肝脏冷保存.docx

1、肝脏冷保存牛磺熊去氧胆酸盐在人肝采集和冷保存期间的保护性作用LAURA FALASCA, GIUSEPPE TISONE, GIAMPIERO PALMIERI, ALESSANDRO ANSELMO, DANIELE DI PAOLO, LEONARDO BAIOCCHI, ELENA TORRI, GIUSEPPE ORLANDO, CARLO UMBERTO CASCIANI, AND MARIO ANGELICO意大利罗马大学，公共卫生系和病理学系肠胃病学科，外科学系肝脏移植中心背景：缺血再灌注损伤是肝移植后引起早期移植肝功能障碍的主要原因。牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）是一种天然酰胺化

2、的亲水性胆汁盐，能够在各种实验模型中防止胆汁郁积和肝细胞损伤，同时能够防止缺血再灌注损伤。在人肝移植背景环境下，我们研究了肝采集与冷保存时加入牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）对冷保存结束时、再灌注时以及移植7天后术中和术后酶释放情况以及肝组织学的影响。方法：研究涉及18名接受选择性肝移植的患者，选择其中6名患者作为对照。在6名患者中，将牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）加入肝采集和冷保存期间所使用的威斯康星大学溶液（UW溶液），最终浓度为2mM。这6名患者有三名在器官移植前，3g牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）通过供体的门静脉输注给药；另外三名，牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）通过这两种途径同时给药。结果：使用

3、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）没有引起不良事件。肝脏冲洗期间，牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理组移植肝的天冬氨酸氨基转移酶释放进下腔静脉血的量明显低于对照组移植肝（p = 0.05），而且对于术后第一周内外周血中细胞溶解酶的水平，也是牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理组移植肝比对照组移植肝明显（p 0.02）。电子显微镜检查时，在对照组移植肝中均发现明显的内皮损伤（胞质空泡化、细胞渗漏、及内皮损毁肝细胞暴露至血窦腔），而且都在再灌注时以及移植7天后发现。这些特征由于使用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）而得到显著改善（p 0.001）。在肝细胞中，发现一些胞质超微结构异常。在这些异常结构中，相比于对照组

4、移植肝，牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理组移植肝线粒体基质和嵴的损伤显著降低（p 0.01）。胆小管出现中度至严重的损伤是对照组活检标本的固有特征，同时出现胆小管腔扩张以及微绒毛丢失。所有这些异常均由牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的作用而显著改善（p 0.001）。当牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）以两种途径同时给药时，冷保存状况最佳。结论：在人肝采集和冷保存期间，使用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）能够防止缺血再灌注损伤。该研究结果的临床意义，需进一步研究。早期移植肝功能障碍的可变程度是尸体肝移植后出现的常见特征（1）。出现这种情形，通常归因于所谓的“保存损伤”，其包括几个有害事件，可能出现在器官采集

5、时以及出现在移植肝冷保存、复温和再灌注期间（2）。这些步骤中每一步，若引入潜在的危险因素，那么将最终影响早期移植肝功能障碍的严重度。早期移植肝功能障碍的临床病理学特征是缺血损伤（伴有显著的细胞溶解酶渗漏）以及胆汁郁积（3）。在所研究的多种因素当中，到目前为止，只有三种被鉴定为形成早期移植肝功能障碍的真正危险因素：供体年龄、移植肝中脂肪肝的比例、以及更重要的是冷保存持续时间（1）。威斯康星大学溶液的加入（UW溶液）在很大程度上，有助于限制冷保存的损伤效应（4）。在肝细胞水平，已知这些损伤都是由乳酸性酸中毒、细胞膨胀及废产物的积累引起的。冷保存和再灌注时，也伴随出现血窦内皮细胞的严重损伤、Kupf

6、fer细胞激活、胆小管显著扩张、以及肝内胆管损伤，所有这些均由于早期移植肝功能障碍的形成与加重而引起（5）。值得注意的是，威斯康星大学溶液（UW溶液）的逆行灌注未能阻止肝内胆管损伤（6）。许多药物已计划用于预防早期移植肝功能障碍，但是迄今为止，未有一种药物获准用于临床。在目前初步研究中，我们探讨了牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）（熊去氧胆酸（UDCA）的天然酰胺化产物）的潜在有效性。选择理论是多方面的。首先，在动物研究中已显示，牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）在体外（7,8）和体内（9,10）均能防止疏水性更大胆汁盐引起的胆汁郁积及肝细胞损伤。在离体细胞系统（7,8,11）中，牛磺熊去氧胆酸（TUDC

7、A）的细胞保护作用比熊去氧胆酸（UDCA）更显著，而且转运至胆汁过程效率更高（12）。牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）还具有以下优点：完全离子化以及在肠肝循环内所能遇到的所有pH条件下具有水溶性（13）。在最近对大鼠的研究当中，对牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）对缺血再灌注损伤的影响进行评价（14）。在夹住肝动脉与门静脉之前给药牛磺熊去氧胆酸（TUDCA），与其它胆汁盐给药相比，缺血肝再灌注后胆汁流恢复情况更佳，而且组织学损伤更低。对于猪的进一步实验研究报道，肝采集前通过门静脉输注牛磺熊去氧胆酸（TUDCA），能明显保护胆管上皮，防止保存损伤（15,16）。最后，所有正在出现的证据都表明，在微摩尔浓度

8、范围，牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）是Fas介导细胞凋亡（是胆汁郁积中引起损伤的显著机制）的一种有效抑制剂（17）。值得注意的是，此种抑制效应起初鉴定具有抑制疏水性胆汁盐诱导的细胞凋亡（18），目前发现，其还能够抑制不同物质（如：乙醇、转化生长因子1、Fas配体及冈田酸）诱导的细胞凋亡（19）。这就得出下列有趣假设：牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）可以通过一种更广泛的方式发挥作用，可能下调了Fas从细胞间隔向细胞表面的穿梭。而且也显示，熊去氧胆酸（UDCA）通过抑制线粒体膜去极化和通道形成，显著减少了线粒体的特异性改变（伴有其它刺激引起的凋亡）（20）。因此，有大量的实验数据提示，牛磺熊去氧胆酸（T

9、UDCA）通过肠胃外途径给药，可能有助于防止保存损伤。在各种人体研究当中，牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）口服药物使用。最近已显示，在原发性胆汁性肝硬化患者中，对比于熊去氧胆酸（UDCA），牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）给药还具有其它有利作用（21,22）。自从1992年牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）在意大利出现以来，其已作为一种口服处方药用于溶解胆固醇结石以及治疗慢性胆汁郁积。牛磺熊去氧胆酸在成千上万名患者中的使用显示，如同熊去氧胆酸（UDCA），牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）是一种非常安全的药物，而且实际上没有显著的副作用。本研究的目的是在人肝移植背景环境下，研究在移植体采集和（或）冷保存期间使用牛

10、磺熊去氧胆酸（TUDCA）是否能够有助于防止保存损伤的形成。从而，我们可以确定牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）以威斯康星大学溶液（UW溶液）补充物方式或通过供体门静脉输注方式给药时，对术中及术后细胞溶解酶释放情况以及肝细胞与血窦损伤（于冷保存与再灌注后以及术后一周末出现）程度的影响。此处提出的结果支持我们的提出的假设是正确的。患者与方法：患者：本次初步研究中，我们招募了18名在1997年11月至1998年12月由于末期肝病在我们机构接受选择性肝移植的成人患者。这些患者包括在器官采集与冷保存期间随机安排接受牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理的12名患者（10名男性，2名女性；平均年龄：48 12岁）以

11、及6名未接受牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理的对照组患者（均为男性；平均年龄：43 16岁）。该研究已征得每位患者同意，而且研究实验设计符合1975年赫尔辛基宣言的道德原则。研究实验设计：所有肝脏均保存在UW溶液中。1%的牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）钠盐溶液（在10ml无菌安瓿瓶中配制）由意大利贝斯迪大药厂（意大利热那亚市）馈赠。该化合物的纯度超过99.8%，此纯度由薄层层析和高效液相色谱确定（23）。在6名患者中，将牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）钠盐加入在器官采集和冷保存期间使用的UW溶液中，最终浓度达到2mM：对于每个移植体，总共6g（11.5mmol）牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）加入到6升

12、UW溶液中。三名患者中，在器官移植并正在夹住主动脉之前，牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）通过供体的门静脉输注：总共3g（5.75mmol）牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）溶于200ml生理盐水中，所得溶液输注10分钟（即输注速率大约为每100g体重每分钟0.8mmol）。如上所述，在其他三名患者中，牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）加入UW溶液，并通过供体门静脉输注。血液与胆汁分析：在使用门脉血冲洗肝脏时，术中从下腔静脉采集血样，确定再灌注后细胞溶解酶的释放情况；在手术前后，从受体的外周静脉采集血样；然后，在移植后第一周内，每天采集血样。研究分析了三份术中采集的血样：第一份血样，在肝脏冲洗开始后立即从下腔静

13、脉采集；另一份在用200ml门脉血冲洗后采集；最后一份在用400ml门脉血冲洗后采集。立即使用血清确定酶活性，对于其它常规肝脏检验，使用市售的试剂盒。在术后第一周内，每天采集胆汁样本，如以前报道那样，通过高效液相色谱从量和质上确定胆汁盐组成（24）。样本用5倍体积的异丙醇进行抽提，并于使用前-80保存。组织取样：在每名患者中于不同阶段，取三份肝穿刺活检样本，用于常规肝病理学检查以及透射电子显微镜检查。选择下列采集时间点：LB1：就在移植之前，从供体采集；LB2：移植体再灌注后60-90分钟，从受体采集；LB3：移植后第7天，从受体采集。用作光学显微镜检查的肝脏标本于10%甲醛溶液中固定，并包埋

14、于石蜡。用作电子显微镜检查的肝脏标本，用含2.5%戊二醛的0.1M二甲砷酸盐缓冲液在4固定3小时。用同一缓冲液洗涤三次后，标本随后用1%的四氧化锇溶液固定，随后在浓度成梯度的乙醇溶液中脱水，最后包埋于Spurr树脂。形态学研究：通过光学显微镜分析经苏木精-伊红染色及Masson氏三色染色的5m厚切片来确定肝损伤的程度。确定下列组织学异常的发生频率：小管性及肝细胞性胆汁郁积、肝细胞气球样变性、坏死、凋亡、脂肪变性及再生。此外，依据标准，评价肝门炎症、界面性肝炎、门静脉和中央静脉内皮炎、以及急性胆管炎的出现情况（25）。对于透射电子显微镜检查，使用Reichert Ultracut超薄切片机进行切

15、片，所得超薄切片用醋酸双氧铀和醋酸铅染色，随后在Philips CM12电子显微镜下观察。为了确定肝超微结构的损伤，每次肝活组织检查随机选择20张显微照片，并根据多种观察结果（从最小值50至200）评价下列参数：肝细胞核异常、肝细胞内质网膨胀、肝细胞线粒体损伤、胆小管扩张、胆小管微绒毛丢失、功能性复合物丢失、内皮细胞损伤、以及存在血窦碎片。使用顺序量表对每种参数的严重度进行评分，如下：0级：无损伤；1级：轻度损伤；2级：中度损伤；3级：严重损伤。所有形态学检查均在盲法条件下进行。统计学：使用美国加利福尼亚州洛杉矶市BMDP公司的SOLO统计学软件包对数据进行分析。组间的差异通过未配对数据t检验

16、以及Fisher精确检验评价。结果：患者特征：患者及器官供体的基线特征总结于表1中。本研究包括那些患有与酒精、自身免疫及病毒因素（丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒）有关的终末期肝病患者。对于供体与受体的年龄和性别、器官资源共享网络UNOS分级、移植原因以及围术期任何数据，接受与未接受牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理的患者之间没有差别。无一移植体的冷缺血时间超过8小时（在这两组中，平均时间分别为：5.7 1.1和6.2 2.3小时），而且也没有任一移植体在基线出现病理性脂肪变性。肝脏冲洗期间术中酶释放情况：手术期间，天冬氨酸氨基转移酶释放进血液的情形如图1所示。牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理组与对照

17、组患者间，外周血的基线平均值没有差异。在取自下腔静脉的第一份血样（用门静脉血冲洗肝脏后，立即采集）中，观察到术中最大峰。随后，AST水平快速上升，将近达到起始术中值（400ml门静脉血冲洗后的值）的一半。在用富含牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的UW溶液（3717 1790 mU/ml）采集和冷保存的肝脏中的AST峰值，明显低于用常规UW溶液（5643 810 mU/ml）采集和冷保存的肝脏中的AST峰值 (P=0.05)。那些将牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）通过加入UW溶液并以门静脉输注方式给药的患者中，AST的峰值水平也较低（3430 1340 mU/ml），但是在那些将牛磺熊去氧胆酸（TUDC

18、A）以门静脉输注方式给药的患者中，情况并非如此（5011 1471 mU/ml）。表1 在用或未用牛磺熊去氧胆酸钠盐采集和冷保存人肝移植体情形下，受体的人口统计学特征和临床特征a。受体起始状况牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）给药途径受体/供体年龄（岁）移植原因UNOS分级冷缺血小时数ICU耗时（小时）移植后一年，患者存活状况牛磺熊去氧胆酸处理组：DAUW溶液45/18HCV8572存活DVUW溶液47/20酒精8624存活BAUW溶液44/49PBC2672存活LAUW溶液61/28HBV3348存活MVUW溶液62/15HCV3672存活PSUW溶液54/46HCV27360死亡TG门静脉输注5

19、0/20HBV3748存活BP门静脉输注54/35酒精2696存活BM门静脉输注29/31酒精3748存活ZJUW溶液 门静脉输注24/24PSC3548存活ENUW溶液 门静脉输注54/40HCV2596存活LMUW溶液 门静脉输注56/24HCV2672存活平均值 标准差48 12 / 29 112.6 0.55.7 1.188 88对照组：ER55/17酒精35120存活NF47/17HCV3348存活EM36/47HCV2970存活EA56/18酒精2696存活CA14/38HBV23360死亡PM48/21酒精37144存活平均值 标准差43 16 / 26 132.5 0.56.2

20、 2.3121 139aHBV：乙型肝炎病毒；HCV：丙型肝炎病毒；ICU：重症监护病房；IP：门静脉给药；PBC：；PSC：；UNOS：器官资源共享网络。mU/ml 1000原位肝移植前外周血肝脏冲洗期间下腔静脉血原位肝移植后外周血图1 手术前后采集的外周血以及手术期间采集的下腔静脉血（于移植体再灌注时使用门静脉血冲洗期间采集）中AST的平均水平（平均值 标准差）。使用或不适用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）采集和冷保存移植体，此见“患者与方法”。A、B、C表示再灌注后不同的取样时间，其在“患者与方法”中指定。 术后病程及生化研究结果： 由于原发性肝无活力，一名牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理组

21、患者和一名对照组患者，在术后第二周死亡（表1）。在这两名患者中，除供体年龄大于平均年龄之外，死亡与治疗或其它潜在危险因素之间没有找到明确的关系。其余患者在肝移植一年后均存活并且恢复健康，而且牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理组与对照组各仅有一名患者出现早期移植肝活力不良（1）。在移植体采集和冷保存过程使用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）不会引起任何不良事件。牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理组所有11名存活患者，具有规律的临床与生化术后早期病程。如图2所示（上图），在术后第一周内，就整体而言，对照组患者外周血中AST和ALT的平均水平明显高于牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理组患者（分别为P 0.02和

22、P 0.05）。酶水平没有由于牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）给药途径的不同而有差异。不同患者组中，术后AST每日平均值如图2（下图）所示。血清胆红素以及其它常规肝检查结果，均未发现差异。在术后第一周内，所有患者的胆汁组成具有以下特征：几乎全为初级胆汁盐（胆酸和鹅去氧胆酸），而且大部分以甘氨酸酰胺化物的形式存在。在术后12-18小时从牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理的移植体受体获得的胆汁样本中，仅检测到痕量的牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）。在术后接下来的几天所采集的所用胆汁样本中，均为检测到牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）。光学显微镜检查结果：在光学显微镜检查时，取自供体的肝组织活检（LB1）显示，所有

23、供体的肝脏均正常，而且那些采集和冷保存过程使用或未使用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的移植体之间，没有显著差异。尤其是没有出现脂肪变性和坏死性炎症特征。相反，移植体再灌注后60-90小时采集的肝组织活检（LB2）显示，肝脏具有严重的组织学异常。肝损伤的显著特征包括：胆汁郁积、细胞气球样变性以及再生。这些特征在对照组移植体与采集和冷保存时均用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的移植体之间，没有差异，而与给药途径无关。在移植后第7天（LB3），上述的组织学异常仍然存在，此外，两组中有将近一半的患者出现预期的轻度或中度急性细胞排斥的组织学迹象，但是，这种症状不需进一步免疫抑制治疗。A（平均值 标准差） U/

24、L AST ALTBALT平均水平（mU/mL） 肝移植后天数图2 （A图）肝移植后第一周内，采集和冷保存过程使用或未使用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的移植体受体中AST与ALT的平均水平（平均值 标准差）。（B图）在术后第一周内，采集和冷保存过程使用或未使用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的肝脏移植体受体中AST的日平均水平（平均值 标准差）。超微结构检查结果：肝细胞：在对照组肝组织活检标本中发现许多肝细胞损伤的超微结构特征，其可归因于缺血再灌注损伤。能够说明肝采集后所发生事件的典型顺序的一个实例如图3所示。在冷保存期结束时，肝细胞损伤主要表现为：线粒体和细胞核异常，而且偶尔发现有连接复合物丢失

25、（图3a）。移植体再灌注后，出现其它超微结构异常，包括：肝细胞气球样变性、内质网扩张、和小管空间膨胀及其微绒毛丢失（图3b）。移植后7天，肝细胞坏死是常见的结果，同时具有髓鞘样结构和脂褐质积累，预示伴发有胆汁郁积。严重的胆小管异常和内皮细胞损伤也是常见的结果（图3c）。在我们的研究中，牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）通过门静脉给药，细胞核异常和内质网扩张仍然会在再灌注后（LB2）及移植后7天（LB3）出现，但频率更低。当将牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）加入到UW保存液中时，则未发现这个结果。相反，仅仅在牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）加入到UW保存液中时，线粒体损伤（涉及基质和嵴）得到显著改善（表2和表

26、3）。图3 在肝移植后不同时间点，取自单个患者的肝活检标本的透射电子显微镜图片，显示了与缺血再灌注损伤有关的超微结构变化情况。（a）冷保存后采集的肝活检标本。肝细胞细胞器显示出低体温的有害作用，尤其是线粒体，基质稀疏，嵴发生变化或缺失。细胞核异常（N）以及相邻细胞间连接复合物的缺失，同样可见。（b）器官再灌注后术中采集的肝活检标本：肝细胞显现出气球样变性，由光滑内质网（SER）膜囊的显著膨胀引起。胆小管变化明显，而且缺乏微绒毛。（c）移植后7天采集的肝活检标本。出现肝细胞坏死。能观察到髓鞘样结构（mf）和脂褐质颗粒（Lf）累积，这反映出已发生胆汁郁积。同时还观察到：内皮细胞发生变化、存在细胞残

27、骸以及炎性细胞进入血窦腔。原放大率：a和b，8800；c，5300。在胆小管检查时发现，保存时使用以及未使用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的肝脏移植体之间存在相关的超微结构差异（图4）。正常情况下，胆小管腔狭窄，而且实际上内部充满微绒毛。几乎所有使用富含牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的UW保存液保存的移植体（图4b），以及大约一半的接受从供体门静脉输注牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的移植体，它们的肝活检标本（LB2）显示了正常的外观，但是对照组移植体没有一例是正常的（图5a和表2、表3）。对照组移植体微绒毛显著减少甚至完全缺失，而且伴有不同程度的小管面积膨胀。在移植后7天采集的肝脏活检标本（LB3）

28、中，这些特征仍然存在甚至变得更糟，此时，在胆小管腔中存在膜性物质，这是另一常见结果（图4c）。在此时间点，胆小管改变的迹象也存在于牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）处理的移植体中，尽管变化的程度较低（图4d）。值得注意的是，当牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）通过加入UW保存液和供体门静脉输注联合给药时，胆小管超微结构的保存状况最佳（图6a）。表2 在对照组移植体以及在采集和冷保存过程使用牛熊去氧胆酸盐的移植体中，超微结构异常发生频率的百分比a。再灌注时原位肝移植后7天对照组（n = 6）牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）对照组（n = 6）牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）UW（n = 6）IP（n = 3）UW+

29、IP（n = 3）UW（n = 6）IP（n = 3）UW+IP（n = 3）肝细胞：细胞核异常46 3260 335 1*5 1*86 2028 378 420 12内质网膨胀72 358 4211 432 1910082 2715 245 16线粒体损伤56 1413 10*40 128 621 68 1015 245 16胆小管扩张94 96 5*57 52 2*95 1031 15*50 51 1*胆小管微绒毛减少或缺失92 913 22*20 154 8*1003516*22 147 4紧密连接疏松87 253 5*3 1*2 1*82 2312 20*3 1*2 1*血窦内皮损伤/

30、破裂92 94 9*3 1*2 1*99 311 15*5 8*1 1*a与对照组有显著差异（*：P = 0.05；*：P 0.001；*：P = 0.005）。表中数值以多种观察结果的“平均值 标准差”表示，对于每个肝脏活检标本，至少观察20张不同的显微照片。缩略词同表1。血窦细胞：在移植体从供体移出之前，采集的肝脏活检标本中血窦内皮细胞的形态正常。在所有用对照的UW保存液处理的移植体再灌注后，内皮衬细胞一致表现为：存在多个空隙，导致肝细胞暴露至血窦腔。在内皮细胞中，常常可见为数众多的空泡，提示这些空泡可能已经历一种活化过程（图5a）。在移植后1周内采集的肝脏活检标本中，内皮壁损伤甚至更严重（图5c）。Disse间隙常常扩张，而且在一些区域，可见内皮细胞突起完全缺失，同时发现胶原纤维束伸出以及血窦腔含有肝细胞胞质成分。表3 在对照组移植体以及在采集和