酶活测定方法.docx

1、酶活测定方法酶活测定方法土壤酶活测定 取根际土壤为土壤样品，同时挖取根系周围0-20cm和20-40cm土样，分层充分混合后作为非根际土壤样品。充分混匀后取样，用于土壤酶活性测定的土壤经风干后，过1mm筛，测定多酚氧化酶活性土样过0.25mm筛。供微生物分析的鲜土样装入已消毒过的密封塑料袋，带回实验室，磨细过2mm筛后，置于4?冰箱内保存备测土壤微生物种群、数量等。 蔗糖酶测定(比色法) 1. 方法选择及原理 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。蔗糖酶活性的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖(滴定法或重量法)或是根据蔗糖的非还原性，用生成物(葡萄糖和果糖)能够还原菲林溶液中的铜，再根据

2、生成的氧化亚铜的量求出糖的含量。也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质(3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜)生成有色化合物进行比色测定。还有一种方法，根据蔗糖液酶促反应前后光偏振面的变化(旋光法)进行测定。 目前，我国常用的主要是硫代硫酸钠滴定法，它是测定土壤蔗糖酶活性的经典方法。3，5-二硝基水杨酸比色法重现性较好，且手续较简便，适于成批样品测定。 测定土壤蔗糖酶活性时，均以蔗糖为基质，蔗糖液浓度范围为5-20,。在酸性介质中，蔗糖酶活性最大。为保持该酶最适pH，多使用下列缓冲液:醋酸盐缓冲液(pH4.5-5.5)，磷酸盐缓冲液(pH4.9-5.5)，醋酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.5)。 2. 试剂配

3、制 (1)3，5-二硝基水杨酸溶液:称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml(不超过7天)。 (2)pH5.5磷酸缓冲液:1/15M磷酸氢二钠(11.867g NaPO2HO溶于1L蒸242馏水中)0.5ml加1/15M 磷酸二氢钾(9.078gKHPO溶于1L蒸馏水中)9.5ml24即成。 (3)8,蔗糖溶液。 (4)甲苯。 (5)标准葡萄糖溶液:将葡萄糖先在50-58?条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml 12mmol苯甲酸溶液中(5mg还原糖/ml)，即成标准葡萄糖溶液。 标准曲线绘制:取0、0.1、0

4、.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml含5mg还原糖/ml的标准葡萄糖溶液到50ml容量瓶中，与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色。 3. 试验步骤 称取5g风干土，置于50ml三角瓶中，注入15ml 8,蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲液和5滴(0.25ml)甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37?下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量量瓶中，加3ml 3，5-二硝基水杨酸，并在沸水的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。 溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508

5、nm处进行比色。 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质(无蔗糖)对照，整个试验需做无土壤对照。 4. 结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖(毫克),a50ts/m a,显色液中葡萄糖浓度(mg/ml)， 50,显色液体积(ml); ts,分取倍数(吸1ml滤液比色就是20/1); m,烘干土质量(g)。 脲酶测定(比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。大多数细菌、真菌和高等植物具有脲酶。它是一种酰胺酶，能酶促有机质分子中肽键的水解。土壤的脲酶活性与土壤的微生物数

6、量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤脲酶是一种酰胺酶，能促进土壤有机质分子中酰胺键的水解，因此，在富含有机质的土壤中，脲酶的活性一定高。脲酶是一种高度专性的酶，能酶促尿素的水解，因此可以测定产生的氨或二氧化碳的量，或测定基质尿素的减量，以表示脲酶的活性。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂:(所用试剂至少为分析纯，水最好用高纯水) 1)甲苯 10%尿素:称取10g尿素，用水溶至100ml。 2)3)柠檬酸盐缓冲液(pH6.7):184g柠檬酸溶于

7、300ml蒸馏水;147.5g氢氧化钾溶于500ml蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将pH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4)苯酚钠溶液(1.35mol/L):62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml(A)，存于冰箱中;27gNaOH溶于100ml水(B)。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将两溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。(当天配) 6) 氮的标准溶液: 精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液(100

8、ppm)。 标准曲线绘制: 吸取配置好的氮标准溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍(10ppm) (0.01mg/mL)。分别吸取该液1，3，5，7，9，11，13，15ml至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀，充分摇荡，放置20分钟显色，用水稀释至刻度。1h内将着色液在(紫外)分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 操作步骤: 1) 称取5g风干土样于50ml三角瓶中 2) 向三角瓶中加入1ml甲苯(以能全部使土样湿润为度)并放置15分钟 3) 之后加入10ml 10,尿素溶

9、液和20ml柠檬酸缓冲液(PH6.7)，并仔细混合 4) 将容量瓶放入37?恒温箱中，培养24h 5) 显色:吸取3ml滤液(可根据情况而定，比如1ml)于50ml容量瓶中，加入20ml蒸馏水，充分震荡，再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀，充分摇荡，放置20分钟显色，用水稀释至刻度，溶液呈现(青定)酚的蓝色。 6) 1h内在(青定)酚的蓝色在1h内保持稳定)在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。 7) 无土对照:不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照 8)无基质对照:以等体积的水代替基质(此为10ml尿素溶液)，其他

10、操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。 结果计算: 用供试样品所得的消光值减去对照样品消光值的差，根据标准曲线求出氨态氮量。土壤脲酶活性以每1g土壤中NH,N的毫克数表示。 3Ure,(X样品,X无土,X无基质)*V*n /m 式中:Ure ,土壤脲酶活性值 X样品样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH,N浓度 3(mgNH,N/ml) 3X无土无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH,N浓3度(mgNH,N/ml) 3X无基质无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH,3N浓度(mgNH,N/ml) 3V 显色液体积(此为50mL) n 分取倍数(此为100/3) m 烘干土

11、重(g)(鲜土要根据水分系数换算) 注意事项: 当脲酶活性为3-80微克NH-N时，本法能获得可靠结果。当脲酶活性小3于3微克NH-N，培养时间需增至24小时(计算时应考虑这一点) 3磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法): 土壤磷酸酶是植物根系与微生物的分泌产物。磷酸酶与土壤P素转化密切相关，是土壤P素肥力的指标。 1、试剂配制 (1)5%磷酸苯二钠(用缓冲液配制) (2)醋酸盐缓冲液(pH=5.0)、硼酸盐缓冲液(pH10.0)、柠檬酸盐缓冲液(pH7.0) (3)氯代二溴对苯醌亚胺试剂:取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶

12、液未变褐色之前均可使用。 (4)酚的标准液: 酚原液-取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液-取10mL酚原液稀释至1L(每mL含0.01mg酚)。 (5)甲苯 (6)0.3%硫酸铝溶液。 缓冲溶液配制: (1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0) A:0.2M醋酸钠溶液:16.4g 无水醋酸钠(CHONa)溶于1000mL蒸馏水232中，或是27.2g三水醋酸钠(CHONa.3HO)溶于1000mL水中。 2322B:0.2M醋酸溶液:11.55mL醋酸定容于1000mL 醋酸盐缓冲液(pH=5.0):7mLA，3mLB混合即得 (2)碱性磷酸酶:硼酸盐缓冲液(p

13、H10.0) 硼砂,氢氧化钠缓冲液(pH10.0): A:硼砂液:19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中 B:氢氧化钠溶液:4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中 50mLA，43mLB加水稀释至200mL，混匀即得 (3)硼酸盐缓冲液(pH9.0) A:0.05M硼砂溶液:19.07g硼砂(NaBO10HO)溶于1000mL蒸馏水中 2472B:0.2M硼酸溶液:12.37g硼酸(HBO)溶于1000mL蒸馏水中 33硼酸盐缓冲液(pH9.0):80mLA+20mLB混匀即得 (4)中性磷酸酶:柠檬酸盐缓冲液(pH7.0) A:0.1M柠檬酸溶液:21.01g柠檬酸. HO(或是19.21

14、gCHO)溶于1000mL2687蒸馏水中 B:0.2M磷酸氢二钠:35.61g磷酸氢二钠.2 HO(53.63g磷酸氢二钠.7 HO或22是71.7g磷酸氢二钠.12 HO)溶于1000mL蒸馏水中 2柠檬酸盐缓冲液(pH7.0):3.63mLA+16.37mLB混匀即得 标准曲线绘制:分别向50mL容量瓶中注入1，3， 5，7，9，11和13mL酚工作液，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。 2、操作步骤: 称取5,土于200mL容量瓶中，加2.5mL甲苯，加塞塞紧轻摇15min。再加入20m

15、L0.5%磷酸苯二钠(中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液)，仔细摇匀后放入恒温箱，在37?下培养24h。后于培养液中加入不100mL 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3mL滤液于50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。 磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示(若用P的毫克数表示，结果需乘0.32;若用PO的毫克数表示，需乘2.29)。 25过氧化氢酶测定(容量法) 过氧化氢酶也叫接触酶，能促进过氧化氢对各种化合物的氧化。几乎在所有的生物体内部有过氧化氢酶，在某些细菌里，其数量约为细胞干重的1,。土壤的过氧化氢酶活性，与土壤呼吸强度和土壤

16、微生物活动相关，在一定程度上反映了土壤微生物学过程的强度。 原理 过氧化氢酶的测定有测压法和滴定法。测压法是测定过氧化氢分解时析出过氧化氢酶 的氧量(反应式为: HO+HO O+HO，方法简单，但准确性较差。后者22222 则是定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量，反应式为 2KMnO+5HO+3HSO 2MnSO+KSO+8HO+5O，4222442422此法测定结果较好。 试剂 (1) 0.3% HO:按1:100将30,的HO用水稀释。 2222(2) 3N HSO(也就是1.5mol/l HSO):以配1000ml为例，需要的浓硫酸2424的体积为1.5*98.08/1.83=80.39

17、ml，可以取80ml。 KMnO的分子量=158.026,当量=31.605.高锰酸钾水溶液受到水中还原物和4杂质以及受日光直射等影响能分解析出棕色的含水的二氧化锰沉淀，而有浓度的改变。因此在配制其标准溶液时必须使用棕色瓶盛装，以防日光直射作用.配制后并应放置一段时间，待与水中还原物完全作用后，滤去沉淀，然后进行标定，才能得到基本稳定不易变化的标准溶液。 (3) 0.1N KMnO溶液:称取化学纯高锰酸钾3.161克，溶于l升无CO蒸馏42水(沸水)中，溶解后,在暗处放置一周, 然后用虹吸管将上部澄清溶液移于棕色瓶中(或用玻璃棉滤过)保存，以备标定. 注:C(1/5 KMnO)=0.1mol/

18、l表示的就是0.1N KMnO溶液。 440.1N KMnO溶液标定(GB/T601-2002) 4称取0.2g(准至0.0001g)于105110?烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL(8+92)硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液c(1/5 KMnO)4=0.1mol/l滴定，近终点时加热至65?，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验(不加草酸钠，其他一样)。 高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算 c(1/5KMnO)=m*1000/(V-V)*M 412式中 c(1/5KMnO)高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L; 4m草酸钠之质量，g; V滴定草酸钠消耗的高锰酸钾溶液之用量，

19、mL; 1V空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL; 2M草酸钠的摩尔质量的数值,单位为(g/mol)， M(1/2NaCO)=66.999 224或者 c(1/5KMnO)=m/(V-V)*0.06700 4120.06700与1.00mL高锰酸钾溶液c(1/5KMnO)=0.1mol/l相当的以克4表示的草酸钠的质量。 操作步骤: (1)取2.0 g土，置于100mL(或150ml)三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3,HO溶液。(B) 22(2)同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3,过氧化氢溶液，而不加土样。(A) (3)将三角瓶放在往返式振荡机上120r/m

20、in振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1N KMnO滴定至淡粉红色终点。 4结果计算 用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为A。以20min后1g土壤消耗的0.1N KMnO溶液的毫升数表示(以20min后1g土壤中的过氧化氢的4毫克数表示,)。 土壤过氧化氢酶活性 =(A-B)T/dwt 式中，T为高锰酸钾滴定度的校正值。 dwt烘干土质量(g) 举例 KMnO4标定:10mL 0.1mol/L 草酸用0.02mol/LKMnO4滴定，

21、所消耗KMnO4体积数为19.49mL，由此计算出KMnO4标准溶液浓度为0.0205mol/L，即实际的KMnO4浓度。 T-高锰酸钾滴定度的矫正值 T=0.0205/0.02=1.026 脱氢酶测定(比色法)(关松荫) 试剂 1)1% TTC(三苯基四氮唑氯化物) 2)CaCO 33) 甲醇 4)甲臢(TPF)的标准溶液:用TTC还原配制。 TTC标准溶液:称取50mg已烘干的TTC于50ml的容量瓶中，加水定容，得1mgTTC/ml的标液(1000ug/ml)。 、4、6、8、10、20、30 ug/ml标准曲线的绘制:将TTC标准溶液配制成2的三苯基四唑氯化物溶液，分别加10mg Na

22、HSO还原，显色后在分光光度计上3于460nm处比色测定并绘制标准曲线。 操作步骤 取20g土壤于50ml三角瓶中，加0.2g碳酸钙。混匀后加2ml1%三苯基四唑氯化物，再加水至最大持水量的90%(5d)，在恒温恒湿培养箱中(30?，相对湿度70%)培养24h。 培养结束后，加25ml甲醇，振荡5min，过滤。再用甲醇多次洗涤漏斗上的土壤，直至获得无色滤液。合并滤液和洗液并定容50ml或100ml，在分光光度计上于460nm处比色(以甲醇做空白)。 不加土及TTC做一个空白对照。 结果计算 酶活性表示:根据减去空白对照的光密度值查标准曲线即可求出产生的三苯基甲臢的量，该量(ug/g干土)即表示

23、脱氢酶的活性。 土壤脱氢酶活性(ugTPF/g干土)=C*V/dwt 或根据形成1mg三苯基甲臢需要150.35ul氢，也可以转移氢的体积表示。X=av*150.35 式中:C滤液中TPF的量(ug/ml)(由标曲查知) a1ml滤液中TPF的毫克数(查标准曲线) V滤液体积(ml) dwt 烘干土的质量(g) 150.35将TPF量换算成氢的体积(ul)的系数 纤维素酶测定(硝基水杨酸比色法) 试剂 1)1% 羧甲基纤维素溶液 2)pH5.5磷酸盐缓冲液:由0.06MKHPO和NaHPO溶液混合制成(配制2424方法见蔗糖酶缓冲液的配制)。 3) 甲苯 4)3，5-二硝基水杨酸溶液:称0.5

24、g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml(不超过7天)。 5)葡萄糖标准溶液 将葡萄糖先在50-58?条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml 12mmol苯甲酸溶液中(5mg还原糖/ml)，即成标准葡萄糖溶液。 标准曲线绘制:分别取不同浓度标准葡萄糖溶液1mL移于25mL容量瓶中，加3mL二硝基水杨酸溶液。将试管放在沸腾水浴上5min，然后迅速冷却3min。定容，15min后在分光光度计上于波长540nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。 操作步骤 取10g土壤于50ml三角瓶中，混匀后加20mL1% 羧甲基纤维素溶液、15mL pH5.5磷酸盐缓冲液及1.5mL甲苯，在恒温恒湿培养箱中(37?)培养72h。 培养结束后过滤,取1mL滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。 不加土及基质做一个空白对照。 纤维素活性，以72h，10g土壤生成葡萄糖毫克数表示。