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1、硕士学位论文 猪细胞因子检测方法的建立与初步应用硕士学位论文多头带绦虫Tmls基因的克隆与原核表达目录中文摘要.，.，.I英文摘要.，.，.n目录.，.，.，.i第一章文献综述.，.1动物绦虫坳病疫苗研究进展.1l天然抗原.，.，.11.1六钩拗及其分泌/排泄物二，.，.，.112原头拗及其组分抗原.，二.21.3细胞苗.，.，.32基因工程疫苗.，.32.2重组蛋白疫苗.4 2.2.145w家族.，.，.、.4 2.2.216kDa和 18kDa抗原.，.，.，6 2.2.3Eg95和Em95.72.2.4多肤疫苗.，.82.3核酸疫苗.，二，.，.，.，.103疫苗研究展望.，.，.，.1

2、24本试验的目的意义.，12第二章多头带绦虫Tmls抗原基因的克隆和原核表达.，.131材料和方法.，.13 1.1材料.，.，.、，.131.1.1虫株和实验动物.，.131.1.2主要试剂.，.，.，.131.1.3菌株及质粒载体.，.141.1.4主要仪器设备.141.1.5培养基及常用液体的配制.，.141.1.6主要生物信息数据库和计算机软件.，.161.2试验方法.，.，.，.161.2.1多头带绦虫虫卵的收集和六钩坳总RNA的提取.。.161.2.2多头带绦虫Tmls基因的克隆.，.17l.2.3Tm18基因原核表达载体构建.，.，.201.2.4重组pGEX一4T-1一Tmls

3、质粒在大肠杆菌中的诱导表达.211.2.5重组蛋白的纯化.，231.2.6重组蛋白的免疫印迹(Westem一Blotting)检测.，.24脚 1.2.7重组蛋白免疫小鼠的抗体水平的检测.252结果.262.1多头带绦虫Tmls基因的克隆.，.262.1.1多头带绦虫Tmls的扩增和克隆质粒的鉴定.262.1.2多头带绦虫Tmls基因测序鉴定.，.262.1.3多头带绦虫Tmls基因的序列分析.，.，.，.262.1.4多头带绦虫Tmls基因的蛋白质生物信息学分析.292.2重组Tmls基因的亚克隆.342.2.1重组Tmls基因片段的扩增.，.34 2.2.2pMD18一T-rTmls质粒的

4、鉴定.34 2.3pGEX一4T-rTmls重组表达质粒的构建与鉴定.34 2.4pGEX一4T-rTmls重组质粒表达产物的SDS一PAGE电泳分析.342.5重组蛋白的纯化和免疫印迹检测.，.362.6重组蛋白免疫小鼠的抗体水平的检测.，.，.372.6.1小鼠血清中lgG的检测结果.，.372.6.2小鼠血清中lgGI的检测结果.，.382.6.3小鼠血清中IgGZa的检测结果.。.392.6.4小鼠血清中IgE的检测结果.402.6.5小鼠血清中IgM的检测结果.413讨论二，.423.1关于绦虫的18kDa抗原.，.423.2多头带绦虫的Tmls抗原.423.3多头带绦虫Tm18的表

5、达.，.，.，.，.，.。.433.4重组抗原的免疫活性.，.，.444结论与创新点.，一444.1结论.，.，.，444.2创新点.，.，.45参考文献，.，.，.，.46致谢.，.50攻读学位期间发表的学术论文.51第一章文献综述动物绦虫蜘病疫苗研究进展动物绦虫蝴病是带科绦虫的中绦期幼虫寄生于中间宿主体内所引起的寄生虫病，包括猪囊尾坳病 (Cystieereuseellulosae)、牛囊尾坳病 (Cystieereusbovis)、细颈囊尾坳病 (Cystieereustenuieollis)、羊囊尾坳病 (Cystieercusovis)、豆状囊尾坳病 (Cystieereuspist

6、iformis)、脑多头坳病(Coen二 5cerebralis)、连续多头坳病(C oenurusSerialis)、棘球坳病(Echinocoeeiosis)、链尾拗病(Strobiloeercosis)等。中间宿主吞食了含有虫卵的食物和水后，在胃液和肠液的作用下，六钩拗从虫卵中孵化出来并被激活后，钻入肠粘膜侵入宿主的体内，再通过体液循环到达其定居的组织和器官，并发育成为成熟的中绦期幼虫。动物绦虫坳病是一种慢性的，消耗性的疾病，多数并不致死，包括人在内的多种哺乳动物都可以感染。绦虫蝴病不但在经济上给畜主造成了很大损失，且由于该类疾病可在人和家畜、人和野生动物、家畜和野生动物之间传播，危害人

7、体健康，因此，具有重要的公共卫生学意义。对于动物绦虫坳病的防控，长期以来存在两种方法:一种是药物防治;另外一种是免疫预防。由于寄生虫抗原的复杂性及免疫逃避机制的存在，抗原来源的局限性，疫苗的成本过高等因素的制约，免疫预防无法在生产实践中大规模应用。然而，随着寄生虫抗药性的出现以及人们对食品中药物残留的关注，免疫预防又重新受到关注，寄生虫疫苗的研制又有了新的动力。绦虫坳病是作为一类重要的人畜共患病，研究人员格外关注，随着对绦虫坳病研究的不断深入，绦虫坳病的疫苗研究也取得了一定的突破。下文主要从抗原的角度阐述绦虫病疫苗的研究现状。1天然抗原1.1六钩蜘及其分泌/排泄物早期绦虫坳病疫苗与其它的寄生虫

8、病疫苗一样，主要的抗原成分为天然抗原。天然抗原主要来自于六钩坳及其分泌/排泄物(Es)，原头拗及其分泌/排泄物、囊液、囊壁等，其经过处理后用于制备的绦虫坳病疫苗。在上世纪的60一70年代，Gemmell就发现通过肌肉注射活的同种或异种绦虫虫卵，可以使绵羊产生有效的免疫保护反应川;而经过冻融或超声破碎处理后则不会lz。然而，Rickard和Ben设计了一个特殊装置，排除了六钩坳对实验的影响，证明了绵羊带绦虫和带状绦虫的六钩坳排泄/分泌产物可刺激宿主产生免疫保护反应I3j。verster等I1用多头绦虫的六钩坳分泌性抗原 (oncosPheresecretoryAntigenosA)间隔两周免疫四

9、月龄羔羊，再用虫卵感染，动物剖检结果显示免疫组的感染率为16.6%(5/30)，而对照组为72.7%(8/11)。Pathak等5发现猪带绦虫六钩坳的E/s也能诱导机体产生对攻击感染的高度抵抗力，免疫猪和对照组之间猪囊尾坳平均数有非常显著性差异，8头免疫猪的囊尾坳平均为19个，而8头对照猪的囊尾坳平均为369个。随后的研究证实，其它带科绦虫的六钩坳体外培养的上清液和六钩坳粗提物都有抗绦虫蝴病的感染的效果，并发现这种抗原是一些能被尿素溶解的膜结合蛋白6。这一基础研究为后来的基因工程疫苗的研究奠定了基础。国内也进行了相似的研究，张文宝等7l用多头带绦虫六钩蝴代谢物制备的疫苗，免疫12周龄的羔羊(相

10、当于13000个六钩坳的代谢产物)，24天后再用7500个虫卵感染，结果显示相对于对照组(6只全部死亡)免疫组的保护率为75%(9/12)。同时田间实验的感染率下降了70.7%(11.6%/15%)。此外，朱兴全等l8用细粒棘球绦虫六钩拗排泄分泌(ES)抗原加入弗氏不完全佐剂两次免疫绵羊后，用1000枚虫卵攻击感染，七个月后的剖检结果显示其减囊率达%.04%。Fan等191分别用猪带绦虫和亚洲带绦虫 (T.asiatica)的灭活六钩坳皮下免疫猪，一个月后用10000个活虫卵攻击感染。结果免疫组平均检出4个活囊尾坳和625个钙化或变性的囊尾坳，对照组则检出2567个活的和10个钙化或变性的囊尾

11、拗。1.2原头蜘及其组分抗原在绦虫拗病的疫苗研究中，有些人将原头拗及其组分制成疫苗免疫中间宿主。曾经用过的抗原有囊尾坳的粗提物、囊尾坳的头节抗原(SPA)、囊尾坳的囊液及囊壁蛋白。Molin硕等!“用猪囊尾坳制备的免疫复合物间隔7天接种猪两次后，用猪带绦虫卵攻击感染。发现免疫组与对照组相比保护率达842%(63.1/74.9)。在墨西哥Guerrero州北部猪囊尾坳病流行区进行了田间试验，在试验开始时通过流行病学调查发现猪舌猪囊尾坳的感染率为2.4%(62/2650)，以 150林g猪带绦虫囊尾坳粗抗原免疫后，感染率下降到了0.45%l”。Naseimenlo等2用猪囊尾坳头节抗原 (seol

12、exprotein antigenspA)，加福氏不完全佐剂(Freund， 5adjuvantIFA)或棒状杆菌(Co叮nebaeteriump一 mCP)后间隔 20天皮下注射猪3次，10天后用 10000个猪带绦虫卵感染。免疫组与对照组相比保护水平达71.43%和75.00%，并可检测到高滴度的的特异性抗体。Manoutcharianl3等曾用带状带绦虫囊液的56、66和74kDa蛋白制备猪囊虫疫苗，免疫猪后用10000个的猪带绦虫虫卵感染，结果获得了较高的保护84.0%(0.042 2/0.05)。此外，国内的窦兰清【4，”l等对多头坳囊液及囊壁抗原的免疫保护效果进行了研究，用多头坳抗

13、原三次免疫羊后，攻击感染2500个多头绦虫虫卵，囊壁抗原免疫组羊只获得全保护(3/3)，囊液免疫组、原头节抗原免疫组和原头节E/S抗原免疫组羊只均获得部分保护(3/4、2/3、2/3)。朱兴全等116研究了细粒棘球绦虫原头节及其E/S抗原的免疫原性，原头节ES抗原免疫绵羊诱导很强的免疫保护力，其减囊率达92.07%，原头节可溶性粗抗原为74.89%。1.3细胞苗尽管以天然抗原为主要组分制成的疫苗获得了不错的免疫保护效果，然而由于来源的局限性以及生产工艺的不健全，导致其无法大规模的生产，在实践生产中无法广泛应用。为了解决抗原的来源的局限的问题，后来出现了绦虫坳的组织细胞苗。在对绦虫坳病的疫苗进行

14、研究的同时，研究者一直在不断的探索建立绦虫的细胞系。早期对绦虫的六钩坳的体外培养实验发现，六钩坳经过一段时间培养后，可以发育成早期的原头拗。因此，后来的细胞系建立多以原头坳为细胞来源。Fiori等117对不同种源的细粒棘球拗的生发层细胞进行培养，发现牛源细粒棘球坳最容易培养，其培养了720天。陆家海等【“从细粒棘球坳病人体内获取生发层和原头节作为培养材料，首次成功培育出一株人源细粒棘球坳细胞系(13G一5)。该细胞系主要以成纤维型细胞为主，呈贴壁生长;经接种小鼠后能形成包囊样结构;接种鼠产生对囊液抗原的特异性抗体;用该细胞系细胞的代谢物作为粗制抗原进行的免疫预防接种实验可使60%的小鼠获得保护

15、。李靓如等I9建立了猪囊尾拗cc一97免疫细胞系，并用细胞和代谢产物作为抗原研制疫苗，进行了的动物保护实验。结果显示细胞系细胞(颗粒抗原)和代谢产物(可溶性抗原)均具有高度的免疫原性，其中用300万个细胞制成的油乳剂灭活疫苗的完全保护率达50%，减虫率达92.31%。张中庸等120用该疫苗在全国进行了大范围的区域性免疫试验，其平均保护率为%.18%。2006年4月猪囊尾蝴细胞灭活疫苗获得了农业部的批准，并颁发了新兽药注册证书，证号:(2006)新兽药证字09号。2基因工程疫苗现代生物技术在寄生虫学的发展，尤其是分子生物学技术的应用，加之寄生虫免疫学研究的进一步深入，保护性抗原分子的鉴定及抗原基因的分子克隆不断取得进展，为研制基因工程疫苗防治寄生虫病奠定了基础。三十多年来，经过科学家的不懈努力，绦虫坳病的基因工程苗取得了令人鼓舞的成就，一些疫苗还进行了商业生产。2.2重组蛋白疫苗 2.2.145w家族应用分子生物学技术，1989年Johnson等f2首先开发出了羊带绦虫 (Taeniaovi，)基因工程疫苗一45W