酵母双杂交系统及其应用.docx

1、酵母双杂交系统及其应用酵母双杂交系统及其应用Yeast Two-hybrid System and Its Application1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物学特性（1）单细胞真核生物 尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。（2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少； 1996年已完成酵母全基因组测序（ 1.5 x 107 bp ），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000

2、个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。（3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖在指数生长期每90分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。（4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。有两种单倍体细胞类型，分别为a型和型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/双倍体细胞。在营养匮乏时，a/双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4个单倍体孢子（两个a孢子和两个孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽

3、并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。(5)一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒vegetative，营养体生殖的，无性生殖的：属于或关于无性生殖，如裂殖或芽殖的bud，芽, 蓓蕾 starvation，饥饿, 饿死ascus，n.微生物子囊 meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂haploid，n.生物单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.植囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝(关系等), 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂spore，n.孢子vi.长孢子 germinate

4、，v.发芽, 发育, 使生长酿酒酵母生活周期2 酵母双杂交系统的原理蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。在生物体发育的不同阶段，细胞分裂、分化的不同时期，都离不开蛋白质间的相互作用。酵母双杂交系统是一种采用分子遗传学手段、通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质蛋白质相互作用的方法。Y2H是由纽约州立大学的Stanley Fields于1989年首先创立的。转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成。 DNA结合结构域(DNA binding domain, DB) 转录激活结构域(act

5、ivation domain, AD)例如，酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成，含有881个氨基酸。它有两个结构域： DNA结合结构域（DNA binding domain, DB ）由位于 N-末端1147个氨基酸构成，能识别效应基因的上游激活序列（UAS, upstream activating sequence）,此外， 在其N-端还具有一段核定位序列； 转录激活结构域（activation domain, AD）由位于C-末端的768881位氨基酸构成。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性。Fields等将Snf1与D

6、B融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上。其中，Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是它的一个结合蛋白。研究者将两种穿梭质粒转化酵母GGY: 171菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因。该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。一般地，将DB-x的融合蛋白称作诱饵(bait) , X往往是已知蛋白; AD-Y称作猎物(prey) ,Y称作猎物;整个实验过程称作“狩猎”( hunt或fish)。3 酵母双杂交系统的应用目前,在许多具有国际水准的实验室中,酵母双杂交系统及其衍生方法已成为研究蛋白

7、质相互作用的首选方法,而且利用它已揭示了大量未知蛋白质的相互作用。据对文献的统计,目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。年份899091929394959697文献数量10151558124223226年份989900010203040598文献数量274340612736766744745671274 鉴定两种已知蛋白之间有无相互作用 鉴定已明确有相互作用蛋白质发生作用所必需的的结构域及特定氨基酸的改变对相互作用的影响 寻找与某一特定蛋白质有相互作用的蛋白质 蛋白质相互作用图谱的绘制随着基因组研究计划的发展，以及mRNA在不同组织器官及不同发育阶段的表达图谱的构建(b

8、ody map)，蛋白质在不同时空状态下相互作用图谱（即基因组蛋白连锁图谱Genome Protein Linkage Map）。的构建也逐渐展开。在双杂交系统的BD及AD均接上cDNA库，让它们随机表达蛋白，这样检测报告基因表达的可能是A-B，B-C等一系列崭新的蛋白一蛋白相互作用，据此可以绘出ABC的蛋白联系图谱。Fromont-Racine等采用了相互作用结合技术(interaction mating strategy)，将BD-诱饵蛋白质(X)与AD基因组文库(Y)分别转化两种不同交配型单倍体酵母菌株，使两者在滤膜上结合，然后涂布于选择培养基上，挑选出阳性克隆作为诱饵蛋白质进行第二轮筛

9、选。该方法省去了利用二倍体菌株表达时筛选过程中繁琐的交叉影印以及大量培养皿的使用，并可以显著地提高效率。研究蛋白质蛋白质相互作用的方法有Western blotting、免疫沉淀法、噬菌体展示技术。4 Y2H的优点1.酵母双杂交体系研究蛋白一蛋白相互作用的整个过程只对核酸进行操作，充分利用了成熟的核酸技术和酵母这一快速方便的操作体系，使得实验简单易行。现已发展出酵母双杂交体系的商品试剂盒和相应的cDNA库。2.可以直接从基因文库中寻找编码相互作用蛋白的DNA序列，而不需要分离纯化蛋白。3.可以研究蛋白之间的弱相互作用。在细胞内，弱相互作用与强相互作用一样起着极其重要的生物学作用。免疫沉淀法以及

10、近来发展起来噬菌体展示技术要求蛋白一蛋白相互作用强度足够大，而不能检测蛋白之间的弱相互作用。酵母双杂交体系中蛋白一蛋白相互作用发生在酵母细胞这一自然的状态下，使得该方法的灵敏度很高。4. 检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。5 Y2H的局限性。 报告基因的转录发生在细胞核内首先，报告基因的转录发生在细胞核内，这要求两种杂交体蛋白都必需能进入核中，因此一些不容易进入核的蛋白就不适合用该体系进行研究。为了拓展其应用范围，近来发展的一些载体在融合蛋白中加入了蛋白质核定位序(nuclear localization sequaence,NLS)，部分解决了这个题。已成功地在该体系

11、中研究过的蛋白除了许多核蛋白(如转录因子)外，还包括许多细胞浆、细胞膜以及线粒体蛋白。但对于发生在细胞质中或者细胞膜上的蛋白质相互作用是检测不到的。 有一些蛋白不适于用该体系但是，还有一些蛋白不适于用该体系。如需要翻译后修饰(磷酸化或糖基化)才能起相互作用的蛋白不能直接用该体系进行研究。因为在酵母中不一定会产生与高等动植物细胞内一样的翻译后修饰。要研究这样的相互作用，必需对该体系加以改造。另外有一些蛋白与DNA结合结构域融合后，在没有转录激活杂交体蛋白存在的情况下也能激活报告基因的转录。这些蛋白往往本身含有转录激活结构域或类似的结构域。这样的蛋白需要经过改造，去掉它们的转录激活能力后才能用该体

12、系研究。有些蛋白杂交体对酵母细胞的正常功能有影晌，有的甚至是致死性的，这样的蛋白也无法在该体系中研究。 假阳性一个值得注意的问题是筛库过程中出现的假阳性问题。虽然现有的体系都用两个报告基因进行双重筛选，但假阳性问题仍然存在。一种假阳性是由于转录激活杂交体中的库蛋白本身是参与转录的蛋白，即使在DNA结合域杂交体不存在的情况下，转录激活杂交体自身就能激活报告基因的转录，表现为阳性。因此在筛选出阳性克隆后，需要用回收的转录激活域杂交体质粒单独转化酵母，以判定克隆是否为假阳性克隆。另一类假阳性是在DNA结合域杂交体存在下表现为阳性，但对DNA结合域杂交体没有特异性，不相关的DNA结合域杂交体与其共转化

13、酵母时也表现为阳性。在筛选出阳性克隆后，应将转录激活域杂交体同一些不相关的DNA结合域杂交体一起转化酵母，以排除这类假阳性克隆。Harper等利用酵母交配发展一种快速检别这类假阳性的方法。其大致过程是:让阳性克隆在一定的选择培养基上生长使其失去DNA结合域杂交体质粒，只剩下转录结合域杂交体质粒，然后与不同性别的含有与该蛋白无关的DNA结合域杂交体的酵母交配，从形成的二倍体酵母是否表现为阳性判定原来的克隆是否为假阳性克隆。而不需要提取回收阳性克隆的转录激活杂交体质粒，再与无关的DNA结合域杂交体共转化酵母细胞这样一个繁琐的过程。筛到的蛋白和另一类假阳性来自cDNA库的构建。可能cDNA编码的某个

14、蛋白的一部分能和目标蛋白起相互作用，而完整的蛋白则无法和目标蛋白结合;cDNA库一般由Oligo-dT或由随机引物合成。随机引物构建的cDNA库中DNA的长度一般为几百bp，已将蛋白分成了多段，这样避免了一个蛋白内不同结构域间的相互影响，对用酵母双杂交体系进行筛库有利。但这种库又可能使得原来在整个蛋白中不暴露的区域暴露，筛库时有可能将这样的区域筛出。这样的假阳性需要用其它实验加以排除。筛到的蛋白和目标蛋白的相互作用有可能是通过酵母的内源蛋白为介导产生的。 假阴性在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性, 即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。

15、造成假阴性的原因主要有几方面:一、是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二、是蛋白间的相互作用较弱, 应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。三、GAL4和LexA系统要求被测蛋白定位于细胞核，然而有些蛋白却有强疏水结构域，还有些蛋白携带定位于细胞其他细胞器的强信号，这样，涉及后2类蛋白的相互作用在GAL4和LexA系统中就检测不到;四、GAL4和LexA系统依赖转录激活报告基因而检测蛋白相互作用，如果蛋白是抑制基因表达的，报告基因就不能被激活转录，双杂交系统就检测不到该蛋白相互作用了。另外应该值得注意的是，从库中筛到的蛋白在体内是否真正同目的蛋白发生相互作用还需要

16、有进一步实验加以证实。有可能两种蛋白根本不在同一种器官、组织或细胞内表达，或者不在同一发育阶段表达，或者存在于同一种细胞的不同区域，根本不可能产生真正的相互作用。这也要求筛库时谨慎选择有生物学意义的基因库(器官、组织、细胞、发育阶段特异性)。最后,有必要指出的是,酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。6 酵母双杂交系统的优化6.1 BD结构域：GAL4, LexA,6.2 AD结构域：GAL4，VP16，B42酵母双杂交系统常用的DNA结合结构域有GAL4和来自E.coli的LexA（LexA不具有核定位序列）。常用的转录激活结构域有 GAL4、VP16

17、或B42。由于转录因子具组件式特点，这些DNA结合结构域和激活结构域可以相互组合，但每一种组合均有其优缺点。比如VP16激活结构域有强激活性，可以用于检测亲和力较低的蛋白之间的相互作用，但与此同时势必伴随假阳性比率过高的问题。按转录激活活性的大小排列，VP16较Ga14 region大，Ga14 region又较B42强。由于存在毒性问题，并非转录活性越大越好。其中B42能消除强转录活化子对酵母细胞的毒性，从而提高对靶蛋白的筛选范围。VP16来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于其他两个； B42是一个异源的含有88个残基的酸性肽，来自E. coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的基因表达

18、对细胞的影响，并且在B42后有流感病毒HA抗原，易于将蛋白分离纯化。基于B42:LexA的酵母双杂交系统（GAL1启动子）的融合蛋白可以被诱导性表达，以防蛋白相互作用产生了细胞毒作用而抑制细胞生长，同时还可以为假阳性提供对照。LexA系统可用以检测微弱、短暂结合的蛋白，以及可能对酵母菌具有一定毒性的蛋白，而GAL4系统则可有效地消除假阳性。6.3 报告基因：lacZ, HIS3，酵母双杂交系统的报告基因通常由一些营养选择标记HIS3(HIS3基因的转录激活能使酵母在缺乏组氨酸的培养基上生长)和（或）编码酶的基因lacZ基因的转录激活能使酵母产生 -半乳糖苷酶）组成。最初的双杂交系统只采用 一种

19、报告基因来反映蛋白相互作用，假阳性通常可达10 %90%不等，采用多个报告基因可以减少假阳性，近来的双杂交系统则使用3个甚至4个分别有独立启动子结构的选择标记来降低假阳性率。同时使用多个营养标记可使分析手段多样化，但相应的实验时间却并未增加。除此之外，因为不同的报告基因各有不同的上游激活序列，因此采用多个有独立启动子结构的选择标记能排除由于上游激活结构域融合蛋白和上游激活序列直接作用而引起的假阳性结果。 双杂交系统的改进，使其不仅可以定性分析可以定量分析蛋白相互作用。在酵母双杂交系统中，实验者可以通过比较LacZ报告基因表达水平的相对高低，来比较一个目的蛋白和另一个己知与该目的蛋白有相互作用的

20、蛋白的若干突变体之间相互作用的相对强弱。 然而值得注意的是，在定量双杂交分析中，只有使用相同的双杂交系统，检测大量转化子，并且进行大量平行试验，Lac Z报告基因表达水平的相对高低才被看作是有定量意义的。所有酵母双杂交实验都必须检测大量转化子，方可避免只检测单个酵母菌落所引起的偏差和错误。此外，要极力避免将不同实验团体的数据横向比较，因为不同实验室使用的双杂交系统、操作方法、分析比较方法都是不同的，不同蛋白在不同酵母中会有不同的表达水平，不同菌落中质粒的拷贝数不同，等等，这些都会使得横向比较没有意义。 液体培养实验(liquid growth assays)也是一种比较不同蛋白之间相互作用强弱

21、的简便方法。其原理是：酵母在缺乏组氨酸的培养基里生长，必须依赖蛋白的相互作用来激活能够编码组氨酸的基因。蛋白作用强，该基因表达量高，酵母合成组氨酸的能力强，酵母培养物浓度升高快，则透光性就差。因此，2个蛋白之间相互作用的强弱可以通过培养物浓度的改变值(可用分光光度计等测得)的相对大小而估得。也就是说，蛋白相互作用强，酵母长得就快一些。6.4 转化方式酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是转化效率偏低。酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈，是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一, 特别是对低丰度cDNA库进行筛选时, 必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次

22、转化。相比之下共转化省时省力，更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时, 共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中, 通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。Bendixen等人通过酵母接合型的引用,避免了两次转化操作,同时又提高了双杂交的效率。7 Y2H的衍化系统7.1核外双杂交系统（extra-nuclear two-hybrid system） 传统的酵母双杂交系统所研究的蛋白质-蛋白质之间的相互作用大都是在细胞核内完成的,但是许多定位在细胞质中或细胞膜上的蛋白质需要一系列

23、复杂的加工修饰过程才能发挥其正常生理功能。用传统的酵母双杂交系统研究这些蛋白质与伙伴蛋白之间的关系是不合适的。最近建立的以非转录读出为特点的Sos蛋白介导的双杂交系统、PI3K介导的靶蛋白识别系统以及断裂-泛素为基础的双杂交系统另辟蹊径,为需要复杂修饰后定位在胞质或细胞膜上的蛋白质间相互作用的研究提供了新思路。7.1.1 Sos蛋白恢复系统(Sos recruiment system，SRS)SRS是Aronheim等根据Sos蛋白的特点设计出的一种双杂交系统。Sos蛋白是人类的Ras通路中鸟苷酸交换因子(guanine exchange factors, GEF)定位于细胞质中,在细胞信号转

24、导过程中能够使Ras蛋白由非活化型Ras-GDP转化成活化型Ras-GTP,从而激活Ras信号通路,细胞得以生长。酵母中的GEF是Cdc25蛋白,定位在细胞膜上,其功能与人类的Sos蛋白相同。它的突变型cdc25-2为温度敏感型,在37细胞不能生长。研究发现,在突变型cdc25酵母细胞中,当Sos蛋白通过某种方式定位于细胞膜上时,可替代Cdc25蛋白的功能, 激活Ras蛋白使细胞在37恢复生长。根据这个原理构建两个融合蛋白,其中蛋白X与Sos蛋白构成融合蛋白1, 蛋白Y与豆蔻酰基或法西尼基膜定位信号构成融合蛋白2, 两个融合蛋白在cdc25突变型的酵母细胞中共表达,如果X与Y相互作用,则能使S

25、os蛋白定位于细胞膜上,激活Ras信号通路,使细胞在37下生长。与传统的酵母双杂交系统相比,Sos恢复系统的主要优点在于被研究的蛋白质相互作用发生在细胞质而不是细胞核中, 因此在转录因子及胞质中行使生理功能的蛋白质的研究中可以得到广泛的应用。7.1.2 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)介导的靶蛋白识别系统(targets of PI3K identification system,TOPIS)TOPIS是Isakoff等将SRS进一步拓展建立而成的。该系统用来识别和筛选与PI3K催化产物磷脂酰肌醇3,4-二磷酸即PtdIns(3,4)P2及磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸即PtdIns(3,4,5)

26、P3具有高度亲和力的蛋白。PI3K是一种膜结合脂类激酶,其功能是使磷脂酰肌醇的肌醇环D-3位置磷酸化而催化PtdIns(3,4)P2以及PtdIns(3,4,5)P3的形成。PtdIns(3,4)P2和PtdIns(3,4,5)P3在胞内可直接作为第二信使激活下游一系列信号分子。下游信号蛋白通常是通过其pleckstrin同源结构域(pleckstrin homology domain, PH domain)与PI3K催化产物结合。另一方面,研究发现,在cdc25温度敏感型酵母细胞中,与Sos蛋白特点类似,当活化型的Ras蛋白(Ras2GTP)以某种方式定位于细胞膜上时,可补偿酵母细胞cdc2

27、5突变表型,使其在37恢复生长。根据以上特点,将活化型的Ras蛋白与靶蛋白PH结构域融合构建融合蛋白,让它与PI3K在酵母cdc25温度突变型细胞中共表达。在PI3K的介导下,如果靶蛋白的PH结构域与PtdIns(3,4)P2或PtdIns(3,4,5)P3之一相结合,则将活化型的Ras蛋白定位于细胞膜上,允许酵母细胞在非允许温度下(37)生长。利用该系统,Isakoff从与PtdIns(3,4)P2或PtdIns(3,4,5)P3具有高度亲和力的一系列PH结构域中发现了几个保守的氨基酸位点,并且从这些保守的氨基酸位点出发,从Genebank中找到几个与PI3K产物相互作用的新蛋白。PI3K所

28、介导的级联反应在细胞中具有广泛的生理效应所以,TOPIS对于阐明PI3K下游信号通路提供了有力的工具。7.1.3 断裂-泛素为基础的双杂交系统(yeast two-hybrid system based on split-ubiquitin)上面介绍的两个系统是针对膜有关的Ras信号通路的特点设计的。近来Staglar等根据存在于胞质中的一种蛋白泛素的特点建立了一种以断裂-泛素(split-ubiquitin)为基础的双杂交系统也用于研究膜蛋白之间的相互作用。泛素是一种在真核细胞中普遍存在的由76个氨基酸组成的蛋白质,结构保守。其生理功能是结合在蛋白的N-端作为泛素特异蛋白酶(ubiquiti

29、n-specific protease,UBP)剪切蛋白质的标记。研究发现,如果将泛素C-端(Cub,第3576位氨基酸)与一个报告蛋白(通常是转录激活因子)构成融合蛋白,让它与N-端部分(Nub,第134位氨基酸)一起在酵母细胞中共表达,结果发现Nub与Cub能够重新形成有功能的泛素(断裂-泛素),并由UBP识别并切断Cub-报告蛋白之间的共价键,结果报告蛋白从泛素中释放出来。根据以上原理,Staglar等将Nub与蛋白X形成融合蛋白1,Cub-报告蛋白与蛋白Y形成融合蛋白2,二者在酵母细胞中共表达,如果X与Y相互作用,则迫使Nub与Cub空间上相接近,重建一个有功能的泛素,报告蛋白被UBP

30、切割下来进入细胞核中,激活特定报告基因的表达。通常用于构建融合蛋白1的Nub使用一个点突变形式NubG，这样就避免了Nub与酵母自身的Cub结合而出现假阳性。该系统巧妙地解决了膜蛋白之间的相互作用与核报告基因的激活二者在空间上的矛盾。此系统的另一大优点在于构建融合蛋白的Nub及Cub均为40个氨基酸左右的小分子链,所以对靶蛋白之间相互作用可能造成的空间障碍的可能性就很小。利用该系统,以proteinA-LexA-VP16（PLV）为报告蛋白, Johnnson证明内质网膜上的寡糖基转移酶的亚基Wbplp与蛋白Ostlp之间存在相互作用,而与蛋白Alg5p之间不存在相互作用。双诱饵系统（two-

31、bait system） 双诱饵系统用2种诱饵结构（一种编码蛋白X1与LexA BD融合蛋白，另一种编码X2与cl融合蛋白）分别与不同的DNA结合区域结合，激活2套不同的报告基因（一套报告基因为lacZ或LEU2，另一套报告基因为LYS2或gusA）来检测蛋白相互作用。双诱饵系统可以同时检测、区分2个蛋白，该性质已被用于检测能与较大蛋白上特定基序相互作用的小分子及肽段。双诱饵系统还可以在1次试验中同时用2种诱饵蛋白快速筛选文库；同时还能用于筛选那些破坏蛋白之间相互作用的蛋白或其他小分子。这些性质使得双诱饵系统可以用于评价药物对蛋白质相互作用的破坏能力。三杂交系统两个蛋白之间通过第三者发生相互作

32、用。第三物可以是蛋白质、小分子或RNA。依赖于蛋白质的三杂交系统有3种情况:两个蛋白A和B之间的接触由于第三蛋白Z而稳定和加强。Elion等发现酵母的两个信号传递蛋白Ste7和Ste 11，均与Ste5发生相互作用。缺失实验表明，它们与SteS的不同区域结合。使用Ste5菌株，含有LexAop-LacZ基因。在Ste5菌株中，B42-Ste11和LexA-Ste7的相互作用是很弱的。然而，Ste5的超表达使Ste11和Ste7的相互作用增强了6倍。这个实验也表明在没有Ste5存在的条件下，Ste11和Ste7也可以接触。蛋白A和B不直接接触，而是通过另一蛋白Z相互作用，Z称作桥蛋白。Wigler等发现信号传递蛋白RAS可以与RAF (RAS基因的一个下游影响因子)的