免疫组化染色技术.docx

1、免疫组化染色技术分享免疫组织化学染色技术法医学院 官大威第一节常规组织学染色技术概述宏观微观超微结构基因水平组织形态学研究技术的种类：一、病理大体组织标本的染色方法在标本制作中，为了某种特殊目的， 突出显示标本的重要部分， 借助组织切片的特殊染色方 法对标本进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不同的颜色， 以便于区分大体标本的不同成分和病变特点，如：.脂肪组织染色旷目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色 试剂：苏丹川或苏丹W结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 早期心肌梗死染色法 目的：显示早期心肌梗死的区域试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝)/ 0.2 mol / L

2、PBS(pH 7.6)方法：将2-3 mm厚新鲜心肌大片放入试剂中， 37 C孵育20 min。结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。注意：新鲜标本，尸检心肌不超过 6小时。、光学显微镜下的组织学染色方法.常规 HE 染色(hematoxylin and eosin staining ).组织学特殊染色1.Mallory 三染色、Masson三染色2.神经纤维的镀银染色3.DNA和RNA的染色等其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞 上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。三、超微结构的观察.光线波长的限制，光学显微镜

3、的分辨率极限为 0.2卩m有效放大倍数最高不超过 2000倍。电镜的分辨率最佳可达 0.14 nm,放大倍率最高可达 100万倍。第二节免疫组织化学染色技术 Immu nohistochemical tech nique由于该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分， 因此现又称为免疫细胞化学技术。根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为:1.免疫荧光细胞化学技术2.免疫酶细胞化学技术3.免疫铁蛋白技术4.免疫金-银细胞化学技术5.免疫电子显微镜技术一、免疫组织化学染色方法的原理.抗原（antigen）1.定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能

4、与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。 抗原具有两种性能：（1） 免疫原性（immunogenicity ）指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。（2） 反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗体或效应 T细胞等免疫应答产物发生特异 性反应的特性。2.抗原的分类完全抗原、半抗原免疫学分类胸腺依赖抗原与非依赖抗原外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等临床分类同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原.抗体（antibody）1.定义：机体受到抗原刺激后，通过体液

5、免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。大部分抗体电泳后位于丫区带， 1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白 （immunoglobin , Ig）。2.抗体的种类：五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM免疫组织化学染色技术中， 使用的抗体主要是IgG，个别情况下使用IgG的亚型，多为lgG1。免疫组织化学染色的反应原理及显色原理1.免疫组织化学染色的反应原理.染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂

6、或使用某 种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检 测的抗原是否存在。.通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存 在与否。2.免疫组织化学染色的显色原理(1)基本原理荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用最为广泛。n直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或细胞中抗原 反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。n间接法：是将酶标记在第二抗体上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。.间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体，多数抗体是由家兔制备

7、的多克隆抗体，单克隆抗体是由小鼠制备的。.第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第一抗体均来自同一种属动物，同标记的第 二抗体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。 这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。.通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。(2 )显色的基本程序1抗孵育切片或细胞涂片 2抗(酶标抗体)孵育切片发色剂显色(核 复染)(3)酶标抗体法的显色原理及显色剂.辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)HRP + H2O2 HRP H2O2HRP H2O2+ DH2HRP +

8、 D + 2H2OHRP 催化的酶促反应第一步 是特异的，其余反应是非特异的，因此， 可选用各种供氢体作为显色剂，可使反应的终产物呈现不同的颜色，如：CN (4-chloro-1-naphthol )为蓝色TMB (tetramethyl-benzidine )为深蓝色AEC (3-amino-9-ethyl-carbazole )为红色DAB (3, 3-diamino benzidine )为棕色碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是以 AS-Mx 为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发 色剂，生成蓝色/红色不容性沉淀物。.ALP标记的

9、抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的 ICC染色。.由于组织细胞内含有内源性 ALP，在显色液中需加入终浓度为 2-4mol/L的左旋咪唑(levamisole)，大多数内源性 ALP活性可被抑制。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD )是以葡萄糖为底物的酶， 其显色方法为B -D-葡萄糖 67mg、NBT 6.7mg、PMS (phenazinemethyl-sulfate ) 0.167mg、0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml , 37oC孵育1小时，生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片可经脱水、透明后封片，长期

10、保存。(4)核复染在显色后，特别是用 DAB显色后，切片可用苏木素染料进行核复染，经水化后细胞核显示 蓝色，与胞质中的 DAB棕色形成对比。但用 AEC显色后不能用苏木素做核复染，因为配制苏木素染料中使用酒精作为介质， 可使AEC的红色终产物褪色，且AEC显色后只能用水溶性封固剂封片。第三节免疫组织化学染色步骤(一) ABC或SP法进行石蜡切片染色的主要步骤1.组织材料的采取；2.组织块的固定；3.组织块的脱水、透明及石蜡包埋；4.石蜡切片的制备；5.石蜡切片的脱蜡及水化；6.抑制内源性过氧化物酶活性；7.PBS洗涤切片；8.抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原；9.PBS洗涤切片；10.

11、用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清 (或同时加入BSA)孵育切片，防止抗体的非特异性吸附；11.用特异性一抗(单克隆、多克隆)孵育切片；12.PBS(可加入 Tween 20#, PBST)洗涤切片；13.用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片；14.用PBS或PBST洗涤切片；15.滴加SP试剂或ABC试剂；16.PBS或PBST洗涤切片；17.DAB 或 AEC 显色；18.自来水洗涤切片，终止显色;19.用苏木素做核复染；20.切片脱水、透明，树胶封片。（二）各染色步骤的具体操作及注意事项1.组织材料的采取 活检组织组织标本手术切除标本尸检标本实验组织或培养细胞 活检组织：宫颈、鼻咽、口腔

12、、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织体积小，因活检钳直接钳取， 常受压过度而变性， 因此，活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采取主要的病灶区。.抗原在组织中的分布不均一，故病灶较大的切除标本应考虑切取主要病灶。病灶与正常组 织交界区及远距病灶的正常区。.尸检组织由于取材时一般均已超过死亡后 2小时以上，组织有不同程度自溶， 其抗原或变性消失或有 严重的弥散现象。 法医尸检一般多在 24小时以上，甚至数月后，检材受死后变化影响严重, 而影响染色结果。手术切除的组织较新鲜，取材后应立即固定，以保存组织结构和抗原。.实验动物标本新鲜，可按需要取材，特别是很多情况下是在灌流固定后取材，组织结构和抗原

13、保持良好， 非常适用于免疫组织化学染色。.取材标本的大小尸检组织材料大小以 1cm x 1cm x 0.2cm为宜。实验动物常用大鼠或小鼠，其脏器体积小， 有利于取材。一般标本体积不宜过大，防止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。2.组织块的固定、水洗（1）固定液：种类较多，常用的有以下几种：.4% 甲醛 /PBS （pH 7.2-7.4）配制方法：10 ml 40% 甲醛（formalin） + 90ml PBS 使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀（多聚甲醛）,还可形成甲酸，影响染色结果。 4% 多聚甲醛 /PBS （pH 7.2-7.4）配制方法：40g 多聚甲醛（parafor

14、maldehyde）+500 ml 0.1 mol/L PB （pH 7.2-7.4）,搅拌、加热至 60 oC,同时滴入1N NaOH 至溶液完全透明。冷却后用 1N HCl调PH值至7.2-7.4，再用 0.1mol/L PB 将溶液加至 1000ml。.固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定 2-24小时。.固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。甲醛与蛋白质中的许多氨基酸 反应，并能保存脂类和类脂体。.不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的抗原决定簇被封闭，影响抗原抗 体的结合。（2）水洗.冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定时间长短有关。尸检组织和大动物

15、组织一般 冲洗24小时，小动物组织冲洗 2-10小时。新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短，固 定时间长的标本，冲洗时间也需延长。冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并扎紧， 防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一端接自来水，一端插入瓶底，使水缓慢流出，或将 组织块放入洗涤筐中，放在水盆内冲洗。对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水浸 泡即可。3.组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋（1） 脱水脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常用酒精。酒精可以与水以任何比例混合，脱水 能力强，并可硬化组织。 酒精对组织的穿透速度很快，对组织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩，应从低浓度开始，然后再依

16、次增加其浓度。在常温下或 4oC下进行，以减少抗原的损失。70% 80% 90% 95% 100% 100%（2） 透明.为使石蜡能浸入组织块，组织经脱水后，必须经过一种既能与酒精形容，又能溶解与石蜡 的溶剂。通过溶剂的媒介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。.透明剂：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用二甲苯。.一般经过2-3次纯二甲苯溶液透明，每次 10-15分钟，同时也应根据组织的种类和组织块大小以及二甲苯的新鲜程度加以调整，不应机械照搬。（3） 浸蜡 组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡浸渍。用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温蜡，在

17、 60 oC以下浸透。(4)包埋浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡到入包埋盒，冷却后取出，修块。4.石蜡切片的制作(1)载玻片涂片的制作防脱片剂：APES ( 3-aminopropyltriethoxy silane )、多聚赖氨酸(Poly-L-lysine )、甲醛-甘 油明胶。APES涂片的制作原理：APES是一种新型玻片粘附剂，与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修 饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，不易脱落，保留时 间较久。具体操作方法：将载玻片用酸处理后，用 95%酒精浸泡，再用绸布擦干，清除表面的污渍；将干净的载玻片放入丙酮内 5mi

18、n ; 将载玻片用镊子夹住浸入APES 试齐U( 1ml APES+50ml 丙酮)1-2 次;纯丙酮内洗2次后，37 oC过夜，干燥；用铝箔包好，室温下存放，可存放半年。.多聚赖氨酸(Poly-L-lysine , PLL)试剂配制：PLL 0.5g +蒸馏水100 ml也可根据提供的方法配制。可于 4 oC或-20oC保存备用，可反复冻存，效果无明显影响。.涂片前将其稀释10-50倍，均匀涂在处理后干净的载玻片上， 37 oC下干燥过夜。.甲醛-甘油明胶.试剂:40%甲醛2.5ml，明胶0.5g，蒸馏水加至100ml。.配制方法：用一部分蒸馏水(约 80ml)加热溶解明胶，待完全溶化后加入

19、甲醛，最后补充蒸馏水至100ml，混匀即可。粘附切片的效果较上述两种方法差，特别是切片经 抗原热修复或酶消化后，有时易脱片。(2 )制做切片切片机：旋转式或滑动式切片机。切片厚度：5-7卩m。展片：切片放入玻璃平皿中的温水中展开切片(水浴锅上加热平皿)。捞片：用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片。切片干燥：37 oC过夜，干燥。5 石蜡切片的脱腊及水化脱蜡：将切片放入染色筐中，二甲苯I、川各 15分钟脱腊，水化：100%酒精I、n中各 10分钟、95% ALC 5分钟、90% ALC 5分钟、80% ALC 5分 钟、70%6.清除内源性过氧化物酶活性由于常规免疫组织化学染色的最后显色是用辣根过氧化

20、物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和DAB (3, 3-diami nobe nzidi netetra-hydrochloride)，而组织中常含有内源性过氧化物酶，为防止出现假阳性反应和减少背景染色，需要先清除内源性过氧化物酶活性。具体方法：将切片置入甲醇 (PBS)-H2O2液中2030分钟试剂：纯甲醇 99 ml 30%, H2O21ml充分混匀，使最后浓度为 0.3%，或0.01ml PBS (pH7.27.4) 99ml 30% H2O2 1ml7.PBS洗涤切片经甲醇-H2O2或PBS-H2O2处理后的切片先用蒸馏水洗一次 5min，再用PBS洗5m

21、in X 3次。0.01mol/L PBS (pH7.27.4) 的配制：NaH2PO42H2O 0.45 g Na2HPO412H2O 3.23gNaCl 8.0g 蒸馏水加至1000 ml为防止抗体与组织发生静电吸附而产生非特异性染色，可在 PBS中加入Tween20#,制成 含0.1% Tween20#的PBS。Tween20#为一种除污剂，可清除和圭寸闭组织中的静电荷。&抗原修复(antigen retrieval, AR )某些抗原的免疫组化染色不需要此步骤即可染色，如横纹肌中的 myoglobin (Mb)、actin、myosin、脑组织中的 S-100蛋白、GFAP、血型抗原

22、A、B、H、生长激素(growth hormone)、 胰岛素、波形蛋白(vimentin)、降钙素(calcitonin)等。但有一部分抗原物质或检测的因子等于 组织经甲醛固定后，因蛋白质的交联，将抗原封闭或发生变性，因此需要热修复或蛋白酶消 化。目前机理尚不清楚，但是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复处理经验表明， 可以提高抗原抗体阳性检测率， 同时也会出现假阳性， 现已广泛用于技术中。 尤其对原来仅表达在冰冻切片上的抗原，利用后大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上。(1)抗原热修复方法1微波中96C 1020 min2直接加热法100 C10 min3高压锅/消毒锅120

23、C 10 min 其他：水浴锅100C 10 min x 2及真空加热10 min等。.热修复的介质10.01 mol/L pH 6.0 柠檬酸缓冲液20.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 112)30.01 mol/L pH 7.0 PBS42 %硫酸铝52 %硝酸铅6生理盐水7蒸馏水文本框：溶液的摩尔浓度对修复效果无任何影响，而 pH值则影响较大，缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液较常用。 溶液的摩尔浓度对修复效果无任何影响，而 pH值则影响较大，缓冲液以柠檬酸缓冲液和 Tris-HCl缓冲液较常用。温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明：温度高修复时间短，如

24、Ki-67和P-gp的检测，利用同一切片，达到相同染色结果需要： 100 C 20min :90 C 30min :80 C 50min :70C 20h 操作流程1微波处理：将切片插入 25片塑料架上，在250 ml塑盒内加入200 ml缓冲液，将微波高档加温缓冲液至 90C +，取出后自然冷却至室温后蒸馏水洗， PBS洗。2水浴锅法：一种传统的抗原修复方法， 首先调节水温达95 C左右，将切片置入内含 200ml缓冲液的塑料盒或烧杯内，放入水浴锅，温度平衡后开始计算时间 20 min，取出容器后自然冷却到室温。3压力锅法：不锈钢高压锅内加入一定量的缓冲液， 加热锅使液体煮沸，将切片加入切片

25、架并置入锅内，盖上锅盖，不加阀，开始冒气计时 50 min，关闭气阀，使之加压 10 min。再将压力锅置于流水槽中冲洗 10 min，冷却后取出切片，PBS洗。.最佳修复方法的选择选择最佳的修复方法设计表柠檬酸 Buffer pH 12 pH 6 pH 10-11Tris-HCI Buffer pH 12 pH 7-8 pH 10-11微波 100 C 10min x 2 slide 1 slide 2 slide 3压力锅 120 C 10min slide 4 slide 5 slide 6微波或水浴 90 C 30min slide 7 slide 8 slide 9slide 10

26、作对照，不作任何处理.抗原热修复应注意的问题有些抗体在石蜡或冰冻切片上呈阴性反应， 但石蜡切片用抗原修复后却能很好显示， 对某些应表达在胞浆或膜上的抗原， 经修复后，绝大部分表达在核内。 而有些表达在核内的抗原经修复后会出现在胞浆内，因此，在使用该方法时一定要小心，对结果的判定也要做出客观的 分析，同时在操作过程中还注意以下问题：1热处理后应自然冷却切片。2热处理液不能让其煮干。3不要任何抗原的检测都使用该方法。4一批抗原的检测其温度和时间应保持一致。5一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核的影响 较大，会出现核破裂，苏木素淡染现象。6如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复， 得不出好的染

27、色结果，或经修复后，抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液或加一些鳌合剂，如 EDTA或EGTA等可改变某些抗原的修复。(2)蛋白酶消化法原理：蛋白酶消化可以去除覆盖在抗原决定簇表面的杂蛋白，更为重要的是因甲醛固定而引起的交联被酶消化打开而引起暴露抗原决定簇的作用， 使第一抗体能与抗原部分结合， 提高阳性检测率。注意事项：用于IHC消化的酶很多，所选择酶的种类、使用的浓度、 pH值、消化时间及 温度等均要视组织固定的不同、 所检测抗原的性质、 组织类型的不同而异， 通过预实验摸索 而确定。常用的消化酶类：胰蛋白酶和蛋白酶 K，此两种酶主要是用于检测细胞内抗原切片的消化， 如Keratin、

28、CEA、GFAP等。另一种是胃蛋白酶，主要是用于细胞间质抗原检测切片的消化， 如纤连蛋白(fibronectin)，各型胶原等。.消化时间及温度：一般讲，消化时间与组织固定的长短呈正比。一般蛋白酶的消化时间 51020min，视切片固定时间的长短而定，一般在常温下进行，也需做预试验进行对比。(3 )酶消化液的配制除了商业销售的成品，可按说明书使用外，还可自行配制。10.1%胰蛋白酶胰蛋白酶0.1g0.1% 氯化钙(pH 7.8) 100 ml配制方法：先配制 0.1%的CaCI2，用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8，然后加入胰蛋白 酶0.1g，溶解之。用前将胰蛋白酶液过滤，并在水浴

29、中预热至 37C,室温下消化时间530min , 多用于细胞内抗原的暴露。20.4 %胃蛋白酶胃蛋白酶400 mg0.1N HCI 100 ml多用于间质组织免疫组化染色切片的消化， 37C下消化时间约30 min。0.06 %蛋白酶K蛋白酶K 0.06 g0.05mol/L Tris-HCI (PH7.5) 100 ml用法同上。在免疫组化染色中，有时经过度固定的标本，影响一抗与抗原的结合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异。 总之，在保持组织形态不破坏的前提下，宜尽量消化时间延长。以上三种酶消化液，以第一种最为常用。9.经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤

30、后进行下一步。10.用与制备二抗相同的动物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特异性吸附。组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色。最常见的原因是蛋白(第一抗体)吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。最有效的方法是在用第一抗体孵育切片前，用与制备第二抗体相同动物的非免疫血清封闭组织上带电荷基团，而除去与第一抗体的非特异性结合 (在室温下进行)。非免疫血清的稀释度 1:51:20,还可加入BSA (bovine serum albumin)使稀释后的非免疫血 清中含0.16%的BSA，可取得更佳的染色效果，阻止非特异性背景染色。该方法是减少非特异性背景染色的有效方法。11 用特异性一抗孵育

31、切片研究组织细胞中的某种抗原是否存在， 应用免疫组化染色，就要选用针对这种抗原的特异性抗体。现在国际上有许多公司生产免疫组化试剂，包括一抗、二抗、显色剂，并制成了成套 的试剂盒，但一般试剂盒中不包括一抗， 研究者可根据一抗的种属性， 选择含有与一抗相匹配的二抗的试剂盒。1一抗的种属来源一抗可来源于各种种属的动物， 常见是来自家兔、 山羊或小鼠，偶见来自马。一般来自家兔和山羊的一抗都是多克隆的 IgG抗体，而来自小鼠的多是单克隆的 IgG抗体。根据实验动物或标本种属的不同，选择针对大鼠、小鼠或人的抗体。2抗体剂型及滴度检验我国现在使用的绝大多数都是国外进口的试剂，包括一抗和含二抗的试剂盒。国外生产的