整理中药材及其制剂的显微鉴别操作规程.docx

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3、SOPQC05801颁发部门：质量管理部 新订 修订原文件号：编制:部门审核:QA审核：批准：分发部门： QC。目的：建立中药材及制剂显微鉴定方法操作规程。范围:所有购进的中药材及正式生产的含原药粉的制剂品种。责任者:QC主任、检验员对本SOP的实施负责.规程：1. 药材及成方制剂显微鉴定法是应用动植物细胞、组织和矿物晶体光学等知识鉴别中药材或中成药的一种方法。通常是借助显微镜进行观察，故称“显微鉴别法主要适用于:1.1. 药材性状鉴别特征不明显或外形相似而组织构造不同；1.2. 药材破碎不易辨别或区分;1.3。 药材呈粉末状态或为成方制剂；1.4. 用显微方法确定药材中有效成份在组织中的分布

4、状况及其特征。2。 显微标本片的分类2。1。 临时性制片 操作简单，制作方便，主要用于药材检验.2。1.1。 切制片 采用滑走切片或徒手切片法制片。适用于植物根、茎类药材的鉴别。2。1。2. 表面片 采用剪、撕等方法制片。适用于叶类、花类及全草类药材的叶片、花冠、萼片、苞片等的鉴别。2.1。3. 解离组织片 用适当的组织解离液使组织细胞相互适度解离后装片，适用于观察比较坚硬的细胞组织，如导管、纤维、石细胞等的形态。2。1.4. 磨制片 适用于矿物药或有些坚硬的动物类药材如珍珠、石决明及动物骨骼的鉴别.2.1。5. 粉末片 适用于花粉粒、孢子等的形态特征或构造观察.2.2. 石蜡片 亦称永久片

5、制成的石蜡切片外形较完整，厚薄均匀，且可制得连续切片，观察方便，能长期保存。适用于药材鉴定研究工作。以上各临时装片均可按规定和制备方法制成永久性的石蜡切片。标准操作规程标 题 中药材及其制剂显微鉴定法颁发部门质量管理部编号SOPQC05801页次：2/103. 仪器和用具3.1。 仪器 生物光学显微镜、镜台测微尺、离心机.3.2. 用具 3.2。1。 放大镜、刀片、解剖刀、镊子、剪、解剖针。3.2.2。 载玻片、盖玻片.3.2.3。 吸湿器、培养皿或小烧杯、酒精灯、铁三角架、石棉网、滴瓶、试管、试管架、滴管、玻璃棒、乳钵、量筒等。3。2.4。 毛笔、铅笔、带盖搪瓷盘、纱布、吸水纸、火柴等。4。

6、 试液及配制4。1. 水合氯醛试液 取水合氯醛50g，加水15ml与甘油10ml使溶解，即得。此液为透化剂，可使干缩的细胞壁膨胀而透明,并能溶解淀粉粒、树脂、蛋白质及挥发油。4。2。 甘油醋酸试液（斯氏液） 取甘油、50醋酸与水各等份，混合即得。此液专用于观察淀粉粒形态，可使淀粉粒不膨胀变形，便于测量其大小。4.3. 甘油乙醇液 取甘油1份，50乙醇1份，混合即得。此液为封藏液,用于保存植物配料及临时切片，有软化组织的作用。4。4。 苏丹试液 取苏丹 0.01g,加90%乙醇5ml溶解后，加甘油5ml摇匀即得.本液应置棕色玻璃瓶内保存，在2个月内应用。4.5. 钌红试液 取10醋酸钠溶液12m

7、l,加钌红适量使呈酒红色即得，本液应临用时新配。4.6. 间苯三酚试液 取间苯三酚1g,加90乙醇100ml,使溶解，滤过即得.应置棕色玻璃瓶内，在暗处保存。此液与浓盐酸合用，可使木化细胞染成红色或紫红色.4。7。 碘试液 取碘化钾0.5g，溶于少量水中,加碘1g,使溶解加水至100ml即得.4。8。 硝酸铬试液 取硝酸铬10ml，加入100ml水中，混匀。另取铬酸10g，加水100ml使溶解。用时二液等份混合，即得.此液为常用的“植物组织解离液”.检品的解离浸泡时间，依材料的质地不同而异.4.9。 萘酚试液 取15的萘酚乙醇溶液10.5ml，缓缓加入硫酸6.5ml，混匀后再加乙醇40。5ml

8、及水4ml,混匀即得。标准操作规程标 题 中药材及其制剂显微鉴定法颁发部门质量管理部编号SOPQC05801页次：3/104。10. 硝酸汞试液（米隆氏试液）取汞4.5g,加发烟硝酸3ml，待作用完毕，加等量水稀释即得。本液应置棕色玻璃塞瓶内，在暗处保存 。用于检查糊粉粒，染成砖红色。4.11. 氯化锌碘试液 取碘化钾8g，加入8。5ml水使溶解，再加无水氯化锌2.5g使溶解，加碘适量至饱和，即得。本液应置棕色玻璃瓶塞内。用于检查木质化与纤维素细胞壁，前者显黄棕色，后者显蓝色或紫色。5. 显微标本片的制做5。1。 切片(横片或纵片）5。1。1。 药材的预处理 先将药材表面泥沙刷洗干净，将应观察

9、的部位，切成大小适当的块或段，一般以宽1cm，长3cm为宜， 厚1020m，切面削平整。质地软硬适中的药材可直接进行切片。质地坚硬的则须先使其软化后再切片。软化方法可放在吸湿器（即干燥器底部盛蒸馏水并滴数滴苯酚防霉,上部瓷板上置药材样品吸湿）中闷润，或在水中浸软。有些根、根茎、茎及木类药材,质地虽坚实，可将削平的切面浸水中片刻 ,表面润湿时取出，直接切片也能切成较完整的薄片。过于柔软的材料，可将其浸入7095乙醇中，约20min后可变硬些，即可进行切片.对于细小、柔软而薄的药材，如种子或叶片,不能直接手持切片，种子类可置软木中塞或橡胶片中(一侧切一窄缝，将种子嵌入其中）,叶类药材可用质地松软的

10、通草或向日葵的茎髓作夹持物进行切片。药材在预处理时应注意不能影响要观察的显微鉴别特征。5.1.2。 徒手切片 具有操作简便、迅速，方便,制成片能保持其内含物的固有特征，便于进行各种显微化学反应观察的特点，是显微鉴别中最为常用的方法。5.1.2。1。 切片 右手持刀片,左手拇指和食指关节夹持药材，中指托着药材的底部，使药材略高出食拇二指，肘关节应固定，使材料的切面保持水平,刀口向内并使刀刃自左前方向右后方切削，即可切得薄片.操作时,材料的切面须经常加水或50乙醇保持湿润，防止切片粘在刀片上。切好的切片用毛笔蘸水轻轻从刀片上推入盛有水或50%乙醇的培养皿中。5.1.2.2。 徒手圆筒生物切片器切片

11、 将药材用通草或软木夹持,固定于切片器持物筒中；具有一定硬度的药材可直接固定于持物筒中；左手持切片器,拇指与小拇指持底盘的边缘,食指端顶动中柱上的固定螺帽,使切片整体方向不变，以保持材料的切片方向固定；右手持刀片，刀柄靠于拇指与食指部,标准操作规程标 题 中药材及其制剂显微鉴定法颁发部门质量管理部编号SOPQC05801页次:4/10食指与中指轻压于刀片的上面，刀片平贴于刀片器圆台上，由左上方至右下方迅速滑动，切下的切片用毛笔沾水取下置盛水的培养皿中。5。1.2.3。 装片 选取薄而平整的切片置载玻片上，根据所要观察的内容要求，滴加适宜的试液12滴，盖好盖玻片,即可在显微镜下观察。如加水合氯醛

12、试液透化，将切片移载玻片上滴加12滴水合氯醛试液，在酒精灯上微微加热，至边缘起小泡即停止加热，继续补充试液再加热，以不烧干为度,直至透化完全为止；加热温度不能过高,以防水合氯醛试液沸腾，使组织内带入气泡，加热时应将载玻片不断移动,不宜对准一处烧,以免受热不匀而炸裂，透化后放冷，加甘油乙醇试液12滴后加封盖片，贴上标签,冬日室温较低时，透化后不待放冷即加甘油乙醇试液,以防水合氯醛试液结晶析出而防碍观察。水合氯醛试液有洁净作用，并能使已收缩的细胞膨胀，能清楚观察组织构造,可溶解淀粉粒、蛋白质、叶绿素、挥发油、树脂等，对草酸钙结晶无作用，为观察草酸钙结晶的良好试剂。如需观察菊糖等一些多糖物质则加水合

13、氯醛试液不加热。5。1.3。 滑走切片机切片 此法不需要较高的技巧，只要了解掌握操作方法,短期内即可学会并切出较薄的切片,适用于质地坚实、形状较大的药材切片.柔软的材料经冷冻处理后便可切得较薄的的切片.5.1。3.1. 材料制备 经软化处理的材料，检查软化是否合适，可用刀片切割材料,若较容易切下薄片，则软化适宜。柔软的药材可直接用胡萝卜或土豆作夹持物.新鲜材料则直接浸入石蜡中,使材料外面包上一层石蜡.5。1.3。2. 切片机调试及材料安装 切片前,先安装好要片机使稳固,进行调试检查。将切片刀夹持在夹刀器上夹紧，调整刀的角度（约00150）；调整厚度调节器至所需厚度。把制备好的材料用两块软木塞夹

14、住或直接放在切片机的材料固定器上夹正,使材料露出软木塞或固定器上端约0。5cm，调整好材料高度，使刀机刀刃靠近材料的切面，使材料切面与刀刃平等并略高于刀刃约0.51mm。5。1。3.3。 切片 用右手所握夹刀器柄。往操作者方向迅速拉动，便切下切片，且附着于刀的表面上，用毛笔蘸水把切片取下放入盛水的培养皿中。将刀推回原处，转动厚度推进器,用毛笔蘸水润湿材料切面及刀刃,再拉切片刀，往返推动，可得到许多厚度均匀完整的切片。若切片不成功,应检查切片刀是否太钝，则应磨刀或换锋锐的切片刀，若切得太薄而破碎，则逐渐增标准操作规程标 题 中药材及其制剂显微鉴定法颁发部门质量管理部编号SOPQC05801页次：

15、5/10加厚度至切得完整的薄片为度。注意：夹持在材料固定器上的材料切面接近于固定上端时,必须注意防止切片刀刃碰撞固定器而损毁切片刀。5.1。3.4。 装片 为防止切片弯曲，可选取理想的切片，用两张载玻片夹住 ，浸于水中4小时使材料压平,放入95乙醇中固定，甘油装片观察。5.2。 粉末标本片的制做 主要用于粉末状的药材及药材粉末制成的成方制剂观察。5。2。1. 粉末制备 药材要先干燥，磨或挫成细粉,装瓶,贴上标签。粉末制备时，注意取样的代表性和全面性，如根要切取根头、根中及根尾等部位，必须全部磨成粉，不得丢弃渣头。并需过4号筛，混合均匀。干燥时，一般不能超过60，避免经受高温，使淀粉粒糊化,难以

16、观察其完整者。5。2。2。 制片法 用解剖针挑取粉末少许，置载玻片的中央位置，加适宜的试液1滴，用针搅匀（如为酸或碱时应用细玻璃棒代替针），待液体渗入粉末时，用左手食指与拇夹持盖片的边缘，使其与左侧药液层接触，再用右手持小镊子或解剖刀托住盖玻片的右侧,轻轻下放，则液体逐渐扩延充满盖玻片下方，如液体未充满盖玻片，应从空隙相对边缘滴加液体，以防产生气泡；若液体过多,用滤纸吸去溢出的液体，最后在载玻片的左端贴上标签或做上标记。5.2.3。 中药成方制剂的鉴别5.2.3.1。 散剂、胶囊剂，可直接取粉末装片或透化装片；5。2.3。2。 片剂 ，可取23片研细后，取粉末适量装片或透化装片；5。 2。3.

17、3。 水丸剂，可取数粒丸置乳钵中（若系包衣水丸，可刮去包衣）研细，取粉末适量装片，或取粉末适量置小容器内，加水合氯醛试液透化（加适量甘油以防水合氯醛结晶析出），搅匀，用吸管吸取混悬液装片。5。2。3。4。 蜜丸剂 样品可用二种方法处理（1） 用解剖刀沿蜜丸正中切开，从切面由外至内刮取少许样品，置载玻璃片中央偏右，滴加适宜的试液，用玻璃棒搅匀。按上述粉末制片法制片，或透化装片。(2） 将样品切碎放入容器，加水搅拌洗涤，然后置离心管中离心沉淀，如此反复以除尽蜂蜜后,取沉淀或透化后装片。5.2。3。5。 含挥发油性成分的制剂，取其粉末进行微量升华装片。标准操作规程标 题 中药材及其制剂显微鉴定法颁发

18、部门质量管理部编号SOPQC05801页次：6/105. 2。4。 粉末制片的注意事项5.2.4.1。 粉末加液体搅拌及加盖处理时容易产生气泡。如用水或甘油装片时，可先加少量乙醇使其润湿，可避免或减少气泡的形成，或反复将盖片沿一侧轻抬，可使多数气泡逸出。搅拌时产生的气泡可随时用针将其移出.5。2.4。2。 装片用的液体如易挥发，应装片后立即观察，用水装片也较易蒸发而干涸，通常滴加少许甘油可延长保存时间。5。2。4.3 需用水合氯醛试液透化时，应注意掌握操作方法，装片后用手执其一端，保持水平置小火焰上约12cm处加热，并缓缓左右移动使之微沸,见气泡逸出时离开火焰，待气泡停止逸出，再放在小火上，并

19、随时补充蒸发的试液，如此反复操作，直至粉末呈透明为止，放凉后滴加甘油镜检。5.2。4。4. 粉末药材制片时，每片取用量宜少不宜多,为使观察方便,可多做些制片.如取量多，显微特征单一轮廓不清，反而费时,不易得出准确结论。中药制剂的粉末检查，因在多味药材粉末中寻找某一味药材某一显微特征,有时较难查见，可以取粉末量多些，置试管或小烧杯中,加入水合氯醛试液，加热透化.透化好后再用吸管吸出,滴在载玻片上，加盖玻片，即可观察。 5.3. 表面标本片的制做 主要用于叶类、花类（萼片、花瓣)、果实、草质茎及鳞茎等药材的表面特征如毛茸、气孔、表皮细胞等的观察。质地菲薄的药材可以整体装片；较厚的药材则须撕下表皮然

20、后装片。5。3。1. 整体装片 适用于较薄的叶类、萼片和花瓣。剪取欲观察部位约4mm2 的两小片，一反一正放在载玻片上，加水合氯醛试液，加热透化至透明为至，盖好盖玻片即得。另法，剪取欲观察薄片8 mm2,置试管中加水合氯醛试液，加热透化,然后移至载玻片上,切成相等两部分，将其中一片反过来，与另一片并列，再加12滴封藏液，盖好玻片即得。5。3.2。 表面撕离装片 凡较厚的或新鲜药材，用上法不能使之透化或不便于整体装片。将软化了的或新鲜材料固定住 ，然后用镊子夹住要剥取撕离的部分，小心的撕离，或用解剖刀轻轻割（刮）去不需要的各层组织，只保留表面层(上层或下层），将欲观察的表皮表面朝上,置载玻片上，

21、加透化剂透化后,放冷，加稀甘油1滴，贴上标签，即得。标准操作规程标 题 中药材及其制剂显微鉴定法颁发部门质量管理部编号SOPQC05801页次:7/105.4。 解离组织片制做 适用厚壁组织或输导组织的单个细胞的显微观察。将样品切成段（长约5mm,宽约2mm）或片（厚约1mm)，对于木类或茎类木质，最好切成纵长的小段，然后根据细胞壁的性质,按照下列方法之一进行处理;如样品坚硬，木化组织较多或集成较大群束，可用硝铬酸法或氯酸钾法；对于薄壁组织占大部分，木化组织少或分散存在的样品，可用氢氧化钾法。5。4.1。 氢氧化钾法 置样品于试管中，加5%氢氧化钾溶液23ml，加热至用玻璃棒挤压能离散为止，倾

22、去碱液，用水洗涤后,取出少量,置载玻片上，用解剖针撕开，以稀甘油装片观察。5.4.2。 硝铬法 置样品于小杯中，加20%硝酸与20%铬酸的等量混合液适量，浸没样品，旋转约3060分钟，坚硬的样品需时要长些，也可在水浴上微温，至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去酸液,用水洗涤后，取出少量，置载玻片上,用解剖针撕开，以稀甘油装片观察。5.4.3。 氯酸钾法 置样品于试管中,加硝酸溶液（12ml）及氯酸钾少量，缓缓加热，待产生的气饱和时,再及时加入氯酸钾少量，以维持气泡稳定地发生，至用玻璃棒挤压能离散为止。倾去酸液，用水洗涤后，撕开，封藏。5.4.4. 注意事项 用氯酸钾法制片时，每次加入的氯酸钾不可过多

23、，加热温度不宜过高，否则突沸容易使液体逸出管外.加热时间长短因样品的硬度和木化程度而异,通常约需515分钟。操作过程中产生的氯气有毒,应注意通风。用硝铬酸法解离也可在载玻片上进行。即取一块厚度适当的切片，置载玻片上，滴加氯硝铬酸液使之浸没，放置约20分钟，轻轻压下或移动盖片使之分离，其余操作同前，此法解离的细胞，可以看清其分离的组织部位。5.5. 花粉粒与孢子片制做 取花粉、花药（或小的花)或孢子囊群（干燥样品浸于冰醋酸中软化）,用玻璃棒捣碎，纱布过滤,滤液置离心试管中，离心，取沉淀加新配制的醋酐与硫酸（9:1）的混合液13ml，置水浴上加热23分钟，离心，取沉淀，用水洗涤2次,加50甘油与1

24、苯酚34滴，用品红甘油胶封藏观察。也可直接用水合氯醛试液装片，具体操作同粉末标本片。5.6。 磨片 凡需要观察断面，以一般切片法无法制做的标本，如坚硬的动物药材珍珠、石决明、动物骨骼、矿物药材等可采用磨片法。片的厚度一般为2050m。磨片方法有手工磨制与机器磨制。标准操作规程标 题 中药材及其制剂显微鉴定法颁发部门质量管理部编号SOPQC05801页次:8/105.6.1 手工磨片 选取合适的材料，一般以12mm为度，先置粗磨石(或磨砂玻璃）上,加适量水，用食指、中指夹住材料，在磨石上往返研磨，待两面磨均匀，厚度约数百m后，改用软木塞压在上面，再在细磨石上加水磨,磨至透明时（2050m），用水

25、冲洗，再用95乙醇封藏.5.6。2。 机器磨制 地质矿产部门有专门人员机构与设备制做.6。 显微测量显微鉴定时应用测量方法以细胞内含物等的大小，应用最多的是长度测量，常用的是目镜测微尺与载物台测微尺。6.1。 目镜测微尺 又称目镜量尺或目镜尺.它是在目镜内的一种标尺，是一个直径1820mm圆形玻璃片，中央刻有精确等距的平行线刻度,常为50或100条。目镜测微尺是用以直接测量物体的,但其刻度所代表的长度是根据显微镜放大倍数不同而改变，故使用前必须用载物台测微尺来标化。6.2。 载物台测微尺 又称镜台测微尺或台微尺.它是一种特制的载玻片，中央粘有一小圆形玻片，上刻有将1mm(或2mm）精确等分为1

26、00（或200）小格的细线，每一小格长为10m，它是用以标化目镜测微尺的。6。3 目镜测微尺的标化 以确定使用同一显微镜及特定的物镜、目镜和镜简长度时，目镜测微尺上每一格所代表的实际长度.标化方法 将载物台测微尺置于显微镜台上，按常规对光调焦,并移动测微尺象于视野中央；从镜简中取下目镜，旋下接目镜的镜盖，将目镜测微尺放入目镜简中部的光栏上（应正面向上）旋上目镜盖后返置镜简上,此时在视野中，除镜台测微尺的象外，还同时可观察到目镜测微尺的分度小格，移动镜台测微尺和旋转目镜，使两种量尺的刻度平行。左边的“0”刻度重合,寻找第二条重合刻度。记录两刻度的读数，并根据比值计算出目镜测微尺每小格在该物镜条件

27、下所相当的长度（m）。例如：接目镜头为10，接物镜为40时，目镜测微尺每17小格相当于载物台测微尺4小格，则目镜测微尺每小格的长度为410m172。35m.6.4. 测定细胞及细胞内容物的方法将载物台测微尺取下,换以装有待测的标本片.对光、调焦，移动载片，使需测量的目的物置于目镜测微尺范围内，调清物象，计数出目的物占测微尺的小格数,乘以目镜测微尺每一小格的长度值即得。标准操作规程标 题 中药材及其制剂显微鉴定法颁发部门质量管理部编号SOPQC05801页次:9/10计算公式： 例如：测得淀粉粒长 20小格，每小格长2.35m，202.35m47m6.5. 注意事项6.5.1. 测量通常是在高倍

28、镜下进行，因目镜量尺的每一小格的长度较大，结果较为准确。但如测量较长的物体如纤维、非腺毛等时,则在低倍镜下较为方便。6。5.2。 每次测量记录下数据,并分析数据最小值、 最大值和多见值（m）.如浙贝母淀粉粒直系为656m，表示最小值和最大值;如为64056m，中间的数值表示多见值。测量直径时，应以物体中部为准。6。5。3. 目镜测微尺所代表的长度随不同目镜与物镜配合而异，因此在检验时，应将专用的目镜测微尺，在所用显微镜不同倍数的目镜与物镜组合后进行测量其长度值,全部测量后记载于检验记录或将数值贴在显微镜镜座上，备用.6.5。4。 测量时，如有大小与规定有差异时，允许有少数略高于或略低于规定的数

29、值。7。 显微鉴别法注意事项7.1. 粉碎用具用毕后，必须清理干净，干燥后才能使用于另一药材。7。2. 所用盖玻片和载片应绝对干净.新片要用洗液浸泡或用肥皂水煮半小时，用清水冲洗,再用蒸馏水冲洗12次,置于7090乙醇中，取出,烘干。7。3. 进行显微鉴别时应有一定的步骤，一般先进行甘油醋酸片的观察，后进行水合氯醛片观察,最后再进行滴加度剂或结合理化试剂的显微观察.所以在检验中，首先观察淀粉粒,不论其大小和多少，首先描述，其次是其它的显微特征.7.4. 为提高显微鉴别的正确性，可与对照药材或已知顺利实现品种的药材对照观察。7。5。 成方制剂鉴别前，应了解处方组成，分析处方中各药材的主要鉴别特征

30、及其量的多少，进行显微观察时，至少要观察5片以上，使特征不致遗漏。标准操作规程标 题 中药材及其制剂显微鉴定法颁发部门质量管理部编号SOPQC05801页次：10/108。记录与报告记录要求详细、清晰、明确、真实。8.1. 组织特征的记录，应从外至内的次序进行，对有鉴别意义的特征需详细描述；并要绘制简图。有条件时可进行显微照相.8.2。 粉末显微鉴别时，先记录原粉末的色泽、气味。然后边观察边记录。注意观察的全面性.观察每一张片，应自左上至右下，呈“之”字形扫描,逐渐移动粉末片,全面观察应找的特征,将每一个特征一一描述及绘图,在观察与描绘时，即应测量其长度,分析统计其长度（最大值、多见值、少见值

31、）.描述特征时，应根据先多后少的顺序,将多见、易见的特征先加以描述，顺次而为少见的,最后方描述偶见的，并在特征项下加注“多见”、“少见字样。描述先着重特殊的组织、细胞和内含物。对各类药材均具有的一些基本组织，如叶类药材有栅栏细胞、海绵细胞、细小导管等可不作重点描述.8。3。 绘图时，应注意特征明确、边缘清晰.绘图方法有徒手或采用显微描绘仪。徒手绘图时，一边用左眼向显微镜内观察,一边睁开右眼将视野中特征图像用铅笔（HB铅笔画粗线、4H画中线、6H画细线)转绘于记录纸上.如采用显微描绘仪或显微摄影，可根据各仪器的操作要求进行,并要注明放大倍数,或加比例尺.9。 结论：根据检验的显微特征记录与标准记载或对照药材比较是否相符，断定其是真假优劣.