，盖上盖玻片，封片液封固边沿，放置在70-78加热板上10分钟左右，然后及时转入37湿盒中。1.3.4 杂交杂交前一切准备工作都是为了能让荧光探针在杂交这一环节中可以进入到细胞内，与目的核苷酸结合。杂交能否实现决定了整个实验成败，因而，杂交是荧光原位杂交中最重要也是最核心一步。在已经预解决好样品上滴加杂交液，加盖盖玻片就可以完毕杂交。在杂交区域，探针与目的核苷酸复性，形成DNA-RNA合体。盖玻片作用是防止在杂交过程中高温状况致使杂交液和探针挥发。同步，整个杂交环境应当保持黑暗、潮湿，可在暗盒内洒一定量杂交液，同步暗盒也必要耐高温不会影响杂交顺利进行。盖玻片必要清洁无杂质

15、，同步也要光滑不会产气愤泡，还必要不会影响样品细胞与杂交液接触。在实验中还必要注意如下环节。（1）探针浓度及长度探针浓度必要给于该实验最大信噪比，探针浓度过高会导致背景染色过高，探针浓度过低会导致荧光信号局限性。因而，最低探针浓度应达到与靶核酸最大饱和结合度限度。依照国内外多数专家学者经验，以为保存浓度为5ng/L为最佳浓度。此外，杂交过程中加杂交液量也不能太多，杂交液过多易导致盖玻片滑动脱落，影响杂交成果。探针长度对杂交成果也有很大关系。探针短则易进入细胞，杂交效率高，杂交时间短，但是信号不是很强烈。探针长则信号好，易观测，但是不易进入细胞，杂交时间厂，并且配错对几率也会增长。（2）杂交温度

16、和时间杂交温度是杂交能否成功一种核心因素。DNA探针需要变性解链后才干进行杂交。双链DNA变性一半所需要温度称为DNA溶解温度（Tm），大多数DNA探针需要Tm是90，这种高温对保存细胞完整和保持样品黏附在载玻片上是很困难。而使用寡核苷酸探针不需要通过这一环节，但是杂交也需要在60左右才干进行，这样高温度对样品也是很不利。因而在杂交过程中需加入一定量甲酰胺反映液中每增长1%甲酰胺，Tm值就可减少0.72。可以调节甲酰胺含量来恰当减少杂交温度。杂交温度随着探针种类不同而不同，杂交时间也对杂交有较大影响。杂交时间过短会导致杂交不完全，而过长则会增长非特异性杂交。大某些DNA探针杂交时间为2-4小时

17、，但是为了稳妥起见，人们将反映时间定地较长，为16-20小时。而使用寡核苷酸探针是不需要这样长时间。杂交反映时间应当与探针长度和细菌细胞通透性关于，在充分进行细胞通透性解决之后，核酸长度很短寡核苷酸探针只需要2-6小时便可完毕杂交。杂交时间因探针种类不同而不同。1.3.5荧光检测与成果分析荧光原位杂交成果观测需要使用荧光显微镜或者激光扫描共聚焦显微镜。荧光显微镜特点为：（1）数值孔径不不大于普通显微镜，荧光较弱。（2）光源由汞灯提供全波段激发光，通过物镜投射于样品上。（3）有两个特殊滤光片，分别滤除可见光和紫外线。观测不同荧光标记探针需要调节不同滤光片以选定适合波长激发光1.4 FISH技术特

18、点原位杂交探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记放射性探针优势在于对制备样品规定不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较敏捷。缺陷是探针不稳定、自显影时间长、放射线散射使得空间辨别率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些局限性，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，有如下特点：长处：1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到成果、特异性好、定位精确；4、FISH可定位长度在1kbDNA序列，其敏捷度与放射性探针相称；5、多色FISH通过在同一种核中显示不同颜色可同步检测各种序列；6

19、、既可以在玻片上显示中期染色体数量或构造变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA构造。缺陷：不能达到100%杂交，特别是在应用较短cDNA探针时效率明显下降。1.5 常用技术问题及解决办法1.5.1 FISH检测假阳性在FISH检测中，寡核苷酸探针特异性决定了检测成果可靠性和精准性，因此普通但愿设计得到寡核苷酸最佳与数据库中寡核苷酸同样精准。现存数据库不断扩大和所报道序列非精准性，探针序列检测最佳用最常规、最新版本序列数据库进行校对。而对于某些培养条件苛刻和暂时无法培养微生物，应当用点杂交办法分析探针特异性，来拟定探针设计合理性。此外，某些微生物自身具备荧光性，会对FISH检测产生干扰。虽然自

20、身荧光性有助于复染，但经常减少信噪比，同步掩盖特异荧光信号。因此在解决某些混合菌群时要防止自身背景荧光解决。使用狭窄波段滤镜和放大系统以及恰当预解决，可以减少背景荧光5。Lin等发现用H2O2预解决可以有效减少假阳性6。Taguchi 等在使用FISH之前，用HCl 预解决可以减少来自荧光标记寡核苷酸探针非特异性吸取背景荧光以及减少大量杂质7。Hahn等发现用地高辛标记探针原位观测Frankia strains与用荧光标记探针相比，不产生自身荧光问题8。1.5.2 FISH检测假阴性虽然大多数细菌具有高rRNA丰度，但rRNA丰度变异不但仅发生在种属间，亦发生在同一菌不同生长阶段，生长率慢细菌

21、具有低rRNA丰度9;有些微生物细胞壁渗入性差，使探针不能充分进入细胞内与rRNA分子杂交，这些都将导致假阴性成果。因而，优化渗入性、用高亮度荧光染料Cy3或Cy5和多重探针标记，应用信号放大系统或多核苷酸探针和CARD-FISH均可以增长杂交信号。Watt。 等用FISH技术分析生长小麦根系土著细菌、假单胞菌、丝状菌量以及分布状况时发现使用Cy5或Cy5。 5荧光染料可以避免在观测时看到自身荧光10。某些研究发现用多核苷酸荧光杂交技术和CARD-FISH均可以发当前水体中丰富古生菌，而寡核苷酸荧光杂交技术无法发现11，表白寡核苷酸荧光探针杂交信号较弱，通过其办法改进，可以消除实验成果假阴性。

22、2 FISH技术在环境领域应用2.1 对硝化细菌监测硝化细菌是一类生理上非常特殊化能自养菌，老式研究办法要通过富集、分离、分类和鉴定等环节，耗时长（48w） ，并且由于所用培养基有选取性，使得某些易于培养菌株如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterwinogradskyi 等超过了其她硝化细菌，在培养基中处在竞争优势，因而得到优势类群与样品中真实状况有差别。此外，老式办法对培养困难硝化细菌无法进行研究。FISH技术引入解决了上述困难。随着人工设计合成硝化细菌及氨氧化菌探针不断推出，FISH技术被广泛地应用于活性污泥系统、硝化流化床反映器和膜生物反映器等污水解决系统中。

23、JuretschkoSL和SchrammA等12曾对硝化流化床、普通活性污泥等工艺活性污泥中硝化细菌多样性采用FISH法进行了跟踪分析，发现Nitrosospira、Nitrospira为优势菌种，而并未探测到Ni2trosomonas和Nitrobacter。Kazuaki H等13EUB338、NSO190、NIT3和NSR1156等探针研究了同步硝化反硝化好氧膜生物反映器中生物膜上菌群构造，成果表白氨氧化菌是生物膜中优势菌群，而亚硝酸盐氧化菌则未被检出。HanWoongLeeL等14用EUB338作为一级探针，ALF1b、BET42a、GAM42a和CF319a作为二级探针对两个不同脱氮

24、反映器活性污泥中分子生物学特性进行了定量研究，成果表白变形菌纲亚纲是反映器中优势菌群，变形菌纲亚纲是反映器中第二大优势菌群。OlavSliekers等15采用FISH技术对CAN-ON工艺调试过程中优势菌种变化进行研究，成果表白：在厌氧运试阶段，以亚硝酸菌或硝酸菌核酸探针检测，没有在污泥中检出亚硝酸细菌和硝酸细菌（检测限1%），以厌氧氨氧化细菌核酸探针检测，大某些细胞呈阳性反映，污泥中厌氧氨氧化菌占80%左右；在限氧运营7周后，同等测试成果显示活性污泥中亚硝酸菌与厌氧氨氧化菌所占百分率分别为45%和40%，而硝酸菌则未被检出。由此推断：在限氧条件下，硝酸细菌不能与亚硝酸细菌竞争氧，也不能与厌氧

25、氨氧化菌竞争亚硝酸盐。2.2 对除磷细菌监测近年来，国内外许多学者运用原位杂交技术对不同除磷工艺中聚磷菌生态变化进行了大量研究。FISH技术应用克服了以往除磷菌难于用常规办法培养导致研究上困难，并对不同条件下生物除磷工艺改进起到了指引性作用。Mamoru对除磷工艺FISH研究中，使用ALF1b、HGC和Bet42a探针检测出细菌量所占比例较大，分别在10%64%；MP2和CF探针探测到细菌含量并不高，在4%如下。在强化除磷（EBPR）工艺中，无论好氧或厌氧区活性污泥中都存在着大量丰富除磷微生物，其中常用类群为Bet Proteobacteria亚类Actinobacteria菌、GPBHGC、

26、Epbr15和Epbr16等。近期报道16Rholocyclus也是生物除磷优势种群，并且运用常规培养办法不能培养- 亚纲变型细菌也在EBPR工艺中探测到。 2.3 FISH技术在丝状微生物研究中应用在污水生物解决工艺系统内，丝状微生物大量滋生是引起污泥膨胀重要成因。由于其对培养基选取性很强，不易进行实验室分离培养，因此用老式办法对丝状菌进行监测困难较大。运用FISH技术使该问题得到了较好解决，许多科学工作者对活性污泥中丝状微生物作了大量FISH鉴定工作，从探针设计及应用等方面作了详尽阐述。FISH技术应用对进一步结识丝状微生物膨胀机理提供了大量有用信息。2.4 对厌氧颗粒污泥中微生物监测厌氧

27、颗粒污泥是由各种具备互营共生关系厌氧微生物形成复杂汇集体，是UASB、EGSB和IC等厌氧反映器高效稳定运营核心，众多研究者对其形成机理、微观构造、微生态等进行了大量研究，但基于纯培养老式微生物学研究办法自身存在缺陷、颗粒污泥中微生物构成及其互有关系复杂性以及某些厌氧细菌（如产氢产乙酸细菌和产甲烷细菌）生长特异性等，使得对厌氧颗粒污泥结识至今仍未获得共识。FISH技术浮现可以在很大限度上弥补老式办法局限性。运用FISH技术对颗粒污泥所进行研究，重要集中在如下几种方面17：（1）构成颗粒污泥各种微生物种属关系及其空间分布；（2）工艺或环境条件对颗粒污泥内部微生物空间分布影响；（3）两种或各种特定

28、微生物之间生态关系等。HermieJ ， MHarmsen18等人运用EUB338、ARC915、MX825和MG1200等探针不同组合，研究发现以蔗糖为基质颗粒污泥分为三层：外层为真细菌，中间层为产氢产乙酸细菌与产甲烷丝菌共生体，内层存在着较大空洞，有少量产甲烷细菌和无机物；而以混合挥发酸为基质颗粒污泥只分为较明显两层：外层是真细菌内层则以产甲烷丝菌为主。Sekiguchi YY等人19运用EUB338和ARC915探针拟定了真细菌和古细菌在中温和高温厌氧颗粒污泥中分布状况，然后运用MX825、MG1200、MB1174、MS1414和D660等探针不同组合对不同种类产甲烷细菌与真细菌空间分

29、布进行研究。成果表白：中温和高温颗粒污泥具备相似微生物分布构造，外层重要是真细菌，内层重要是古细菌；颗粒中心均不能被染色，也许是无机物或死亡细菌；古细菌中以索氏产甲烷丝菌为主，在高温颗粒污泥中还存在少量产甲烷八叠球菌；真细菌则种类较多，重要有脱硫叶菌、互营杆菌、和绿色非硫细菌等。2.5 对自然环境中微生物多样性监测由于显微镜下可见微生物99%以上通过常规办法不能被培养，由于培养条件与自然条件差别，事实上培养所得到只是自然环境中少某些微生物，并且往往加入了浓度远高于自然状况营养物质，其成果是在新选取压力下群落构造普通会发生变化，适应丰富营养条件菌种成为优势种，取代了自然条件下优势种。20由于核酸

30、序列可以提供遗传距离、分子杂交探针等信息，可进一步用于鉴定、监测自然生态系统中微生物。基于核酸抽提和PCR扩增等技术存在一定限度偏差，而FISH技术可以将整体微生物清晰地呈现出来而不需要额外抽提和扩增等易引起偏差环节，精准性更好。因此，FISH技术被广泛应用于环境微生物多样性研究。近几年，应用FISH技术研究自然环境微生物多样性报道较多，如河水和高山湖水浮游菌体、海水沉积物群落以及土壤和根系表面寄居群落。SimonNathalie等21在运用FISH技术研究海水中细菌和有害藻类种群之间互相作用；应用FISH技术不但能研究微生物群落构造特性，还可以跟踪微生物种群动态变化。Liu J等22运用FI

31、SH技术监测了河流中微生物群落动态变化，并运用此技术得到了某些在人工条件下很难培养菌种以及某些新微生物信息。FISH技术也被用于监测环境中微生物群落动态，如季节变化对高山湖水微生物群落影响、原生动物摄食对浮游生物构成影响等。此外，咱们不但可以更精确地理解不同环境下微生物群落中各种功能菌群构成比例，并且对不同功能菌群互相作用有了更直观结识。3 将来展望FISH技术在国内外环境微生物监测中已得到较为广泛应用，技术水平日趋成熟。然而，FISH技术在环境微生物研究中应用尚处在起步阶段，还存在着局限性：一方面，FISH检测精准性和可靠性依赖于寡核苷酸探针特异性，因而探针设计和评价十分重要，当前某些探针敏

32、捷度尚有待提高；另一方面，微生物自身荧光也会干扰FISH检测而浮现假阳性使检测成果浮现正偏差，某些细菌如假单孢菌属、军团菌属、世纪红蓝菌、蓝细菌属和古细菌如产甲烷菌中存在这样荧光特性，环境样品中自发荧光生物或存在于微生物周边化学残留物使应用FISH分析环境微生物变得复杂；此外，实验过程中杂交液渗入不充分、杂交后荧光标记见光褪色等则会导致假阴性而使检测成果浮现负偏差；此外，某些生长缓慢细胞由于rRNA含量低而很难被探测到。因而，FISH技术作为一项新兴研究手段和工具，还需要在高敏捷度探针研究与开发、荧光信号完善与加强、杂交过程优化等几种方面进行加强和改进。相信随着分子生物学技术和精密仪器设备研制技术不断发展和新探针开发，FISH技术将具备更强可操作性和实用性，从而使FISH技术在环境微生物监测和生态学解析中具备更辽阔应用前景。参 考 文 献1 Giovannoni S J，DeLong E F，Olsen G J，et a