同济大学基因工程310章总结.docx

1、同济大学基因工程310章总结基因工程总结第三章 基因克隆的酶学基础限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。型核酸内切限制酶的基本特性：（i）识别特异性序列；（ii）2个单链断裂部位在DNA分子上通常不是彼此直接相对的；（iii）断裂形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。 酶切位点：绝大多数的型核酸内切限制酶，都能够识别由48个核苷酸组成的特定的碱基序列，它们双重旋转对称 (回文结构)。即为酶切位点。粘性末端，是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构。它

2、们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。具平末端的DNA片段则不易于重新环化。同裂酶（Isoschizomers）：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶子序列。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶（Isocaudamer）：来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。核酸内切限制酶的命名法名称字母 来源 含义 EEscherichia（属）cocoli（种）RRY13（品系）I首先发现在此类细菌中发现的顺序影响核酸内切限制酶活性的因素1. DNA的纯度 2. DNA的甲基化程度 3. 酶切消化反应的温度 4. DNA的分子结构 5. 核酸内切限制酶的缓冲液DNA连接酶（

3、ligase）：在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在两条DNA链之间形成的磷酸二酯键。作用方式：DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口（nick），即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂；而不能封闭裂口（gap），即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。 连接酶有两种不同的来源：一种是由于大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶，另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4 DNA连接酶（可以催化平端连结）。前者用NAD+作能源辅助因子，后

4、者用ATP作能源辅助因子。作用的分子反应过程可分三步：1 NAD 或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸。2 将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸;3 这个被激活的5-磷酰基端可以和DNA的3-OH端反应合成磷酸二酯键（连结），同时释放出AMP。 平末端DNA片段的连接：常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。末端脱氧核苷酸转移酶：它能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3-OH基团上。 热稳定的DNA

5、连接酶（thermostable DNA ligase），是从嗜热高温放线菌（Thermoactinomycesthermophilus）菌株中分离纯化的，一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种核酸酶。DNA聚合酶的共同特点在于，它们都能够把脱氧核糖核苷酸(dNTP)连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况Pol酶有三种不同的酶催活性： 1 5 3的聚合酶活性 2 53的核酸外切酶活性(仅仅限于匹配的双链) 35的核酸外切酶活性（单、双链均可，发生聚合酶活性的时候，35的核酸外切酶活性是受抑制的）大肠杆菌DNA聚合酶的K

6、lenow片段（E.coli DNA PolKlenow fragment），又叫做Klenow聚合酶或Klenow大片段酶。主要用途为： （i）修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端； （ii）标记DNA片段的末端； （iii）cDNA克隆中的第二链cDNA的合成； （iv）DNA序列测定。末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase， TdT ），简称末端转移酶，具有5 3方向的聚合作用，不需要模板的存在就可以将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3-OH末端。末端脱氧核苷酸转移酶的其它应用 催化a-32P-3-脱氧核苷酸标记目的DNA

7、片段的3-末端。这种修饰过的核苷酸由于没有3-OH，故使得目的片段会终止延伸 催化非放射性的标记物掺入到目的DNA片段的3-末端。例如生物素-11-dUTP等 按照模板合成多聚脱氧核苷酸的同聚物。 多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）催化-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5-OH末端，当使用-32P标记的ATP作前体物时，可以实现目的序列的同位素标记碱性磷酸酶：催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5-P末端转换成5-OH末端 在DNA体外重组中，为了防止线性化的载体分子发生自我连接作用，也需要从这些片段上除去5-P基团。 核酸外切酶（exo

8、nucleases）：是一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。Exo能够从5-末端或3-末端降解单链DNA分子，产生出212bp寡核苷酸短片段。是一种不需要Mg2+离子的核酸酶。 ExoIII主要活性是，按35的方向催化双链DNA自3-OH末端释放5-单核苷酸。 主要应用是，通过其3 5活性使双链DNA分子产生出单链区。 核酸外切酶exo催化双链DNA分子自5-P末端进行逐步的加工和水解，释放出5单核苷酸，但它不能降解5-OH末端。用途一，将双链DNA转变成单链的DNA，供测序使用；第二，从双链DNA中移去5突出末端，以便用末端转移酶进行加尾。S1核酸酶：催化RNA和单链DNA分子

9、降解成为5单核苷酸。同时它也能作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子Bal31核酸酶既具有单链特异的核酸内切酶活性，同时也具有双链特异的核酸外切酶活性。Bal31核酸酶与限制位点的确定 其主要用途包括：（i）诱发DNA发生缺失突变；（ii）定位测定DNA片段中限制位点的分布；（iii）研究超盘旋DNA分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构。第4章 基因克隆的质粒载体细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子，有一个例外之一是酵母的杀伤质粒成分是RNA质粒。基本特征： 独立于宿主染色体 自主复制的

10、遗传成份。 环形双DNA可以持续稳定地处于外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代构型：1. 共价闭合环形DNA (covalent closed circular DNA，cccDNA)：两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，通常呈现超螺旋构型；2. 开环DNA (open circular DNA，oc DNA)：两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口，呈现开环构型；3. 线性分子 (linear DNA，IDNA)：若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性，通称线性构型

11、。质粒的三个基本原件： 经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都至少包括三种原件，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点质粒拷贝数：在标准的培养基条件下，每个细菌中所含有的质粒DNA分子的数目。质粒的不亲和性/不相容性（plasmid incompatibility） 是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的质粒，不能够在同一个寄主细胞中稳定地共存。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥掉。. 质粒DNA拷贝数的控制： 高拷贝质粒倾向于在松弛控制下进行复制，其复制的启动是由自身编码的蛋白来控制； 低拷贝质粒通常是在严禁控制下进行复制，受到宿主细胞的蛋白

12、（复制起始蛋白）控制，且与宿主细胞染色体同步进行。质粒复制控制的分子模型抑制蛋白质稀释模型（inhibitor dilution model） 自体阻遏蛋白质模型（autorepressor model） 质粒DNA的分离与纯化：通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌细胞裂解；从清亮裂解液中纯化质粒DNA：1. 氯化铯密度梯度离心法；2. 碱变性法；3. 微量碱变性法影响质粒DNA产量的因素1） 寄主菌株的遗传背景2）质粒的拷贝数及分子大小质粒载体的构建及类型天然质粒,一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。质粒载体必须具备的基本条件 具有复制起点 具有抗菌

13、素抗性基因 具若干限制酶单一识别位点 具有较小的分子量和较高的拷贝数 质粒载体的选择记号载体质粒的类型高拷贝数的质粒载体：适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。它们不仅具有低分子量、高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条件下仍能继续复制。低拷贝数的质粒载体：适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA失控的质粒载体：是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。正选择的质粒载体 这种质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量表达型的

14、质粒载体 使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-翻译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体pSC101质粒载体 低拷贝数，12份， 分子量为9.09Kb 四环素抗性基因（tet）。 EcoRI等多个单克隆位点 第一个成功应用于真核DNA克隆的载体（1973）pBR322质粒载体的优点 具有较小的分子量。4 363bp。 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 pBR322 DNA分子内具有多个限制酶识别位点。 具较高的拷贝数，每个细胞中可累积10003000个拷贝。pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，

15、组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。典型的pUC系列的质粒包括： 来自pBR322的复制起点（ori） 氨苄青霉素抗性基因（ampr） lacZ检测系统 多克隆位点（MCS） 丧失迁移功能的质粒pBR327 1 拥有较高的拷贝数，平均每个大肠杆菌寄主细胞可达30 45份； 由于失去了bom位点，不能提高结合而转移，具有更高的安全系数。能在体外转录基因的质粒载体pGEM-3Z 穿梭质粒载体：所谓的穿梭质粒载体是指一类人工构建的，具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿

16、梭质粒载体 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体 大肠杆菌和动物细胞之间的穿梭质粒载体，如利用大肠杆菌和牛乳头瘤病毒构建的pBPV-BV1。第5章 噬菌体载体和柯斯载体噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫做 Bacteriophage（简称 phage）。它的DNA分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA三种不同的基本结构： 无尾部结构的二十面体 具尾部结构的二十面体（居多） 线状体型。 噬菌体的核酸类型 双链线性DNA（最常见） 双链环形DNA 单链环形DNA 单链线性DNA 单链RNA噬菌体的DNA碱基不绝对是由标准的A、T、G 、

17、C四种碱基组成。T4噬菌体DNA中没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）；SSP01噬菌体DNA中T碱基被5-羟甲基尿嘧啶（HMU）取代噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期温和噬菌体（temperate phage）：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体，叫做温和噬菌体。溶源性细菌（lysogen）：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫做溶源性细菌。如果有某些噬菌体基因缺失了，那么这样的噬菌体就不能够完成其溶菌周期，故含有这种噬菌体的细菌叫做缺陷性的溶源性细菌。溶源化（lysogenization）：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程，叫做溶源化。整合（i

18、ntegration）：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA之中，便叫做瞄合的噬菌体DNA。这种噬菌体DNA组入细菌染色体DNA的过程，称为噬菌体DNA的整合或插入。 以游离DNA分子形式存在的噬菌体DNA，叫做非整合的噬菌体DNA。原噬菌体（prophage）：在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA，叫做原噬菌体。原噬菌体中如有某些基因缺失了，便称之为缺陷性的原噬菌体。噬菌体，一种大肠杆菌双链DNA噬菌体。噬菌体的分子量为 31 106dal，是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，噬菌体的必要基因；

19、另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，为非必要基因。插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。替换型载体（replacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代。转染：真核细胞 转化：原核细胞噬菌体DNA的包装容量噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型DNA总量的5左右，而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75。柯斯质粒载体具体指一类由人工构建的含有噬菌体的 cos序列和质粒复制子的“质粒噬菌体复合体”。柯

20、斯质粒载体的特点第一，具有噬菌体的特性。可直接感染大肠杆菌寄主细胞。第二，具有质粒载体的持性。可复制、可扩增具抗性筛选标记。第三，具有高容量的克隆能力。克隆极限可达45kb左右。第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。柯斯克隆（cosmid cloning）定义：应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmid cloning）。理论依据：在线性噬菌体DN分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链粘性末端（cos位点）。在噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个DNA拷贝组成的多连体分子。噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specif

21、ic cutting system），叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成单位长度的片段，并将它们包装到噬菌体头部中去。只有在被作用的DNA分子具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在3854kb的条件下，Ter体系才能对它们发生作用。柯斯克隆的优点提高了克隆外源DNA片段的容量；所形成的非重组体的克隆本底比较低单链噬菌体载体 单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介的。这种复制形式的DNA（replication form DNA，RFDNA）,可以如同质粒DNA一样，在体外进行纯化和操作。 不论是RFDNA还是ss

22、DNA，它们都能够转染感受态的大肠杆菌寄主细胞，或产生出噬菌斑，或形成浸染的菌落。 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是与其DNA多寡相关的，不存在包装限制的问题。 可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。可用于Sanger法测序，也可用于制备DNA探针，还可进行寡核苷酸定点突变。 M13载体系列特别适用于克隆单链的DNA分子，或者克隆双链DNA分子中的每一条链噬菌粒载体的概念一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）。 分子量一般都比M13载体的小，约为3kb，易于体外操作。 可得到长达10kb的外源DNA的单链序列。 在大

23、肠杆菌寄主细胞内，可以按正常的双链质粒DNA分子形式复制，形成的双链DNA既稳定又高产。 而当存在着辅助噬菌体的情况时，噬菌粒按滚环模型复制产生单链的DNA，并在包装成噬菌体颗粒之后释放出细菌。噬菌体复制模式：当寄主细胞被辅助噬菌体M13感染之后， pUC118和 pUC119载体便转向按照M13噬菌体的滚环模型进行复制。它是受存在于这两个PUC载体上的M13噬菌体复制起点控制的。所产生的单链载体DNA分子可以被包装进由辅助噬菌体提供的外壳蛋白质中，形成的噬菌体颗粒随后被挤压出寄主细胞，分布在周围的培养基中. pUC118和 pUC119噬菌粒载体的优点1. 可克隆高达10kb的外源DNA片段

24、，并易于进行体外分离与操作；2. 编码有一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择；3. 拷贝数每个寄主细胞可高达500个，可制备出大量的载体DNA；4. 存在多克隆位点5. 可按照Xgal-IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组体分子； 6. 外源基因会以半乳糖管酶与外源蛋白质的融合产物表达；7. 含有质粒的复制起点和M13噬菌体的复制起点，具两种复制模式；8. 在两个载体中，多克隆位点彼此相反，一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录负链DNA。9. 可以直接对克隆的DNA片段进行核着酸序列测定。病毒载体概述要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2、介导外源基因转移和表

25、达 3、对机体不致病 容量：自身基因组大小的105%110% 组成：1、病毒复制和包装元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜 病毒载体 生物学特性 适用范围 逆转录病毒载体 Retrovirus 单链RNA病毒 810kb 可感染分裂细胞；整合到染色体中；表达时间较长；有致癌的危险； Ex vivo基因治疗；肿瘤基因治疗。 腺病毒载体 Adenovirus 双链DNA病毒 36kb 可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；表达时间较短；免疫原性强； In vivo基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗。 AAV病毒载体 Adeno-associated v

26、irus 单链DNA病毒 5kb 可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高； In vivo 基因治疗；Ex vivo基因治疗；遗传病基因治疗；获得性慢性疾病的基因治疗。 HSV病毒载体 Herpesvirus 双链DNA病毒 152kb 具有嗜神经性；可逆轴突传递；可潜伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂细胞； 神经系统疾病的基因治疗；肿瘤的基因治疗。 第6章 基因的分离与鉴定基因克隆的基本流程：包含着目的基因的分离和鉴定两个内容。基因组DNA的片段化鸟枪法（shotgun approach）：利用限制酶消化

27、基因组DNA，消化产物不经过凝胶电泳分离就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法。 形成的重组体分子是混合群体，筛选特定基因的工作量大，但可以一物多用。 目的基因中若存在着限制酶识别位点。就必须同时分离好几个克隆，才有可能获得目的基因的全序列。 如果某些限制片段的分子量太大或太小，则可能出现不能被克隆的情况。基因组DNA的双酶消化策略DNA片段的大小分部分离富集在克隆之前，先对片段化的给体DNA群体进行按大小的分部分离，会明显地提高克隆基因的分离频率。通常是使用琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心进行DNA片段的分部分离。可以在很窄的范围内获得高纯度的大小相近的DNA片段。重组体DNA分子的构建及导入

28、受体细胞非互补粘性末端DNA分子间的连接对于具有非互补粘性末端的两种DNA片段之间，经过Sl核酸酸处理变成平末端之后，分别给它们加上相同的一段衔接物，酶切后一样也可以使用T4 DNA连接酶进行有效的连接。影响连接效率的因素 阻止载体分子自身的再环化作用 正确地调整载体DNA和外源DNA之间的比例 DNA的总浓度不宜太低 温度：4度过夜，或者26度一个小时将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。 转化（Transformation）： 转染（Transfection） 转导（Transduction） 感染（Infection）互补作用基因

29、克隆条件：被克隆的DNA片段，同重组体的寄主细胞的DNA是同源的。且被克隆的基因具有某种特定的功能，对应于宿主细菌的该种功能缺陷。 操作：将大肠杆菌DNA的克隆片段“库”，导入一种大肠杆菌营养缺陷型的受体细胞。 筛选：然后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要的底物的基本培养基上。 cDNA基因克隆cDNA文库的构建基本步骤： 总RNA提取及mRNA的分离。 合成第一链 cDNA 合成第二链 cDNA 双链cDNA连接到载体，并导入大肠杆菌细胞（双链cDNA的克隆）双链cDNA的克隆-其他方法(1) mRNA-cDNA杂交体克隆(2) 依次连加不同接头(3) RACE random ampli

30、fication of cDNA ends基因组DNA克隆及文库构建基因组DNA克隆与cDNA克隆不同，它的出发材料是基因组DNA。由于cDNA分子比较小，可以在质粒载体上克隆。高等真核生物染色体基因组DNA的基因文库，通常是用噬菌体或柯斯质粒作载体构建的。完全的基因文库所需克隆的计算公式 n=ln(1-p)/ln(1-f) n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值用phage构建文库 1总DNA的提取 2载体臂的制备 3基因组DNA的消化 4连接/包装 5扩增和保存 6在宿主菌上形成噬菌斑 7带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定8对选出的重组phage进行噬斑纯化，再对外源DNA进行分析克隆基因的分离当把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜之后，就可以同特异性的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆1. 应用核酸探针分离