仪器分析笔记《高效液相色谱分析》10页精选文档.docx

1、仪器分析笔记高效液相色谱分析10页精选文档第二章 高效液相色谱分析教师范读的是阅读教学中不可缺少的部分，我常采用范读，让幼儿学习、模仿。如领读，我读一句，让幼儿读一句，边读边记；第二通读，我大声读，我大声读，幼儿小声读，边学边仿；第三赏读，我借用录好配朗读磁带，一边放录音，一边幼儿反复倾听，在反复倾听中体验、品味。 2.1 高效液相色谱法概述（掌握）宋以后，京师所设小学馆和武学堂中的教师称谓皆称之为“教谕”。至元明清之县学一律循之不变。明朝入选翰林院的进士之师称“教习”。到清末，学堂兴起，各科教师仍沿用“教习”一称。其实“教谕”在明清时还有学官一意，即主管县一级的教育生员。而相应府和州掌管教育

2、生员者则谓“教授”和“学正”。“教授”“学正”和“教谕”的副手一律称“训导”。于民间，特别是汉代以后，对于在“校”或“学”中传授经学者也称为“经师”。在一些特定的讲学场合，比如书院、皇室，也称教师为“院长、西席、讲席”等。 2.1.1 高效液相色谱法的特点要练说，得练看。看与说是统一的，看不准就难以说得好。练看，就是训练幼儿的观察能力，扩大幼儿的认知范围，让幼儿在观察事物、观察生活、观察自然的活动中，积累词汇、理解词义、发展语言。在运用观察法组织活动时，我着眼观察于观察对象的选择，着力于观察过程的指导，着重于幼儿观察能力和语言表达能力的提高。 1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高

3、效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。目前，出现使用1.0m填料的超高压液相色谱。 B、流动相变化目前，出现120220超热水为流动相、FID和FPD检测器的HPLC。C、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC与MS、NMR、IR联用的多维液相色谱法。4、高效液相色谱法的特点高压 ：采用高压输液设备，（150350） 105 Pa 高速：分析速度快；高效：柱效很高。（n30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；高灵敏度：109g（UV）；1011g （荧光检测）。5、高效液相色谱法的局限溶剂用量

4、太大；缺乏诸如气相色谱使用的TCD、FID通用型检测器；不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离；不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa1MPa压力。2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：若将上式简化，可写作：这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。1、涡流

5、扩散项式中：填充不规则因子；：填料平均直径。 它与载体流速无关； 若柱子填充均匀，填料的颗粒也均匀，则柱效高；若填充不均匀，柱效低。2、纵向扩散项式中：常数；：扩散系数；：流动项的线速度。 由于分子在液体中的扩散系数比在气体中要小45个数量级，因此在液相色谱中，当流动相线速度大于时，这个纵向扩散项对色谱峰扩展的影响实际上是可以忽略的，而气相色谱法中这一项却是重要的。3、传质阻力项（1）固定相传质阻力项式中：与（容量因子）有关的系数；：固定液厚度；：扩散系数。 固定相引起峰扩展解决办法： 液液分配色谱：使用薄的固定相；吸附、排阻和离子交换色谱：使用小颗粒填料。（2）流动相传质阻力项流动的流动相中

6、的传质阻力项式中Cm：常数（与k有关，其值取决于柱直径、形状和填充的填料结构）；Dm：流动相中扩散系数；dp：为填充物的平均直径。 滞留的流动相中的传质阻力项 原因：多孔固定相造成的部分流动相滞留。式中：常数（与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关）。 固定相的粒度其微孔孔径传质途径传质效率柱效。2.2.2 液相色谱的曲线1、液相色谱与气相色谱曲线的区别HPLC板高H比GC小一个数量级，说明HPLC柱效高；对于HPLC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。2、降低H，提高柱效的方法减小填料粒度；减小填料孔穴深度；用低粘度溶剂作流动相；采用低速流动相（通常：）。2.3 高效液相色谱

7、法的主要类型及其分离原理（理解）根据固定相和分离机理的不同，液相色谱法可分为： 1、液液分配色谱法（LLC）2、液固吸附色谱法（LSC） 3、离子对色谱法（IPC）4、离子交换色谱法（IEC）5、离子色谱法（IC）6、空间排阻色谱法（SEC）2.3.1 液液分配色谱及化学键合相色谱 1、液液分配色谱基于组分在两相间的分配容量因子的差异而实现分离的。A、固定相：载体+固定液 全多孔型担体 ，-氧二丙腈 表面多孔型担体 聚乙二醇 异三十烷（角鲨烷）B、载体：硅胶；C、分类：根据固定液和流动相（溶剂）的极性不同，可分为正相液液分配色谱和反相液液分配色谱。 为了避免固定相流失，固定相和流动相极性要相差

8、大。（与GC不同，GC：极性相似相溶 ） 分析对象与固定液极性一致； 正相色谱：固定液为极性，流动相为非极性（固定液极性流动相极性）； 反相色谱：（应用最普及） 固定液为非极性，流动相为极性； 由于液液分配色谱固定相易流失，现已被化学键合相色谱所替代。D、原理：由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。当达到平衡时，物质的分配同样服从下式：式中：分配系数；：容量因子；：溶质在固定相中的浓度；：溶质在流动相中的浓度；Vm：流动相体积；VS：固定相体积。 分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大，后出峰； 液相色谱法中，流动相的种类对分配系数有

9、着较大的影响。E、应用：液液色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。 2、化学键合固定相色谱通过化学反应将有机基团键合到硅胶（载体）表面上，代替机械涂渍的液体固定相。这种固定相避免了固定相流失，大大改善了固定相功能，适用于梯度洗脱，分离选择性大大增加。 化学键合相色谱的出现，是HPLC的重大突破； 化学键合色谱是HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三； 它适用于分离几乎所有类型的化合物。2.3.2 液固吸附色谱法流动相：液体，固定相：吸附剂 1、原理：基于组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而分离的。组分分子结构与吸附剂几何结构相适应时，易于吸附。2

10、、固体吸附剂主要类型：极性的硅胶（应用最广）； 氧化铝；分子筛；非极性的活性炭 。3、应用：分离几何异构体；分离含极性基团相同但数目不同的试样，但不能用于分离同系物；分离具有中等分子量的非极性或极性的、非离子型的油溶性样品。4、缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象2.3.3 离子对色谱法 分离强极性的有机酸、碱存在的问题： 用正相色谱：保留值太大、峰拖尾，甚至不出峰 用反相色谱：保留太小1、定义：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对电子或反电子）加入到流动相或固定相中，使其于溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。2、分离机理离子对色谱的分离机理有不同

11、的假说，现以离子对分配机理说明：在色谱分离过程中，流动相待分离的有机离子X+（也可以是带负电荷的离子）与固定相或流动相中带相反电荷的对离子Y结合，形成离子对化合物X+Y，然后在两相中分配： 由于离子对疏水性质不同，导致各组分保留时间不同； 离子对试剂： 分析碱烷基磺酸钠； 分析酸四丁基季胺盐。2.3.4 离子交换色谱法 1、固定相：离子交换树脂流动相：水缓冲溶液；甲醇；乙醇+水缓冲溶液2、原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H+M+RSO3M+ H + 阴离子交换：RNR4OH

12、+XRNR4 X+OH3、适合于分析：在溶液中能形成离子的组分有机物和生物物质，如：蛋白质、氨基酸、核酸等的分离。2.3.5 离子色谱法 离子色谱以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象，近30年有了迅速发展。1、离子交换色谱存在问题：用电导检测器检测，流动相是强电解质，强背景完全掩盖待测离子信号。 2、抑制柱：使高背景电导的流动相转变为低背景的流动相。 1975年Small提出在离子交换柱后，再串结一根抑制柱。 抑制柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。如：分析阴离子样品Br，NaOH为流动相；抑制柱为RH+；通过抑制柱后：NaOH +RH+ H2O +RNaNaBr +RH+ HB

13、r +RNa 由于H+淌度为Na+的7倍，提高了检测的灵敏度； IC还可以分析氨基酸、糖类及有机阳离子； 由于抑制柱要定期再生，现代IC中，多采用在离子交换柱后接抑制器来实现以上目的。3、阴离子分析示例：七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离各组分含量：350 ppm； 2.3.6 空间排阻色谱法（凝胶色谱法）根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术1、分离原理： 固定相凝胶内有一定大小的孔穴； 分子体积大的不能渗入孔穴而被排阻，较早被淋洗出来； 小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。 2、分离范围：相对分子质量20002000000之间合成高分子的分子量（分布）的测定。3、空间排阻色谱的特点：可提

14、供分子尺寸、结构信息；易检测保留时间短，峰窄，可采用低灵敏度检测器；柱寿命长固定相与分子间作用力弱；分子质量差别大于10%才能分离。 总结：选择色谱分离方法的一般原则易挥发、分子量200的样品：GC；分子量在2002000的样品：HLPC；分子量2000：GFC。2.4 液相色谱固定相（了解）2.4.1 液液色谱、键合相色谱及离子对色谱固定相1、担体（1）全多孔型担体 由直径为510m 的硅胶微粒凝聚而成； 颗粒细，孔较浅，传质速率快，柱效高； 是目前应用最广泛的担体。（2）表层多孔型担体 实心玻璃球（3040m ）外面覆盖一层多孔活性材料； 孔层厚度小、孔浅，出峰迅速、柱效高； 多孔层厚度薄

15、，容量低。2、化学键合相固定相： 硅氧烷型键合相应用最广泛。 十八烷基键合硅胶（Octadecylsilane, ODS ，C18）最常用制备： 正相色谱代表性固定相：改性硅胶、氰基柱； 反相色谱代表性固定相：C18；C8； 反相色谱是当今液相色谱的最主要分离模式。 化学键合固定相特点：固定相传质很快。表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多固定液不易流失，柱寿命长。由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，增加色谱柱稳定性和寿命。可以键合不同官能团， 提高了应用范围和选择性。特别适合于梯度洗脱，有利于高灵敏检测和收集馏分。2.4.2 液固吸附色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱固定相1、液固吸附色

16、谱法固定相 硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 常用5-10微米的硅胶微粒。2、离子交换色谱固定相（1）薄层型离子交换树脂（2）离子交换键合固定相3、空间排阻色谱固定相（1）软体凝胶（2）半硬质凝胶（3）硬质凝胶2.5 液相色谱流动相（了解）HPLC流动相是液体，选择余地大；它参与固定相对组分的竞争（与GC不同）。1、对流动相溶剂的要求是：（1）能溶解样品，但不与样品反应。（2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。（3）粘度要尽可能小（保证高的渗透性和柱效）（4）与所用检测器相匹配。（5）高纯度、易精制、价格尽量便宜。 正相色谱代表性流动相：正己烷。 反相色谱代表性流动相：甲醇/水、乙腈/水、水

17、和无机盐的缓冲液2、在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇 乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。2.6 高效液相色谱仪（了解）2.6.1 高压泵1、作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱柱HPLC柱径较细，所填固定相粒度很小，对流动相的阻力较大，高压泵可使流动相能较快

18、地流过色谱柱。2、工作压力：150105350105Pa，流量可调3、分类：恒流泵和恒压泵（1）往复式柱塞泵；（2）气动放大泵。2.6.2 梯度洗提1、原理：用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。 梯度洗提装置所起的作用与GC中的程序升温十分相似。区别： 梯度洗脱：通过改变流动相极性、pH值和离子强度等改变k值； 程序升温：通过改变温度达到改变k值的目的。2、梯度洗提特别适合复杂样品的分离2.6.3 进样装置1、注射器进样装置（停留进样，性麻烦；不准，重现性差）2、高压定量进样阀

19、通过六通阀直接向压力系统进样，不必停止流动相流动。 由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复好。 3、六通阀工作原理：2.6.4 色谱柱 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成； 为了使工作压力不致过高，柱长比较短。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长25cm。 柱内装有510m的填料 填充方式：干法填充、湿法填充2.6.5 检测记录系统 1、对检测器的要求：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小、噪声小、响应快。2、HPLC常用的检测器有： 紫外检测器 荧光检测器 示差折光检测器 电导检测器 蒸发光散射检测器 （1）紫外检测器 检测原理同UV-Vis方法一样。 采用微量吸收池：光程为

20、210mm，体积约为110 L。 HPLC中约有80%的物质可在254nm或280nm处产生紫外吸收。 要求：溶剂必须能让所选择的光透过。 二极管阵列检测器（diode-array detector, DAD，或PDA） 二极管阵列检测器快速、方便，近些年应用普及。 DAD无需停留扫描，可观察色谱流出物的动态光谱。 经计算机处理可以得到三维色谱光谱图。（2）荧光检测器（Fluorescence Detector） 利用试样的荧光特性来检测。 灵敏度比UV检测器高23个数量级。 特别适合药物和生物化学样品分析：稠环芳烃、氨基酸、蛋白质、酶 局限性：应用范围窄（3）示差折光检测器（RI）依据样品组

21、分与流动相对光的折射率不同来检测v 特点 是一种通用型检测器； 灵敏度低（低UV等13个数量级）； 温度要求严格，不能用于梯度洗提；v 应用：无紫外吸收的有机物、高分子化合物、糖类、脂肪烷烃v 凝胶色谱必备的检测器，也常用在制备色谱中。（4）电导检测器（Electrical Conductivity Detector）离子色谱必备的检测器 根据物质电离后产生电导变化来测定电离物质含量。 主要部件：电导池 特点和要求：需恒温，不能用于梯度洗提 pH7，不灵敏，（5）蒸发光散射检测器（ELSD）基于溶质的光散射性质的检测器 构成：雾化器、加热漂移管、激光光源和光检测器 原理：色谱柱流出液雾化后通过

22、加热漂移管；流动相中溶剂被蒸发，留下溶质；激光束照在溶质颗粒上产生散射光；散射光信号电信号。 特点和应用： 属通用型检测器。 适合于无紫外吸收、无电活性和无荧光发射样品的检测。 优于IR：信噪比高，可梯度洗提表2-6-1 HPLC中常见检测器的基本特性2.7 高效液相色谱分离类型的选择（了解）2.7.1 色谱分离类型的选择 1、根据相对分子质量选择 200以下 气相色谱法 200 2000 液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。 高于2000 凝胶色谱法2、根据溶解度选择 水溶性样品 离子交换和液液分配色谱法； 微溶于水、易电离样品 用离子交换色谱法； 油溶性或相对非极性样品 液-固色谱法。3

23、、根据化学结构选择 异构体的分离 液-固色谱法； 同系物和具有不同官能团化合物 液液分配色谱； 生物大分子或高分子聚合物 凝胶色谱法； 离子基团和能电离基团组分 离子交换色谱。表2-7-1 液相色谱分离类型选择参考表2.8 高效液相色谱应用实例（了解）2.8.1 高效液相色谱应用领域与分析对象举例 2.9 液相制备色谱（了解） 有机复杂样品的组成、结构分析时常需要纯化制备色谱成为最有力的手段 制备色谱：以色谱技术来分离、制备较大量的纯组分2.9.1 液相制备色谱的特点与优势1、与分析色谱的区别： 柱容量大 有组分收集器2、用HPLC制备的优势： 分离条件温和 一般不破坏试样 有利于试样收集2.

24、9.2 液相色谱制备的几个主要问题1、色谱柱容量制备柱比与分析型柱柱容量要大。 分析型柱：内径：4.6 mm 制备柱： 内径：10mm，20 mm ，50 mm 一次可以制备0.11mg纯品 制备色谱主要限制之一：进样量柱效分离度；2、液相制备色谱方法：在分析型HPLC试验，优化，试出最大允许量。3、液相制备色谱仪 检测器后增加自动馏分收集器； 可将试样组分按顺序收集在玻璃管内。2.10 毛细管电泳（CE）（了解）2.10.1 毛细管电泳的基本原理与仪器装置1、基本原理v 电泳：在电场作用下，带电粒子在介质中定向移动。v 毛细管电泳：利用被分析离子在电场作用下移动速率不同而达到分离目的。v C

25、E分析对象：在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。 它有多种分离模式 可以分离离子和中性分子 可以采用HPLC中的各种检测方法（1）经典电泳的局限性 电场强度低： 离子迁移速度慢，分离时间长，组分扩散严重，分离效果差。 焦耳热使组分扩散严重（电泳电流大） 。（2）高效毛细管电泳在技术上的两项重要改进： 采用了极细内径的毛细管（2575m），减小了焦耳热导致峰扩展（毛细管散热效率高） 采用了数千伏的高压（2030kV ），加高电场后，离子迁移速度加快，减小了组分扩散。v 电渗流现象：在电场作用下，管中溶液整体向负极移动，形成电渗流分离过程： 正离子：电泳、电渗同向最先出峰 中性粒子：迁移速度=电

26、渗速度，次之 负离子：电泳、电渗反向 最后出峰2、仪器装置 毛细管柱中充入缓冲溶液，柱两端置于两个缓冲池中。 在缓冲池两个铂电极加高压。 试样从一端进入，在另一端检测器。 检测器同HPLC，常用紫外光度检测器（DAD）（1）CE柱效：（HPLC：,与此不同）式中ep:电泳淌度；eo：电渗淌度；V：外加电压；D：扩散系数。淌度：离子在介质中单位时间和单位场强下移动的距离。 CE比HPLC分辨能力更高：CE为平流，峰展宽小；HPLC为层流，峰展宽大；CE没有死体积存在。（2）CE与HPLC分离的差异CE：柱效高（传质阻力为零，分子扩散很小）HPLC：柱效较低（存在涡流扩散、传质阻力和分子扩散）CE

27、：依据迁移速率差异分离； HPLC：依据分配系数差CE适合大分子分离CE：（分子量越大，柱效越高）HPLC：（3）CE：分离效率高、检测灵敏度高，样品用量极少。 在生物医药分析中显示出突出的优越性。2.10.2 毛细管电泳的分离模式与应用1、毛细管区带电泳（CZE） 基于组分间荷质比的差异分离 最为常见2、毛细管凝胶电泳（CGE） 毛细管柱内交联生成凝胶。 具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离 可分离测定蛋白质、DNA等。3、毛细管胶束电动色谱（MEKC）解决中性分子的分离 在缓冲液中加入离子型表面活性剂， 形成一疏水内核、外部带负电的胶束， 样品受电场和“假固定相”之间分配， 疏水性组分留在胶束相时间长，保留时间长4、毛细管等电聚焦（CIEF）根据样品等电点不同实现分离的技术。5、毛细管等速电泳 （CITP） 使用两种电解质（前导电解质、尾随电解质） 样品在两个电解质界面中间，逐步分离。6、毛细管电渗色谱（CEC） 在毛细管中填充液相色谱固定相载体。 与HPLC区别是以渗透流为驱动力。