溶液各种配制.docx

1、溶液各种配制附录：常用试剂配制及应用一、常用缓冲液、试剂的配制碳酸盐缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Buffer)由于碳酸盐pH值偏碱，因此，常用于pH9的缓冲液配制（附表1）。附表1.0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.210.7）pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)9.24.046.010.027.522.59.37.542.510.130.020.09.49.540.510.233.017.09.513.037.010.335.514.59

2、.616.034.010.438.511.59.719.530.510.540.59.59.822.028.010.642.57.59.925.025.010.745.05.0磷酸缓冲液(Phosphate Buffers，PB)磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa 值，所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽。NaH2PO4：pKa12.12，pKa27.21； Na2HPO4：pKa17.21，pKa212.32。另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰

3、胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。磷酸缓冲液的优点为：可配制成不同离子强度的缓冲液；适用pH缓冲范围较宽；受温度影响缓冲液pH值变化较小；离子强度对缓冲液pH影响较小，如0.1mol/L缓冲液稀释10倍其pH变化小于0.1。磷酸缓冲液的缺点是：磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；可能干扰某些生物化学反应过程，如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。NaH2PO4的pH值偏酸性，可用作pH10的缓冲液。而pH68的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要NaH2PO4与Na2HPO4两种磷酸盐混合

4、配制（附表2）。附表2. 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.78.2）pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)5.793.56.57.039.061.05.892.08.07.133.067.05.990.010.07.228.072.06.087.712.37.323.077.06.185.015.07.419.081.06.281.518.57.516.084.06.377.522.57.613.087.06.473.526.57.710.589.56

5、.568.531.57.88.591.56.662.537.57.97.093.06.756.543.58.05.394.76.851.049.08.14.295.86.945.055.08.23.097.0磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-buffered saline, PBS)磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用PBS配制如下。NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO40.24g在800ml蒸馏水中溶解，用HCl调节溶液的pH值至7.27.4加水定容至1L，15psi（1.05kg/cm2）高压灭

6、菌20min，室温保存备用。Tris缓冲液（Tris-HCl Buffer, TB）Tris的pH值偏于碱性，因此，通过添加HCl调节pH至所需值，Tris-HCl缓冲液的离子强度（mol/L）是专指Tris的浓度，如某一特定pH的0.05 mol/L Tris缓冲液的配制是将50ml 0.1 mol/LTris碱溶液与附表3所示相应体积（ml）的0.1 mol/L HCl混合，加水至将体积100ml，即为0.05 mol/L Tris缓冲液。另外，按附表3制备的缓冲液，由于试剂来源的不同，缓冲液pH可能与所需略有差异，此时可通过稍许减少或增加HCl用量，精细调节pH至所需值。附表4.0.05

7、 mol/L Tris缓冲液pH需0.1 mol/L HCl（ml)pH需0.1 mol/L HCl（ml)7.145.78.126.27.244.78.222.97.343.48.319.17.442.08.417.27.540.38.514.77.638.58.612.47.736.68.710.37.834.58.88.57.932.08.97.08.029.2Tris盐缓冲液（TBS）：Tris盐缓冲液是在Tris缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，TBS也适用于做细胞缓冲液，常用TBS配制如下。8g NaCl、0.2g KCl以及3g Tris溶解于800ml蒸馏水中，

8、加入0.015g酚红并用HCl调pH至7.4用蒸馏水定容至1L，分装后在15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保存。现在常用Tris盐缓冲液通常不加pH指示剂，而且该溶液如果不用于细胞培养，通常不加KCl及酚红。Hanks液 (Hanks Balanced Salt Solution)Hanks液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。贮存液A液：(I)NaCl 80gKCl 4gMgSO47H2O 1gMgCl26H2O 1g用双蒸馏水定容至450ml。(II)CaCl21.4g (或CaCl22H2O 1.85g)用双蒸馏水定容至50ml。将

9、I和II液混合，即成A液。贮存液B液：Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO40.6g, 酚红 0.2g, 葡萄糖 10.0g,酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺序一一溶解，用双蒸馏水定容至500ml。 (3)应用液：A、B储存液分别经112.6湿热灭菌20min，取A和B液各25ml，加无菌双蒸馏水至450ml，使用前用无菌的3.5%或5.6% NaHCO3调至所需pH。注意：药品必须全部用A.R试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸水溶解，待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。无Ca2+、Mg2+ Hanks液（Hanks Solution without cal

10、cium, magnesium sulfate）NaCl 80g, KCl 4g, Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO40.6g,葡萄糖10g,用双蒸馏水溶解后，加入0.4酚红溶液50ml，再加入双蒸水至1000ml，112.6湿热灭菌20min，4 冰箱保存。临用前将原液用无菌双蒸水作1：10倍稀释，用无菌的3.5%或5.6% NaHCO3调至所需pH。pH7.2柠檬酸盐缓冲液(Citrate Buffer)柠檬酸 0.327g柠檬酸钠 2.63g磷酸氢钠 0.222葡萄糖 0.00255mg蒸馏水加至100ml。pH3.3枸橼酸-磷酸盐缓冲液（Citric acid- Pho

11、sphate Buffer)0.131mol/L citrate acid，0.066mol/L Na2HPO4，等量混合，调节pH至3.3。0.5 mol/L EDTA, pH 8.0EDTA2H2O 186.1 gNaOH 20 g将EDTA2H2O加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节pH至8.0，EDTA直到接近pH 8.0才完全溶解，定容至1L。分装后高压蒸汽灭菌。0.4%酚红溶液取酚红0.4g置于研钵中逐滴加入1mol/L NaOH溶液11.28ml，边研磨边使酚红转变为钠盐溶于水中，加双蒸水至100ml，过滤后，4 冰箱保存。醋酸钾（Potassium Ace

12、tate）在60ml 5mol/L醋酸钾溶液中，加入11.5ml冰醋酸和28.5ml水。该溶液用于碱性裂解。3mol/L 醋酸钠（Sodium Acetate），pH5.2和pH7.0在800ml水中溶解408.1g三水醋酸钠，用冰乙酸调pH至5.2或用稀释乙酸调pH至7.0，加双蒸水至1L。分装后高压灭菌。柠檬酸钠缓冲液(Sodium Citrate Buffer)柠檬酸钠1.8gHCl(1mol) 4ml无水乙醇 95ml先用100ml去离子水溶解柠檬酸钠，然后加入HCl和无水乙醇，再补充去离子水至总量200ml。饱合硫酸铵溶液(Saturated Ammonium Sulfate Sol

13、ution)取500ml双蒸馏水，加入约400克硫酸铵，水浴加热至70，磁力搅拌器充分搅拌，直到加入的硫酸铵不再溶解，以氨水（也可用NaOH）调pH7.2，室温保存。二、酶免疫检测常用试剂配制包被液(Coating Buffer)（pH9.5碳酸盐缓冲液）Na2CO310H2O8.58gNaHCO35.8g溶于双蒸水至1000ml。封闭液(Confining liquid)（5%脱脂乳-PBS溶液，pH7.4）脱脂乳 50g加0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）至1000ml溶解。洗液(washing liquid) 氯化钠 8.0g 磷酸二氢钾 0.2g 磷酸氢二钠（12H2

14、O）2.9g 吐温-20 0.5ml加去离子水至1000ml溶解即可。终止液(stop buffer)（2mol/L H2SO4）： 21.7ml H2SO4 加去离子水至200ml。缓冲甘油(glycerine buffer)甘油 9份PB（pH8.0） 1份 将9份甘油与1份PB合并，充分混匀。0.5%H2O2-甲醇液(Hydrogen Peroxide-Methanol Solution)（总体积120ml）3%H2O2 20ml甲醇 100mlDAB-H2O2底物缓冲液(DAB- H2O2Substrate Buffer)取6mg二氨基联苯胺(3,3-Diaminobenzidine

15、Tetrahydrochloride DAB)溶解于10ml 0.05mol Tris-HCl pH7.6。使用前取0.3%H2O2 0.1ml加入到DAB溶液中(H2O2的终浓度为0.003%)。如有沉淀生成，则用滤纸过滤。5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液（BCIP/NBT Substrate Solution）贮存液配制：NBT：在10ml 70%的乙醇中溶解0.5g NBT。BCIP：在10ml 100%二甲基甲酰胺中溶解0.5g BCIP。贮存液4保存，可稳定一年。底物显色液：取66l NBT贮液与33l BCIP加入到10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀，底物显色液应在

16、用前1小时内配制。三、细胞相关试剂配制L-谷氨酰胺（L-G）溶液（L-glutamin Solution）（0.2 mol/L）称2.9 g L-谷氨酰胺（分子量为146.15）用去离子水溶解至100 ml，过滤除菌，分装小瓶，45 ml/瓶，-20冻存。100x青-链霉素（双抗）溶液（P/S Penicillin/Streptomycin Solution）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1 g，溶于100 ml去离子水中，分装小瓶，45 ml/瓶，-20冻存。7.5% NaHCO3溶液（NaHCO3 Solution）称分析纯NaHCO37.5 g，用去离子水溶解至l00m

17、l，过滤除菌，分装小瓶，45 m1/瓶，盖紧瓶塞，4保存。HEPES溶液（HEPES Solution）（1mol/L）称23.83 g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基呱嗪-N-2-乙基磺酸，分子量为238.3），用去离子水溶解至100 ml，过滤除菌，分装小瓶，45 m1/瓶，4保存。氨基喋呤（A）贮存液（Aminopterin Stocking Solution）（100, 410-5mol/L）称1.76 mg氨基喋呤（Aminopterin, 分子量440.4），溶于90 m1去离子水中，

18、滴加l mol/L NaOH 0.5 m1，并不断搅动，待氨基喋呤完全溶解后，加1 mol/L的HCl 0.5m1中和，再补加去离子水至100 m1。过滤除菌，分装小瓶，2 ml/瓶，-20冻存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（HT Stocking Solution）（100,H: 10-2mol/L; T: 1.610-3mol/L）称取136.l mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，分子量136.1）和38.8 mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，分子量242.2），加去离子水至l00 ml，置4550水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶，2 m1/瓶，-20冻存。用前可置37加温助

19、溶。HAT培养液培养液98 ml，A贮存液1 m1，HT贮存液l ml。秋水仙素溶液（colchicine Solution）称取10 mg秋水仙素，溶于100 m1生理盐水中（即为100 g/ml），过滤除菌后，分装小瓶，20冻存备用。Alsevers血细胞保存液（Alsevers Solution）葡萄糖 2.05g, 柠橡酸钠 0.8g, NaCl 0.42g，蒸馏水 l00ml。以上成分混匀后，微加温使其溶解后，用柠檬酸调节pH 6.1，分装于三角瓶中(3050ml/瓶), 113湿热灭菌15min，4保存备用。细胞冻存液(Freezing Medium)50%小牛血清；40%不完全培

20、养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。0.025%胰蛋白酶0.2%EDTA细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)A: 2.5%胰蛋白酶:胰蛋白酶 2.5g 磷酸缓冲盐溶液 100ml过滤除菌保存。B:0.2%二乙胺四乙酸二钠（EDTA） EDTA 0.2g 双蒸馏水 100ml高压灭菌保存。取A液1份，加B液99份，混匀，分装-20保存。0.83% NH4CI溶液(Ammonium Chloride Solution)NH4CI 0.83gKHCO3 0.1gEDTA2Na 0.0037g蒸馏水加至100ml。Tris-NH4Cl溶液(Tris-Ammonium Chlorid

21、e Solution)NH4Cl 3.735g/450ml双蒸水+Tris 1.3g/50ml双蒸水（pH 7.65）。细胞裂解液（Cell Lysis Solution）20mmol/L HEPES(pH 7.5)150mmol/L NaCl1 mmol/L EDTA10g/ml leupeptin1mmol/L PMSF1% Triton X-1000.5% deoxicholate (sodium salt)0.1% SDS组织匀浆缓冲液（Histolysis Buffer）50mmol/L Tris-HCl (pH7.5)150mmol/L NaCl 1% NP401mmol/L ph

22、enylmethylsulfonyl fluoride 4g/mlleupeptin1g/ml aprotinin细胞核裂解液(Nuclear Lysis Buffer)10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)150mmol/L NaCl10mmol/L EDTA蛋白酶K 100g/ml0.4%SDS（最后加）10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）在异丙醇中溶解PMSF至1.74mg/ml，即10mmol/L，分装后保存于-20，如果需要的话，可将储存液制备至17.4mg/ml，即100mmol/L的高浓度。闪烁液(Scintillation Solution)PPO(2,5-二苯

23、基)5.0g、POPOP（1,4-双5苯基）0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可将POPOP加入二甲苯，在37水浴上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。3H-TdR 工作液（woking Solution）按1:20的比例将浓度为1mCi/ml的3HTdR用无血清的RPMI培养液稀释，终浓度为50Ci/ml。肝素溶液的配制： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为4 。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确

24、可加入0.9ml）即可。型胶原酶： 0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保存。 用时提前一小时37复温即可.0.1%的I型胶原酶的配置，100mg的粉末状的I型胶原酶可以溶于100ml的DMEM/F12，0.22微米滤器过滤0.1%的I型胶原酶的配置，100mg的粉末状的I型胶原酶可以溶于100ml的DMEM/F12，0.22微米滤器过滤.四、染色液配制（Prepration of Staining Solution）苏木素液(Hematoxylin Solution)：苏木素2.5

25、g，乙醇25.0ml，钾明矾2.5g，氧化汞1.25g，冰乙酸20.0ml，蒸馏水500.0ml。配制方法是先将苏木素溶于乙醇中（稍加热）。将预先已溶解明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中，使溶液尽快沸腾后，将火焰熄灭，慢慢加入氧化汞，防止溶液油溅出，再煮沸2min。将烧瓶立即浸入冷水中，当染液冷却后，加入醋酸，室温保存，用前过滤。伊红Y染色液(Eosin Y Solution)伊红Y 0.51.0g，蒸馏水75ml，95%乙醇25ml，冰乙酸12滴。先取少许蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红研碎，再加入全部蒸馏水，溶解后加入乙醇。甲基绿染色液(Methyl Greeen Solution)新购买的甲基绿

26、需用氯仿处理去除甲基紫。方法是将2%甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，移去慢慢下沉带紫红色的氯仿，再加入新的氯仿10ml，如此反复更换氯仿，到无紫红色为止。该液作为贮存液，4保存。染色液：甲基绿贮存液5ml，5%派诺宁水溶液1ml，蒸馏水12ml，0.2mol/L乙酸钠(pH4.8)18ml（临用前配制，滤纸过滤）。吖啶橙贮存液(Acridine Orange Stocking Solution) 10mg吖啶橙溶解于100ml PBS中，pH4.86.0滤过，4避光保存。吉姆萨贮存液(GiemsaSolution)吉姆萨染色粉1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为

27、止，再将全部(66ml)剩余甘油倒入，于56温箱内保温2h。然后再加入甲醇(66ml)，搅匀后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。临用时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。瑞氏染色液(WrightsSolution)瑞氏染色粉0.3g甘油 3ml甲醇 97ml将瑞氏染色粉放干燥研钵内磨细，加入甘油继续研磨，不断滴加甲醇并继续研磨，将上层溶解的染料倒入棕色瓶中，直至染料全溶后加甲醇至所需量。混匀后置棕色瓶中保存，用前过滤。一般配制后置室温一周便可使用，保存时间愈入，则染色效果愈佳。吉姆萨-瑞氏染色液(Giemsa- Wrights

28、 Staining Solution)瑞氏染色粉0.3g吉姆萨染色粉 0.03g甲醇 100ml将二种粉末置于研钵中磨细，再逐滴加入甲醇混匀后倒入棕色瓶中，塞紧瓶口并充分振荡。置室温溶解后使用。噻唑兰（MTT）称取250mgMTT，加50ml PBS（0.01mol/L，pH 7.4）在磁力搅拌器上搅拌30min，用0.22m的微孔滤膜过滤除菌，分装，4保存。两周内有效。台酚蓝染色液(Trypan Blue Solution)A：台酚蓝染料1g蒸馏水 100ml将染料置于研钵中边研磨边加入蒸馏水溶解。B：NaCl 1.7g蒸馏水 100ml临用前A、B液1：1混合，离心沉淀，取上清供染色用。混

29、合后的染液存放过久，易形成沉淀，故应新鲜配制。染色时，取细胞悬液0.1ml加入新鲜配制的染色液一滴，室温下染510分钟，取一滴悬液于载波片上，加盖玻片，高倍镜下检查。死亡细胞膨大并染成浅蓝色，活细胞不着色，大小正常。五、固定剂(Fixatives)大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定

30、条件。目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液, pH7.3（formaldehyde-Phasphate Buffer）多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60左右，持续搅拌（或磁力搅拌）至完全溶解，通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌