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1、茶多酚抗氧化机理研究现状胡秀芳分解 原稿收到日期: 1999)03)10 修改稿收到日期: 1999)09)03作者简介:胡秀芳(1971),女,湖北阳新人,现在浙江大学茶学系攻读博士学位,主要从事茶叶生与综合利用方面的研究。文章编号: 1000)369X (1999) 02)0093)11茶多酚抗氧化机理研究现状胡秀芳 沈生荣 朴宰日 杨贤强(浙江大学茶学系杭州310029)摘要 茶多酚是茶叶中的一种主要活性成份,有着独特的抗氧化效果。其抗氧化机理表现在6个方面:作用于自由基有关的酶,直接作用于自由基,络合金属离子,再生体内高效抗氧化剂,与其他成份协同增效和调节机体免疫力。文中对此进行了综述

2、。关键词:茶多酚 抗氧化 机理中图分类号: TS20213 文献标志码: AReview on Antioxidative Mechanism of Tea PolyphenolsHu Xiufang, Shen Shengrong, Jae-il Park, Yang XianqiangDepartment ofTea Sciene, Zhejiang University,Hangzhou 310029Abstract Tea polyphenols (TP) are the key active components of tea with high antioxidative acti

3、vity. The mechanicsexpressed in six ways: adjusting the enzyme activities related to free radicals, scavenging free radicals, chelatingmetal ion,regenerating the antioxidant in organism, synergistic action with other components and improving organic immunity.Key words:Tea polyphenols Antioxidation M

4、echanism茶多酚是茶叶的一种活性成分,其组成除酚酸外,主要是以A-苯基苯并吡喃为结构基础的类黄酮化合物,其中羟基取代基作为质子的供体1,使其具有特殊的生理功能,主要表现在抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗菌等方面2。研究表明3,茶多酚的这些功能与其清除自由基的抗氧化效果密切相关。体内、外试验表明茶多酚是一种强抗氧化剂。茶多酚对食用油脂的抗氧化能力为维生素E、BHT、BHA的39倍4。奥田拓男5以大白鼠肝线粒体和微粒体模拟体内脂质过氧化试验,结果EGCG的抑制效果比维生素C和维生素E高18倍和16倍。可见,茶多酚的抗氧化作用比维生素C和维生素E强。茶多酚抗氧化作用的机理,国内外都有研究。总体上讲,

5、氧化和络合是抗氧化的两个主要要素,这两个要素发挥抗氧化作用的途径归纳起来有如下6个方面:茶 叶 科 学 1999,19(2): 93)103Journal ofTea Science1 茶多酚作用于与自由基有关的酶已经知道,生物体内自由基处于生物生成体系与生物防护体系的平衡之中,该两大体系均可由酶调控6。用重金属Cd饲喂小鼠若干天后,检查鼠肝发现,同时喂绿茶组的肝中自由基生成酶)黄嘌呤氧化酶活性下降,而自由基清除酶)SOD、GSH-Px、过氧化物酶和GSH-S-转移酶活性提高,认为茶多酚可通过强化抗氧化解毒系统的作用,清除用Cd处理大鼠肝中的Cd和减轻过氧化损伤7。这就是茶多酚调节生物体内自

6、由基平衡的结果。1.1 抑制氧化酶系生物体内许多氧化酶与自由基生成有关。黄嘌呤氧化酶系(XO):缺血时, ATP逐步降解为ADP、AMP、腺苷,最后形成次黄嘌呤;另外,在Ca2+依赖性蛋白酶作用下黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶,进而形成尿酸和O#28。ESR技术观测表明,缺血再灌注的最初数秒钟内,自由基爆发性增强可能就是由这一途径产生的9。其次, P-450酶系、髓过氧化物酶、脂氧化酶和环氧酶均可催化体内自由基的生成10。已有实验证明:茶多酚对上述各种氧化酶均有抑制作用。Cho Y. J.等11发现韩国绿茶的丙酮提取液能抑制黄嘌呤氧化酶活性,其中酯型儿茶素比简单儿茶素对XO有更强的抑制活性。茶

7、多酚对细胞色素P-450的抑制作用研究较多。人工诱变致癌的研究表明12:茶多酚可抑制肿瘤细胞中NADPH-细胞色素还原酶及细胞色素P-450活化系统的活性。茶多酚及其单体)EC、EGC、ECG、EGCG对动物肝脏的P-450酶系活性有抑制作用,这种抑制作用被发现是茶多酚及其衍生物与肝脏细胞色素P-450反应,并抑制了皮肤和肝脏中与P-450依存的混合功能氧化酶类的结果13。进一步的实验证明了这一观点:将上述单体加入到用苯巴比妥酸处理大鼠的肝微粒,导致了光谱学变化)最大吸收波长在400 nm,最小吸收在380 nm,这是典型的模式结合(反模式?)14。可见茶多酚对P-450酶具有显著的抑制作用。

8、Wang Z. Y.等14研究发现,儿茶素单体(EC、EGC和EGCG)对P-450及相关的芳烃基氧化酶、香兰素去乙基酶和吩哦唑脱乙基酶有抑制作用,从而有效地减低体内芳烃自由基浓度。TPA (12-o-tetrade-canoylphorobo-l 13-acate)对老鼠耳皮肤诱导的中性细胞的浸润过程中产生一种天然发生的组分)髓过氧化物酶,在TPA对小鼠耳皮肤点施前用TP处理可以使组织中髓过氧化物酶活性明显降低15。茶多酚对体内、外脂氧化酶和环氧酶的抑制作用均较明显16,17。Jiro Sekiya等18对这种抑制机理在体外用大豆脂化酶与ECG、EGCG的作用过程进行了探讨,认为ECG和EG

9、CG对脂质过氧化酶的络合沉淀作用是主要的机制。多酚类沉淀酶的能力以它与被沉淀的酶的重量比表示,比值与沉淀能力成反比。在pH47范围内,使50%的脂氧化酶沉淀的EGCG/LOX (重量比)值为5,远远高于高分子单宁)gelatinpersimmontannis和B-glucosidase-chinese sumac的相应值,分别为013016和011。沉淀后的酶活性下降10%30%,用聚乙烯吡咯烷酮和吐温20透析解吸后酶的稳定性低于初始酶活,说明EGCG和ECG改变了该酶的性质。EGCG还可沉淀酵母细胞的醇脱氢酶。其他试验也证明了茶多酚能抑制脂肪氧化酶, 510-5mol/L茶多酚即可 使酶活性

10、完全丧失19。茶多酚对这些氧化酶系的抑制作用可以预防病理条件下自由基的爆发性发生。94 茶 叶 科 学19卷 112 对抗氧化酶系的激活作用生物体抗氧化酶系主要有超氧化歧化酶(SOD)、谷胱甘肽酶(GSH )和过氧化酶(CAT),它们对自由基有着高效清除作用:O#2+ O#2+2H+SODH2O2+O2CAT-Fe3+H2O2化合物物?+H2O2CAT-Fe3+2H2O+O2H2O2+SCN-乳过氧化物酶OCN-+H2OROOH (HOOH) +2GSHSe-GSH-PxROH (HOH) +H2O+GSSGGSSG+NADPH+H+GSSG-Tr2GSH + NADPH+这些酶不但协同地防止

11、活性氧的损伤效应,而且相互间还起着保护作用10: O#2能灭活CAT和GSH-Px, SOD对O#2的清除就保护了CAT和GSH-Px; H2O2能灭活Cu-Zn-SOD,CAT和GSH-Px对H2O2的清除就可以保护Cu-Zn-SOD。一旦这种相互保护系统中某一成员减弱或减少,整个酶性保护系统可能全面崩溃,导致不可逆性细胞损伤。因此异常生理条件下,外源抗氧化剂的防护作用就显得至关重要。杨贤强等20在沙土鼠脑缺血再灌流实验中,观察到TP可以防止SOD活性的显著下降和MDA含量的明显上升。提前60 min用TP处理,可使沙土鼠脑缺血30 min再灌流15min的脑内SOD活性升高54102%(P

12、<01001), MDA含量下降21180%(P <01001)。抗衰老试验表明: TP能增强血和肝GSH-Px活性(P <0101)及SOD活性(P<0105),降低过氧化脂质在肝和血清中含量(P <0101),并抑制脂褐素形成(P <0101)21。TP不仅能防护体内抗氧化酶,还能促进和调动机体内抗氧化酶活性。0105%TP饲喂小鼠15天,可明显降低老、青年小鼠血清MDA含量(P<0101),提高青、老年小鼠红细胞SOD活性(P <0105)和老年小鼠CAT活性(P <0105)22。对5 6周龄SKH-?雌性无毛小鼠喂012% TP3

13、0天,可使动物小肠、肝、肺中GSH-Px接触酶和醌还原酶活性明显增强,小肠和肝中GSH-Tr和肝中GSH-还原酶也有一定提高,肺和小肠中抗氧化和阶段酶类活性比肝脏和皮肤中提高得快23。组织培养实验也证明, TP能促进抗氧化酶活性。茶液培养细胞能经常维持较高水平的过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化酶活性24。临床试验进一步证明了TP对抗氧化酶的作用。测定55例口服茶多酚2个月的中老年患者红细胞SOD、LPO水平,发现LPO降低, SOD活性升高,服药前后SOD/LPO比值上升25。可见, TP具有抗氧化及激活人体内抗氧化酶系能力。TP对抗氧化酶的防护作用主要表现在三个方面: a) TP有效清除自由基,防

14、止自由基对抗氧化酶的灭活,从而防护生物体内生物酶系,保护其整体功能的正常发挥10。b) TP能够防止巯基的氧化,故能保护含-SH的酶如谷胱甘肽酶26。c) TP对抗氧化酶合成的调节,这方面尚无直接的证据,但已知道五味子能够诱导体内抗氧化酶的合成27。TP对于酶的诱导 合成是值得研究的一个方向。2 茶多酚直接作用于自由基试验表明:茶多酚与自由基反应生成较95 2期胡秀芳等:茶多酚抗氧化机理研究现状 为稳定的酚氧自由基,因而能够灭活自由基28。生物体内自由基有两种类型:无机自由基和有机自由基。无机自由基主要指O#2、#OH、1O2和H2O2等活性氧;有机自由基包括多元不饱和脂肪酸的氧化产物ROO#

15、、RO#等。茶多酚通过对这两种自由基的清除而起着不同的抗氧化效果)预防性抗氧化和链阻断式抗氧化。浙江大学茶学系与中科院生物物理研究所经多年的研究,基本弄清了茶多酚清除自由基的特性。211 清除无机自由基人多形白细胞(PMN)在促癌剂PMA刺激下可发生呼吸爆发而产生大量的O#2和#OH,TP对该体系有显著的清除效果,且TP对活性氧自由基的综合清除效果呈剂量效应关系29。但TP清除由PMN刺激产生的活性氧自由基的作用比清除由光照核黄素体系产生的自由基的作用要强,说明TP对O#2和#OH的不同效果。不同的模型试验证明了这点。应用X/XO-lumino反应系统,以化学发光法研究TP对O#2清除作用,表

16、明TP在01013 01375Lg/ml浓度范围内表现很强的清除O#2的作用,且呈高度的量效关系,50%的抑制浓度为0104Lg/ml30。采用电子顺磁共振、化学发光和分光法检测的不同体系中TP清除O#2的能力均大于90%31。比较茶多酚复合体和EGCG单体清除O#2效率,发现两者效果相近,但均强于维生素C和维生素E。用Fenton反应体系研究TP对#OH的清除效果32,结果表明在最适浓度(010430110 mg/ml)范围内清除率达到99%,但一般情况下只有4%20%。分析这种现象的原因,可能是#OH是一种活性很强的非特异性自由基,儿茶素与羟自由基的反应速度是很快的,而且受扩散所控制33,

17、很低浓度的TP就可以较为完全地清除#OH,超过上述浓度, TP可能起着助氧化的作用而抵消TP对#OH的清除作用34。TP清除1O2的效果见表135。从表中可以看出, TP单体清除1O2的反应速度较快。据清除动力学研究结果,每分子非没食子儿茶素可清除2分子自由基,每分子酯型表1 茶多酚对1O2的清除速率Table 1 Scavenging rate of tea polyphenots on 1O2样品 K(1O2+Phe-OH) (mol/L#s)-1样品 K(1O2+Phe-OH) (mol/L#s)-1C 111108ECG 212108EC 916107EGCG 212108EGC 11

18、1108儿茶素可清除6分子自由基36。因此酯型儿茶素即EGCG具有最强的清除自由基的活力。但是茶多酚复合体有着与酯型没食子儿茶素相似的清除能力,这与复合体组成成分间自由基顺序修复协同效应有关。沈生荣等37试验证明:复合体比单体有更好的清除效果。因为复合体中含有电位不同的多种物质。伏安法测定儿茶素 第一还原电位次序如下: EGCGUTP>ECG>ECUEGC.儿茶素间依第一还原电位递降构成循96 茶 叶 科 学19卷 环,起顺序自由基修复作用:上图中以电位较接近的组合增效效果明显,表明协同增效作用与儿茶素的组成及比例有关。茶叶中天然的儿茶素组成比例具有最好的协同效果。212 清除脂自

19、由基脂质在活性氧或辐射条件下产生自由基,引发脂质自由基链式反应38:TP可以与脂质链式氧化中间产物)脂自由基或脂氧自由基反应终止链反应而抑制脂质氧化:TP+L.TP.+LHTP+LO.TP.+LOHTP+LOO.TP.+LOOH许多体内外试验均证明TP对脂质链式氧化具阻断作用。从70年代起,国内外就对茶多酚对油脂(花生油、亚麻油、亚油酸、玉米油、棕榈油、豆油、猪油、鸡油、鱼油和氢化脂肪)进行研究,这些结果都证明TP对抑制氧化的高效性39。添加量相同时, TP对茶油的抗氧化作用为BHA的216倍,维生素E的312倍; TP对猪油为BHA的214倍,维生素E的916倍; EGCG对亚油酸的抗氧化作

20、用为维生素E的319倍。模拟体内试验也表明, TP对脂质氧化抑制有显著效果。如TP和EGCG对由香烟气相物质诱发的大鼠细胞的脂质过氧化有很强的抑制作用40。香烟气相中含活泼烷基、烷氧自由基及NO、NO2等氧化物质使鼠肺细胞表层流动性增大。预先在鼠肺细胞中加入粗晶态和粉末态TP,鼠肺细胞膜因氧化而导致的流动性增大被抑制,表明TP可以抑制肺细胞膜因自由基诱发的氧化。ESR试验进一步证明41: EGCG对过氧化心肌线粒体产生的脂类自由基有明显的清除作用,并呈量效关系。此外, TP对致癌物质多环芳香烃自由基的清除效应比BHT要强。当然, TP对脂质过氧化的抑制作用也包括对无机自由基的清除。首先, TP

21、参与起始反应,有效地清除O#2等活性氧,预防脂质过氧化的启动;其次,与脂质过氧化的脂自由基反应,产生断链作用。这两种作用相结合,使TP表现显著的抗脂质氧化功能。氧自由基引起的膜脂质氧化在组织缺血、缺氧、再灌注损伤、炎症和休克等病理过程的细胞损伤中具重要发病意义。清除自由基抗脂质氧化是防治上述病理过程的重要细胞保护措施42。3 茶多酚与诱导氧化的过渡金属离子络合TP由于多酚结构,具有较强的络合金属离子的性能。萧伟祥等研究了茶黄色素(TYP,主要成分是黄酮类化合物及少量儿茶素氧化聚合物)对金属离子的作用43。用1ml 011%TYP水溶液,加入10 ml 50010-6金属离子,发现TYP遇Zn2

22、+, Cu2+,Mg2+, Co2+, Mn3+等不产生沉淀,对颜色无影响, TYP遇Ca2+产生白色沉淀,遇Pb2+产生黄色沉淀,遇Fe3+和Fe2+产生黑褐色和暗褐色沉淀,但TYP遇Al3+时溶液变得黄亮鲜艳, 可见TYP对Ca2+和Fe离子的络合性较强,而对Cu2+的络合性较弱。郭炳莹等研究结果也证明茶多酚可以络合Ca2+、Cu2+、Fe3+及Fe2+等10种金属离子44。97 2期胡秀芳等:茶多酚抗氧化机理研究现状 311 对Fe离子的络合及其抗氧化效果Fe在机体中有着相当重要的作用。它在氧应激中的作用主要表现在10:a)催化巯基化合物、肾上腺素的自氧化作用,促使O#2, H2O2的生

23、成。2GSH+2O2FeGSSG+2O#2+2H+b)催化Haber-Weiss反应生成毒性更大的#OHO#2+H2O2Feton#OH+OH-+O2c)与O#2作用生成很高活性的高Fe酰(FeO2+2)和铁酰(FeO2+)自由基复合物Fe3+O#2Fe3+O#2Fe2+O2Fe2+O2Fe2+2Fe2+O (FeO2+)d)催化脂过氧化物均裂产生ROO#和RO#2ROOHFeROO#+RO#+H2OROO1和RO1可引发新的脂质过氧化链式反应,分解代谢产生具毒性的醛等。可见Fe能催化自由基的产生。研究表明EGC、EGCG、ECG和EC与Fe (III)的络合比分别为3B2、2B1、2B1和3

24、B145。体内外试验均证明TP能有效络合Fe而减轻自由基损伤。与绿茶和红茶比较,乌龙茶提取液对Fe离子的络合性最强,其抗氧化活性也最强46。单独(4 mg/l)或与谷物(4 mg/l)一起将茶浸出物喂小鼠, Fe吸收降低0%45%,进一步分析表明:红茶和绿茶含有可与Fe键结合并能增强或阻碍通过600800分子透析膜的物质。TP使大白鼠体内血清蛋白中血清蛋白铁及全血铁明显降低,显著抑制心脏和肝脏脂质过氧化47。随着TP服用量增大,兔全血铁及血清铁量下降,但服用量对血清铁蛋白含量无明显影响。另有试验表明,茶提取物通过抑制与衰老有关的铁的吸收,使果蝇寿命延长2114%48。儿茶素可防止铁对红细胞的损

25、伤,但儿茶素对铁存在下自由基损伤红细胞的保护作用存在阈值。不同儿茶素单体阈值不一致,其中EGCG为0102 mmol/L, ECG为01025mmol/L, EGC为01028 mmol/L, EC为0105mmol/L49。儿茶素主要是络合游离的过量Fe,这对于铁过载引起的贫血(地中海贫血)无疑是好的,但儿茶素不会争夺铁蛋白等络合态Fe,故不会使生物体造成缺Fe性贫血50。312 对Cu2+的络合及其抗氧化效果TP对Cu2+具有一定的络合作用,故可抑制由Cu2+催化的低密度脂蛋白(LDL)的氧化51。TP对Cu2+的弱络合性,又可保证一定浓度范围TP不致影响以Cu2+为中心的SOD酶活性。因

26、此, TP既可防止氧化,又能保护SOD氧化活性而间接地有益于抗氧化作用。313 对Ca2+的络合及其抗氧化效果TP是Ca2+的较强络合剂,而Ca是钙调蛋白和蛋白激酶的组分。脑组织缺氧时,线粒体细胞色素氧化酶受损,导致ATP减少,使细胞不能维持跨膜离子梯度,细胞内Ca2+含量升高,激活了能促进黄嘌呤脱氢酶转变成氧化酶的蛋白酶。TP通过络合细胞内Ca2+,降 低Ca2+而抑制黄嘌呤氧化酶的生成,起到抗氧化作用52。另外, TP对Ca2+的络合是否可以诱导或调控与氧化有关的酶类尚未见报道,但已经知道茶多酚能提高ATP酶活性16%30%53。4 茶多酚再生体内高效抗氧化剂在生物体内的抗氧化系统中,有一

27、类抗氧化剂)维生素C、维生素E和GSH,它们分别位于细胞间质、细胞膜和细胞内,充当细胞的第一道、第二道和第三道抗氧化98 茶 叶 科 学19卷 防线,组成一个防护体系,共同维护着细胞的正常功能10。维生素C、维生素E和GSH在体内起着重要的抗氧化作用。它们都能有效地清除O#2, H2O2和1O2。维生素E更重要的是充当生物膜表面的脂质过氧化的阻断剂。但抗氧化剂更重要的是在于它们之间的相互作用)协同作用、互补作用、代偿作用等,彼此保护,共同维护和增强细胞的抗氧化系统。许多研究表明TP对三种抗氧化剂均有保护或再生作用,因而能够保护和修复细胞的抗氧化系统。411 再生A-生育酚及其抗氧化给予高脂肪食

28、物(30%棕榈油)后,白鼠血液中A-生育酚含量显著下降,而添加儿茶素(1%粗儿茶素)后,A-生育酚减少得到了抑制54。在亚油酸反应体系中,发现A-生育酚随时间变化成线性衰变,完全符合抗氧化动力学要求,衰变速率为61410-9moldm-3s-1。当EGCG存在时,A-生育酚初期衰变几乎完全被抑制,其速率为11110-9moldm-3s-1。当大部分EGCG被消耗时,衰变速率适度增加(51510-9moldm-3s-1),但仍然低于没有EGCG存在时的水平。另一方面, EGCG衰变呈指数,且不受A-生育酚共存的影响,进一步分析认为在EGCG和其他茶多酚存在时,A-生育酚修复反应是最主要的反应。A

29、-生育酚(TocH)与茶多酚抗氧化协同作用可表示为:通过这种协同修复作用可以保持较高的维生素E含量55。412 再生维生素C及其抗氧化动物和人体实验均证明TP可以使机体保持较高维生素C含量56。1959年,Erofeeva N1N.和Shamrai E. F.等分别在豚鼠上证明维生素P或从果子提取的多酚类物质都有显著增加动物肝、肾、脾等组织中维生素C含量的作用。王氏介绍以1 mg茶叶单宁(茶多酚的旧称)喂给每天吃维生素C10 mg的大白鼠45天,使其多种内脏和肌肉中维生素含量比基饲料对照组高数倍,比单给维生素组高一倍左右,可见儿茶素可以维持动物体内维生素C的高含量57。吴瑞荣等58研究表明茶叶单宁对人体利用维生素有相似作用。每日给150 mg茶叶单宁,可使人体作饱和维生素C实验过程中,尿中排出的维生素C显著下降。对负荷维生素C人体饮用乌龙茶,能保持全血总维生素C浓度不下降,同时减少尿中总维生素C排出量;当停止饮茶后,尿维生素C排 出量很快上升。人体实验,一天二次饮用维生素C +茶,发现体血液中维生素C含量升高,而尿中维生素C含量下降,认为喝茶能滞留人体内维生素C。Stag