多肽类药物.docx

1、多肽类药物多肽类药物多肽类药物多肽和蛋白质类生物药物按药物的结构分类可分为：氨基酸及其衍生物类药物、多肽和蛋白质类药物、酶和辅酶类药物、核酸及其降解物和衍生物类药物、糖类药物、脂类药物、细胞生长因子和生物制品类药物。结构分析多肽的定性至少应包括氨基酸分析、序列分析及质谱分析。纯肽的氨基酸分析可提供该多肽的氨基酸组成和数量。序列分析则提供氨基酸残基的精确排列顺序。基于多种技术的质谱, 如快原子轰击、电喷雾、激光解吸, 经常用于提供多肽的相对分子量及其序列信息。肽谱是蛋白质或多肽通过酶解得到的肽片段经分离和分析所得到的“指纹图谱”。当多肽含有20 个以上的氨基酸残基时, 肽谱分析对多肽结构研究和特

2、性鉴别具有重要意义。2. 1氨基酸分析用于氨基酸分析的水解方法主要是酸水解, 同将第一次轰击得到的分子离子进行再一次惰性原子轰击, 使肽链在不同部位断裂, 从而得到一组片段的质谱信息, 使多肽测序得以实现2. 3. 2电喷雾质谱(elect ro sp ray ion izat ion2massspect romet ry, ES I2M S)ES I2M S 由于可以产生多电荷峰, 与传统质谱相比扩大了检测的分子质量范围, 提高了灵敏度, 可以得到准确的分子量。ES I2M S 可分为正离子和负离子, 一般多肽和蛋白质的ES I2M S 分析总是以正离子方式进行。ES I2M S 的最大优势

3、是可直接与HPLC、HPCE 联用, 能在多肽酶解后得到HPLC 或HPCE 肽谱的同时得到一张精确的质量肽谱(肽谱和质谱的结合称为质量肽谱)。ES I2M S 在质量肽谱图中能得到分子量低于400u 的小分子肽段, 可以鉴定一些在其他质量肽谱图中不能区分的肽谱9 。在质量肽谱中应用ES I2M S 可提供一种快速证实多肽氨基酸序列的方法。ES I2M S 所产生的多电荷离子特别适用于串联质谱分析, 用来检测目标肽段, 可得到完全的序列信息。王贤纯等10 运用串联ES I2M S解析出7 肽及其修饰产物、10 肽、20 肽的氨基酸序列。2. 3. 3基质辅助激光解吸质谱(mat rix2ass

4、istedlaser deso rp t ion ion izat ion2mass spect rometry,MALD I2M S)MALD I2M S 克服了直接用激光解吸离子化的缺陷, 为分析非挥发性、热不稳定的大分子提供了一种较好的离子化方式。它的最大优点是允许样品中含有几百毫摩尔的缓冲液及表面活性剂, 且灵敏度比别的离子化方式高, 可至fmo l 级11 。MALD I2M S能有效地分析较复杂的肽混合物, 特别适合混合蛋白质多肽类物质相对分子量的精确测定。周红华等12 用基质辅助红外激光解吸质谱法确证了3 种寡肽的一级结构, 为测定寡肽的分子量和一级结构提供了一个简便、快速、准确

5、的方法。2. 4 核磁共振( nuclear magnet ic resonance,NMR)NMR 因图谱信号的纯数字化、过渡的重叠范围过宽和信号弱等原因, 以往在多肽物质的分析中应用不多。随着二维、三维以及四NMR 的应用,分子生物学、计算机处理技术的发展,NMR 逐渐成为此类物质分析的主要方法之一。NMR 可用于氨基酸序列、定量混合物中各组分组成含量等的分析中。NMR 在分析少于30 个氨基酸的小肽时是非常有用的, 可以达到快速准确分析的目的13 。L indon等14 HPLC2NMR 联用, 在连续流动模式下对27个合成的多肽混合物进行了分离和鉴别, 快速得到了各多肽的结构。2. 5

6、肽谱分析(pep t ide mapp ing)肽谱分析是多肽药物质量控制的重要手段。肽谱对每一种多肽药物来说都是特征、专一的。通过肽谱分析可以鉴别多肽, 预测其一级结构特征, 比较功能相近多肽结构的类似性和各批产品一级结构的一致性。肽谱分析根据多肽分子量大小以及氨基酸组成特点, 使用专一性较强的蛋白水解酶(一般为肽链内切酶) 作用于特殊的肽链位点, 将多肽裂解成较小片段, 通过一定的分离检测手段得到特征性的指纹图谱。肽谱分析对于蛋白质多肽的结构和特性鉴别具有重要意义, 已成为许多蛋白质多肽药物质量控制的重要方法15 。2. 5. 1凝胶电泳(PA GE) 肽谱分析双向电泳、等电聚焦电泳等凝胶

7、电泳技术在蛋白质多肽的纯度、杂质检查以及分子量、等电点、含量测定等方面发挥了重要作用。双向电泳作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一, 仍然是目前分析组分复杂蛋白质分辨率最高的工具。对于分子量大于10 ku 的蛋白质, 凝胶电泳技术已日臻完善; 而对于分子量小于10 ku 的小分子多肽分析总是不尽人意。银染SDS2PA GE 微量肽图法适于CNB r 裂解的较大肽片段的分离检测, 而对酶裂解的肽段, 由于其分子较小, 检测效果不佳16, 17 。随着生物检测技术的不断发展, 本法逐渐被灵敏度更高的肽谱分析方法所替代。2. 5. 2HPLC 肽谱分析由于HPLC 分辨率及检测灵敏度较凝胶电泳高得

8、多, 当多肽药物经作用于特殊肽链位点的蛋白酶裂解, 得到一系列的肽片段后, 可用HPLC 有效地鉴定基因工程产品、天然产品以及有关的杂质。杨化新等18 通过RP2HPLC 法采用C18柱, 检测了经胰蛋白酶裂解的多种重组人生长激素(rhGH)肽片段, 成功地获得了rhGH 特征性的胰肽图谱。张培培等19 利用V 8 酶专一性裂解Glu 的羧基端肽链, 通过RP2HPLC 法采用C8 柱, 对胰岛素进行了肽谱分析, 成功地将来自不同种属、结构仅差1 个氨基酸的胰岛素与重组胰岛素进行了鉴别。L ahm等17 和Garn ick 等20 也分别用HPLC 对重组人白介素22 及rhGH 进行了肽谱分

9、析。诸多成功的应表明HPLC 肽谱分析在多肽药物质量控制中具有广阔的应用前景。2. 5. 3HPCE 肽谱分析HPCE 是近十几年发展起来的一项新的分析技术, 它将电泳技术和色谱技术结合, 具有分离效率高, 速度快、模式多等特点。毛细管的柱效与样品分子的扩散系数成反比, 而蛋白质、多肽具有扩散系数小的特点, 这意味着HPCE 非常适合于蛋白质及多肽的分析研究21 。多肽分析中常用的分离模式有毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳等。在用HPLC 进行肽谱分析的过程中, 因亲水性多肽在反相柱上不保留, 某些结构相差1 个氨基酸的多肽片段难以分离。而采用HPCE 进行肽

10、谱分析时, 因为结构相似或氨基酸组成相同而顺序不同的多肽所带的电荷不同, 可通过调节电解质的pH 使迁移时间改变而达到分离。F renz 等22 分别利用RP2HPLC 和HPCE 对胰蛋白酶降解的rhGH 进行分析, HPLC 出峰大约需时150 m in, HPCE 仅需12m in; 在HPLC 色谱图中未出现的峰在HPCE 中出现了; 收集HPLC 的单峰在HPCE 中运行, 出现了两个峰。此研究结果表明HPCE 是肽谱分析中更有效的工具。含量测定1HPLC 到1980 年代HPLC 就已发展为检测蛋白质多肽结构和纯度的重要分析工具。它用于定量分析具有灵敏、精确、快速的特点, 现在多肽

11、的纯度分析大都采用HPLC 法。包括反相、离子交换和疏水性相互作用在内的HPLC 技术都可用于检测多肽的纯度。对胰岛素的鉴别和含量测定, 中国药典2000 版和美国药典23 版均采用了HPLC 检测方法。董文玉等采用HPLC 成功地将由组合化学合成的10种结构相近的目标多肽与其它杂质分离, 确定了目标多肽的纯度。通常与HPLC 连用的紫外或荧光检测器无法分辨性质相近的组分间的细小差别, 常常造成结果的偏差。近年来出现的HPLC2M S、HPLC2M S2M S或HPLC2NMR 等联用技术, 使HPLC 能更快速准确地分析样品的组成和纯度。2HPCE与HPLC 相比, HPCE 分离效率更高、

12、上样量更少, 是一种灵敏的蛋白质多肽纯度检测方法。有些多肽在HPLC 上测得纯度为100% , 但在HPCE 分析时纯度仅为90% , 也就是说HPLC 中的单峰在HPCE 中出现多个峰。胰岛素、生长抑制素等多肽药物已有用HPCE 进行纯度分析的报道。HPCE 较差的检测限是该分析方法在纯度分析应用上的一个限制。有研究者采用堆积方法有效地克服了这个问题, 使检测信号大大增强。鉴别试验1.1生物检定法由于蛋白多肽类药物多为有生物活性的物质,且生物活性不仅取决于药物的一级结构，与二 、三级结构亦密切相关，故生物检定法是研究该类药物动力学独特而必需的方法。生物检定 法 有两个目的，直接测定体液中药物

13、浓度及鉴定标记药物的生物活性。其方法主要可分为两大 类。1.1.1在体分析常规的有胰岛素的小鼠血糖法等，另外还有根据各 类蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各异的方法，如根据IL-8可将大量中性粒细胞从骨中动员出的性质1 而建立 的IL-8动员中性粒细胞家兔体内实验。这类方法最直观地反映生物活性，但涉及整体动物 ，费时费力，灵敏度不高，变异较大。1.1.2离体组织（细胞）分析如NGF刺激鸡背根神经节增长，缩宫素 的大鼠离体子宫法等。 随着分子生物学的发展，许多特异性强，灵敏度高的依赖细胞株被建立，细胞培养已是最常 用的方法。根据蛋白多肽与细胞相互作用的机理不同，具体的操作亦有多种。如细胞增殖法

14、（Proliferation assays）,快速灵敏,但特异性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),检测系统简单,灵敏而专一; 减少细胞损伤法(Cytopathic effect reduction assays ) 2,则是依据具有抗病毒活性的药物如干扰素，保护细胞不受病毒损伤, 方法直观 灵敏, 但 可能会受到多肽亚型的干扰。以上的方法都是以细胞数目的增减为量效指标，计数方法有直 接计数法和间接计数法，后者包括MTT法，同位素（3H,14C）掺入法 等。此外，还有根据蛋 白多肽与细胞间接作用进行检测，如与免疫检测联用的抗体诱导法3，结合酶反 应的酶诱

15、 导分解法4等。总的说来，细胞培养法多具有灵敏特异，客观可靠的优点，但其 不足也显 而易见。首先，生物检定法无法定量失去活性的小代谢物，无法示踪它们的体内动态；其次 ，样品多存在于人或动物血清中，血清中内源物质的干扰以及可能存在的内源因子的交叉反 应，影响了方法的专属性；再者，启动生物过程常需阈量细胞因子从而降低了方法的灵敏度 ；依赖株细胞长期培养易发生变异而影响检测的特异性。1.2免疫学方法免疫学方法是利用蛋白多肽药物抗原决定簇部位的单克隆或多克隆抗体特异地识别被检药物 ，再以放射计数，比色等方法予以定量，即将特异的抗原抗体反应配以灵敏检测的方法。常 用的方法有三种。1.2.1放射免疫法（R

16、adioimmunoassays RIA）该法是被测药物（Ag ）,标记药物（多为125I-Ag）与抗体（Ab）的竞争性结合反应，方法的特异性 取决于抗原抗体的亲和力及标记药 物的纯度，与生物检定法相比，有简明，易于控制的优点。1.2.2免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）该法中 被测药物依然是Ag，它 先与固定相上的Ab形成AbAg复合物，再与标记抗体125I-Ab结合，形成AbAg 125I-Ab夹心 状。由于Ag需有两个Ab来识别，这就大大增加了方法的特异性，是一灵敏而低变异的方法， 只是对标记抗体的纯度要求很高。1.2.3酶联免疫法（Enzyme

17、-linked immunosorbent assays ELISA）ELISA的原理与IRMA相 似，只是第二个抗体不是用碘标，而是用可以与底物发生显色反应的酶如HRP来标记，与上 述两法相比，ELISA具有使用寿命长，重复性好，无辐射源的优点，并且已有不少实验证明 ，它与生物检定法具有一定的量效关系4及相关性5，提示它可部分地 反映药物的生物活性。免疫学方法的缺点在于它测定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同时测定代谢 物，且具有抗原决定簇的代谢片段可能增加结果误差；不同来源的抗体与相同的蛋白多肽反 应可能有较大的差别；还可能受到内源物质的干扰。但免疫法毕竟是一种迅速，灵敏，适于批

18、处理的方法，已有数十种蛋白多肽被开发成能满足药物动力学研究的商品药盒。临床 药动学领域，免疫法已逐渐取代生物检定法。1.3同位素标记示踪法放射性同位素标记技术是研究蛋白多肽在生物体内处置的一种最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期适宜，标记制备简单 而最为常用。标记方法有两种，一是内标法，即把含有同位素的氨基酸加入生长细胞或合成 体系，该法对生物活性地影响可能较小，但由于制备复杂而限制了其广泛应用；二是外标法 ，常用化学方法如氯胺T或Iodogen法将125I连接于大分子上，因相对简单而被首 选。同位素法具有简便直

19、观，检测迅速的优点，尤其适用于蛋白多肽药物的组织分布研究，但其 缺点亦显而易见。首先，它不能进行人体药物动力学研究；其次，同位素标记后是否会引起 药物的生物活性及其在生物体内的代谢行为发生变化，一直存在争议前者可通过调整反应 条件和生物检定法加以改善和验证，基本上可使生物活性无明显变化；后者因药而异则复杂 的多，已有报道认为6，放射性标记法可干扰表皮生长因子与细胞的相互作用， 从而导致 其体内清除的紊乱；最后，由于蛋白多肽进入体内会被降解代谢，或与其它蛋白质结合，总 的放射性不能代表药物动力学过程，因此如何鉴别样品的原药，降解物及结合物是该法中需 解决的关键问题，常用的方法有两种。1.3.1S

20、DS-PAGE法根据药物Mr的大小选择不同浓度的凝胶电 泳，通过控制电流等条件使得原 药与其它产物分开，然后通过切割胶条放射计数或放射自显影的方法，来检测电泳放射性图 谱。该法具有较高的分辨率和灵敏度，但电泳过程中，125I-小肽和游离 125I可能扩散至空白凝胶或电解液中，从而使结果可能偏高。1.3.2HPLC法高效反相色谱（RHPLC），高效排阻液相色谱（SEHPLC ）7，高效离子交换液相色 谱（IEHPLC）分别根据保留时间与蛋白多肽的疏水-亲水性特征，Mr大小，极性的 关系 来分离样品中的物质。它们共同的优点是特异性高，分辨率好，可同时测定原药和降解物， 其中SEHPLC亦可得到结合

21、物的信息，而RHPLC用于蛋白多肽的分离有独特的优越性。但因受 注入样品量的限制，灵敏度，重现性都受影响，且设备昂贵，成本较高。1.3.3 HPLC-RAD法高效液相偶联同位素在线检测系统。这种方法将HPLC的高度分析分离行为和同位素的高灵敏度检测结合在一起。使得药物的分析分离更加直观和方便。特别在蛋白质多肽类药物药动学方面体现了其独特的优点。1.4色谱法1.4.1HPLC在进行普通药物动力学研究中，HPLC是技术成熟，应用广 泛的分析手段。在蛋 白多肽药物的实验研究或产业化中，HPLC都是主要的分离纯化工具。但鉴于蛋白多肽药物结 构的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio8，加

22、压素的八肽拮抗剂（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）9可分别直接或经选择性柱反应后,单独 用带荧光检测 器的HPLC进行药动学研究外，HPLC常需进一步改进或与其它更灵敏的检测技术联用方能满足 药动学的需要。除了上述提及的与同位素的联用，还有许多与免疫学方法的联用，如Philli ps10采用免疫亲和色谱技术分析人三种不同体液中粒细胞集落刺激因子的浓度； Partilla 11等认为HPLC与RIA联用可以检测人体液中的神经肽。此外，令人瞩目的还有液 /质在线联用（LC-MS）。LC-MS将高分离能力，适用范围广泛的色谱分离技术与高灵敏、专属及通用

23、,在研究蛋 白多肽的结构中具有重要价值的质谱法联用起来，成为强有力的分离分析方法。多年来限制 LC-MS技术发展的决定因素是接口问题，由传送带接口（Moving-belt interface），热喷 雾 接口（Thermospray），到最近的电喷雾离子化接口（Electrosptay ionization ESI），联 用技术日趋成熟，尤其适用于生物样品中低浓度（pg/ml）药物及代谢物的测定12 ，而蛋 白多肽类药物恰有在体内代谢快，浓度低的特点。国外已将用LC-MS于该类药物，药物代 谢 物13，14的动力学研究，国内尚处于起步阶段，除了仪器本身价格昂 贵，技术上亦存在 一些问题，如它对

24、样品的纯度要求很高如何将药物从生物体液，尤其是血浆中提取纯化以 减少干扰；如何选择合适的内标以减少系统误差；在将LC-MS用于检测体育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)时发现，糖肽难用于质谱分析，因为在质谱条件下，同样的氨基酸序列可产生 多种不同质量的多糖链，而每条链及整个分子都有可以产生质谱信号，这就大大降低了质谱 信号的专属性。尽管LC-MS在蛋白多肽药物的体内药物代谢动力学研究中还存在一 定的难度，但其作为实用性强，前景好的领域已引起人们的广泛关注。1.4.2高效毛细管电泳（HPCE）HPCE是离子或荷电粒子以电场为驱动 力，在毛细管中按其 浓度和分配系数不同进行高效，快速分

25、离的新技术，它以高分辨率，高灵敏度，分析时间短 ，样品量少及操作简单等诸多优点而成为蛋白多肽生物分子分离分析的重要手段。在临床 上 ，生物体液中低浓度蛋白多肽的分析面临的问题有：蛋白多肽与毛细管壁的相互作用所引起 的迁移时间的改变，这可以通过涂层CE加以改善；由于毛细管很细，管内容积很小，进样量 的不易控制给实验的重复性带来影响，而且很可能无法对低浓度的样品提供足够的灵敏度。 国外根据样品的性质采用不同的预处理，大体上可分为非特异性和高亲和性两种， 将样品加以浓缩，取得了满意的效果15。HPCE在检测上的迅速发展与HPLC已有并 驾齐驱之 势，况且鉴于HPCE在样品微量分析的优越性，已有人在药

26、物动力学研究、体内分析中，将微 透析连续采样与之联用16，这在整个药动学研究中都不失为一有希望的方向。由以上可知，现代科学技术的发展给蛋白多肽类药物的研究提供了多样的分析手段，但鉴于 该类药物的特殊性，尚无一种方法能完全满足动力学研究的要求。根据人用药物注册国 际协调会议（ICH）对生物药物临床前安全性评价“在科学基础上的灵活性和具体情节个别 处理”的总则，人们通常将几种方法联合应用，互相补充，才能得到比较可靠的结果。应用随着一些高科技手段在多肽药物中的应用，作为基础营养物质，多肽比氨基酸更易吸收，生物利用度高。蛋白质的酶解产物除了作为营养品满足人体生长发育的需要外，还具备特殊的生理调节功能，

27、这些功能往往不能用原食品的氨基酸组成来解释。功能性多肽是将大分子蛋白质应用生物技术切割而成，切割以后的小分子蛋白质片段，可以产生原蛋白质所没有生理调节功能。由于多肽本身是小分子物质，多肽的免消化、直接吸收的营养特性，可以提高功效和减轻胃肠道的消化负担，对于消化功能不好的人群具有极其明显的优点。实验证实: 功能肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，而且具有特殊的生理学功能; 可以降低血脂、延缓衰老、美体养颜、抗氧化、抗忧郁、抗疲劳、改善睡眠、增强记忆、抑制肿瘤等; 能促进人体对蛋白质，维生素及各种有益微量元素的吸收34 36。生物活性肽的开发应用是当前生物工程领域的热门课题，其广泛应用于医药、保健、食品、化妆品等行业37，正在形成具有广阔前景的新产业。20 世纪80年代，国际上如日本、韩国、美国和欧洲等国家都已经有了专业的多肽经营企业进行产业化运作。交流和研究课题涉及生物、化学、制药、食品等众多与多肽相关联的产业。多肽类化合物广泛存在于自然界中，利用其提高人体免疫，增强抗病能力，维护肌体健康方面的功效一直是开发新型保健品的一个主要方向，将是21世纪最有前途的产业之一。随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断提高。一些新方法、新思路的应用，不断有新的肽类物质应用于防病治病之中。