人类诱导性多能干细胞1115.docx

1、人类诱导性多能干细胞1115人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）技术指导手册目录：1. 前言iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al 2008）。2006年Yamanaka 和 Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc, 和 Klf4，Yamanaka 因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类i

2、PS细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al ;Yu et al, 2007）。 由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，自然和科学杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。随后，iPS细胞的研究日新月异。. 近几年来，iPS研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已，然而，这才刚刚开始，iPS细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题。一方面iPS产生的方法有待改进；另一方面iPS细胞的定向分化手段需继续探索。斯丹赛干细胞生物技术公司拥有

3、成熟稳定的胚胎干细胞/iPS细胞技术平台，将竭力为全国各类进行干细胞/iPS研究的科研机构、高校、相关医疗机构和制药企业等提供高品质产品和优质的服务。目前，公司提供两种人类iPS细胞系，分别由4因子和6因子所诱导，方便科研工作者做后续的研究。细胞系名称货号SiDSH-01HIPS-01SiDSH-03HIPS-03另外，对于新手提供初学者试剂盒：名称货号包装人类胚胎干细胞/iPS细胞胚胎初学者试剂盒HESM-1KT1kit小鼠胚胎干细胞/iPS细胞胚胎初学者试剂盒MESM-1KT1kit人类诱导多能干细胞产生初学者试剂盒HiPS-1KT1kit小鼠诱导多能干细胞产生初学者试剂盒MiPS-1KT

4、1kit这些产品都是经过严格的质控，为您科研的成功提供了基本的保证。2. 人类胚胎成纤维细胞培养材料：人胚肺成纤维细胞： 货号SDSC-07，SDSC-08规格1*106/支；人类胎儿包皮成纤维细胞： 货号SDSC-17，规格1*106/支；0.25%trypsin：胰酶，Sidansai，货号M-005-1，M-005-2； 含10%FBS的DMEM：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：EFM-01。实验步骤：人类成纤维细胞培养及传代方法基本与293T细胞相同。先吸弃废液，用0.25%Trypsin消化（一般T25瓶加1ml即可），放培养箱35分钟，待细胞大部分脱落时就可加含FBS

5、 的DMEM培养液终止消化，反复吹打至细胞至单细胞悬浮液即可。传代比例为1：31：5。Point此细胞系消化时间比293T细胞稍长，请不要在加入Trypsin后马上拍打使其脱落，否则会导致细胞结块，吹打不散。细胞传代比例大概为1：3-1：5，不能传得太稀，否则不易生长甚至停止生长。传代间隔时间为34天。3. 重编程载体构建用于重编程的病毒载体，其构建方法与普通载体构建的方法基本相同，一般用慢病毒、腺病毒或逆转录病毒质粒作为质粒构建的载体： 质粒名称货号iPS慢病毒载体Lenti-oct4-GFPPlvO-01Lenti-sox2-GFPPlvO-02Lenti-cMyc-GFPPlvO-03L

6、enti-klf4-GFPPlvO-04Lenti-nanog-GFPPlvO-05Lenti-lin28-GFPPlvO-06Lenti-SV40LT-GFPPlvO-07iPS腺病毒载体Ad-Oct4-GFPpAD-01Ad-Sox2-GFPpAD-02Ad-cMyc-GFPpAD-03Ad-Klf4-GFPpAD-04Ad-Nanog-GFPpAD-05Ad-Lin28-GFPpAD-06Ad-Htert-GFPpAD-074.病毒包装材料：293T细胞：Sidansai，货号Plv-C-01转染试剂Fugene：Roche，货号4709713001实验步骤1包装细胞铺板：. 传代293

7、T细胞前将T75培养瓶用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，于37C培养箱放置10min以上。. 传代293T细胞将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37C培养箱中3min，取出，轻轻摇晃可发现细胞开始脱离瓶底，待其全部脱落，加入3mL 37C水浴中预热的培养液，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准瓶口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul DMEM培养液，即

8、为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。. 铺细胞前，用明胶包被的培养瓶取出，轻晃使明胶将瓶底完全覆盖，之后吸净剩余的明胶，即可将细胞铺上。细胞数量为1000万/T75，最后加新鲜培养液至总体积为10ml。）2. 转染：第二天做转染前先观察细胞密度，80-90满即可进行转染。转染前无需换培养基。做脂转complex：Opti MEM需在37C水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染每瓶T75的complex成分如下

9、： 含cDNA的lv质粒：10ug pVSVG：5ug delta 8.91：7.5ug opti MEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入56ul Fugene转染试剂，加至opti MEM液面之下，吹打3-4次。再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。晃匀后，最好隔2-4h后再取出培养瓶晃匀一次。3收集病毒： 转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10 DMEM 培养液10mL，即开始收集病毒。分别收集转染后48-96h的病毒上清，收集后可置于4C冰箱短期保存。4病毒滴度测定：收集病毒后即可测病毒滴度（悬浮感染）： . 在

10、24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上（同步骤1，每孔加入200ul明胶）。. 消化293T细胞（步骤1.2），24孔板每孔铺被15万细胞。可将细胞做mix，体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000 polybrene（终浓度为10ug/mL），混匀，每孔加入500ul/ 15万细胞即可。. 将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。分别取2ul或者5ul病毒上清至上述步骤中的24孔板一孔中，摇匀后放入培养箱中。48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。5病毒滴度确定： . 15万293T细胞48h即可刚好长至90-100满，此时即可固定细胞，计数确定

11、病毒滴度。 . 将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于293T细胞易飘，固定及DAPI染色整个过程请务必保持293T细胞处于液面之下。用PBS涮3次。加入4 PFA室温固定30min, 24孔板每孔200ul。用PBT洗2次，每次3分钟。PBS将DAPI 1000倍稀释，每孔加入200ul，避光室温静置5min。PBS洗2次，每次5分钟，即可在荧光显微镜下计数，取2-3处取平均值。病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比加入的病毒上清体积1.51051036停止收集病毒上清，用75酒精或者巴斯消毒液处理培养瓶方可弃去。7病毒在感染目的细胞前用0.45um滤膜过滤后，预热方可

12、使用。我们提供的主要包装病毒：病毒种类携带基因货号包装慢病毒Oct4LV-011107Sox2LV-021107NanogLV-031107Lin28LV-041107c-MycLV-051107Klf4LV-061107SV40LTLV-0711074 factors mixtureLv-mix-421076 factors mixtureLv-mix-62107腺病毒Oct4AD-011108Sox2AD-021108NanogAD-031108Lin28AD-041108c-MycAD-051108Klf4AD-061108SV40LTAD-071108此外，我们还提供相关的病毒包装培训

13、，为期1周。学成后方便迅速搭建平台。5.人类iPS细胞的诱导材料：已经测定好滴度的慢病毒(以6种为例)体细胞（以人类胎儿包皮成纤维细胞为例）货号：Sidansai，SDSC-17助转剂polybrene：Sidansai，货号M-020胰酶：Sidansai，货号M-005-20.1% gelatin：明胶，Sidansai，货号M-004DMEM(含10%FBS)培养液：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：EFM-01滋养层细胞（CF-1 MEF cells）：Sidansai，货号MEF-CF1-01人类胚胎干细胞培养液：Sidansai，货号HESM-01-500人类胚胎干细胞

14、条件培养基：Sidansai，货号HESCM-01-100基质胶：Sidansai，货号M-002Point：6种病毒所含基因分别为：OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, C-MYC, KLF4;由预实验可知，慢病毒感染MRC-5 细胞的比例为10：1（即10个病毒颗粒对应一个细胞时所有的细胞均能被感染上）。病毒感染可分悬浮感染和贴壁感染两种，两种方法均可行，不影响感染效率，细胞生长不受影响，故均可用。开始病毒感染实验以前，请先准备好滋养层细胞（MEF）。病毒感染步骤：（悬浮感染方案）a. 先用0.1% gelatin预包被一个T25 瓶，包被时间约为10min。b. 待细胞生长

15、良好时，用0.25%trypsin消化，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数（具体过程见成纤维细胞培养protocol）。之后取出用于感染实验所需的细胞量（比如1105）。c. 若感染1105的细胞，以感染比例10：1计算出所需的病毒量，将所需的各个病毒量加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45um过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质，避免对后续实验的影响。d. 然后将1105的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5ul助转剂polybrene（使用浓度为10ug/ml），将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25 瓶中, 摇匀后放入37C培养箱中

16、，过夜。e. 病毒感染24小时后（第1天），将昨日感染的细胞消化下来，铺到事先准备好的MEF上。按T75瓶每瓶铺5104的细胞，铺2个T75瓶即可。f. 第2天，将DMEM培养液换成hESC培养液，继续培养。以后每2天换液一次。g. 逐日观察，待细胞长至第57天时，可见小的细胞聚集，细胞形态已经明显发生了改变，由梭形变圆形，生长聚集在一起。h. 直至第12天，由于MEF使用时间过长，故培养液换成CM(conditioned medium)+HES(hESC正常培养液)的1:1混合液, 以提供给细胞充足的营养。i. 待细胞长至第20天左右，可以挑克隆，将ES-like clone挑至新的MEF上

17、，按hESC培养方法继续培养，扩增。IPS 克隆与正常的人类胚胎干细胞在形态上基本无异。6.iPS细胞鉴定iPS细胞的鉴定主要包括以下几种：碱性磷酸酶活性检测干细胞表面marker的免疫染色检测干性因子的去甲基化分析干细胞内源基因的表达分析端粒酶活性检测核型检测拟胚体形成畸胎瘤形成实验下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤：6.1碱性磷酸酶活性检测材料 PBS buffer4% ParaformaldehydeAlkaline Phosphatase Detection Kit：Sidansai，货号AP-1kit1 x Rinse Buffer (e.g. TBST: 20mM Tris-

18、HCl, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05% Tween-20) 碱性磷酸酶染色步骤：a.Aspirate media and fix ES or iPS cells with a fixative (e.g. 4% Paraformaldehyde in PBS) for 1-2 minutes. Note: Do not overfix. Fixing cells longer than 2 minutes will result in the inactivation of alkaline phosphatase. b.Aspirate fixative and rin

19、se with PBS buffer.c.Aspirate and rinse with 1 X Rinse Buffer. DO NOT allow wells to dry. d.Prepare reagents for Alkaline Phosphatase staining (BufferA: BufferB: BufferC=100:38:28)e.Add enough stain solution to cover each well (e.g. 0.5mL for a well of a 24-well plate). Incubate in dark at room temp

20、erature for 15 minutes. f.Aspirate staining solution and rinse wells with 1 X Rinse Buffer. Cover cells with 1 X PBS to prevent drying and then count the number of colonies expressing AP (red stem cell colonies), versus the number of differentiated colonies (colorless). 6.2. 干细胞表面marker的免疫染色检测可用的试剂盒

21、包括：货号包装所鉴定的抗体A-P1-1KT10testOct4，Sox2，Nanog，SSEA4，Tra-1-60，Tra-1-81A-P2-1KT10testOct4，Sox2，Nanog，SSEA1，SSEA3，SSEA4，Tra-1-60，Tra-1-81A-P3-1KT10testOct4，Nanog，Sox2，SSEA1表达于人类ES/iPS细胞中的标志物包括：Stage-specific embryonic antigen-3(SSEA3)Stage-specific embryonic antigen-4(SSEA4)Tumor-related antigen-1-60(TRA-

22、1-60)Tumor-related antigen-1-81(TRA-1-81)OCT4SOX2Nanog表达于小鼠ES/iPS细胞中的标志物包括：Stage specific embryonic antigen-1(SSEA-1)OCT4SOX2Nanog免疫染色步骤：1. 首先把细胞固定在4多聚甲醛（4PFA）中，室温放置30min;2. 在无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）注意：此步骤仅限于核蛋白，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白如SSEA 和Tra等3. 将上述溶液吸干，先用1X PBS洗涤一次，再用抗体稀释液（0.2%BSA和0.1%Tr

23、itonX100溶于PBS）洗涤两次；4. （此步骤可不操作，进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应）用封闭液（含1%BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的PBS溶液）封闭细胞；5. 将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4度放置过夜；6. 用PBT（0.1%TritonX100）洗涤细胞35次；7. 将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1h; 注意：从步骤7开始，样品要注意避光！8. 用PBT洗涤3次；9. 将DAPI (1mg/ml in PBS)母液以1:1000 用PBS稀释, 室温放置5min;OR: 将JASMIN（hoche

24、st）母液以1:1000用PBS稀释，室温放置5min;10. 用PBS洗涤5min,两次；11. 再用4多聚甲醛室温固定30min；12. 最后再用PBS洗涤两次，每次5min.6.3干性因子的去甲基化程度分析Bisulphite Squencing 法分析甲基化状态（一）Bisulphite 处理基因组DNA1、将基因组DNA置于冰上，液体石蜡冰上预冷。2、给每个样品准备6个Ep管，每管加300ul液体石蜡。3、准备样品：1）每个样品取210ng的DNA，稀释到21ul。2）新配2M的NaOH（用超纯水配，1.6g NaOH/20ml水），每管样品中加4ul（使之终浓度为0.3M）NaOH

25、。3）50，15min。4、准备2 低熔点argrose：0.02g/ml，用双蒸水配。100 5min，之后置于50待用。5、向3中的DNA液中加入50ul 2 低熔点argrose，混匀（保持50）。6、吸取上述argose和DNA混合液，加10ul/管 于第二步预冷的矿物油中。冰上至少30min，使beads坚硬。7、向beads中加入500ul 2.5M Sodium metabisulphite （新配），摇匀，使beads位于分层上。离心甩一下。8、50避光反应4h12h，不超过16h18h（一般12h）。 附：Sodium metabisulphite的配制 总体积：20ml I

26、. Hydroquinone 220mg H2O 2ml 50避光溶解（黄红色） II. Sodium bisulphate 7.6g H2O 8ml 2M NaOH 5ml 50避光溶解，每隔10min晃一次，溶30minI，II分别配好后，在暗处混合，混合后颜色变浅，降为室温即可使用。终止反应，洗脱：1、1ml TE ph8.0洗3次，10min/次。2、0.5ml 0.2M NaOH 洗2次，每次15min（时间不可缩短）。3、1ml TE ph8.0洗3次，10min/次。4、每管beads加100ul TE，4保存。（二）Bisulphite PCR方式：巢式PCR引物：2对第一轮

27、outside-forward，outside-reverse； 第二轮 inside-forward，inside-reverse体系：1st round(25 l)ddH2O 8.310buffer 2.5Primers(10M) * 2.0 *outside-F+RdNTP(10mM) 2.0rTaq 0.2template(beads) 10.094 5min94 30s5560 * 45s *退火温度根据引物设定72 50s72 7min2nd round(50l)ddH2O 35.510buffer 5.0Primers(10M) * 4.0 * inside-F+RdNTP(10

28、mM) 4.0rTaq 0.5template 1.094 5min94 30s5560 * 45s *退火温度根据引物设定72 50s72 7min注意事项：1、第一轮的模板为beads，吸出的时候要小心，防止滑落或者弄碎。在其他都加好之后再加beads。2、第二轮的模板是第一轮反应的产物，为胶状，加入之前应在55度化开。（三）纯化PCR产物 (参见相关Kit说明书)（四）连接至T-vector体系：基本按照T-vector说明书，Solution I的体积应占总体积的一半，T-vector每个反应0.5ul。比如，PCR产物浓度高时可用以下体系（PCR产物浓度较低时适当增加体积）：Inse

29、rt （纯化好的PCR产物） 3 ulT-vector 0.5 ulSolution I 3.5 ul16连接过夜，第二天转化。最后挑克隆，抽质粒并且送测序即可。6.4干细胞内源基因的表达分析实时定量PCR检测内外源基因的表达6.4.1抽提RNA1.将培养板每孔上清吸掉，用移液管加500l TRIZOL反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，收集到1.5ml离心管中（也可将细胞收集在离心管中后再用TRIZOL裂解）。2.每500l TRIZOL 加0.1 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用力摇晃试管15 秒并将其在室温孵育2-3 分钟。在2-8 下12,000g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后

30、混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的50%。3.将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每500llTRIZOL 对应0.25ml 异丙醇。将混合的样品在 15-30 条件下孵育10 分钟并在2-8 下12,000g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。4.移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次，每500l 的TRIZOL加0.5 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2-8 下以7,500g的离心力高速冷冻离心5 分钟。5.在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。取DEPC水来溶解RNA，并在55-60