连翘苷人工抗原的合成及免疫原性鉴定.docx

1、连翘苷人工抗原的合成及免疫原性鉴定连翘苷人工抗原的合成及免疫原性鉴定 摘要 基于高特异性，高灵敏度的小分子单克隆抗体的免疫分析方法的建立，对中药小分子化合物的的研究具有重要的意义，其中，小分子人工抗原的合成是中药小分子抗体制备的关键步骤。采用高碘酸钠氧化法分别合成连翘苷免疫抗原（FRn-BSA）和包被抗原（FRn-OVA），通过紫外光谱和薄层色谱法检测到连翘苷成功与BSA/OVA偶联，小鼠经FRn-BSA免疫后，体内可产生抗连翘苷抗体，效价在18 000左右，线性范围为1100 mg?L-1。成功合成的连翘苷人工抗原，可为下一步的单克隆抗体制备以及相应免疫方法的建立奠定基础。 关键词 连翘苷；

2、人工抗原；高碘酸钠氧化法；免疫分析方法；抗连翘苷抗体 连翘苷是一种属于双环氧木脂素类化合物的葡萄糖苷，是连翘药材的质量控制指标之一，具有抗炎解热1，抗氧化2-4，降血脂5，保肝6及神经保护7等多种药理活性。目前连翘苷的检测方法主要为HPLC，RP-HPLC8，近红外光谱法9等，其中以HPLC为主。这些方法存在样品前处理复杂等问题，当待测样品含量很低，或者样本量很大时具有局限性，特别是进行药代动力学研究时难以满足需要。而基于小分子单克隆抗体的中药活性成分免疫学分析方法，灵敏度高，特异性强，前处理简单，高通量，且不依赖贵重仪器，操作也较为简便10-11。因此得到越来越多的关注。为建立连翘苷免疫学分

3、析方法，本研究首先对连翘苷的人工完全抗原进行了合成与鉴定，并分析其免疫原性。 1 材料 1.1 动物 SPF级健康雄性BALB/c小鼠5只，68周龄，维通利华实验动物中心提供，动物许可证SCXK-（京） 2007-004，实验动物质量合格证号（No. 0029729）。 1.2 试剂 连翘苷（FRn，批号943110753）购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，95%（HPLC）；牛血清白蛋白（BSA，批号29180102100），美国Roche公司；卵清蛋白（OVA，批号115K0730）购自北京欣经科生物技术有限公司；NaIO4（批号F20080314）分析纯，国药集团北京化学试剂公司；弗

4、式完全佐剂（F5881，批号SL11432），Sigma公司；弗式不完全佐剂（F5506，批号SL12282），Sigma公司；酶标二抗（HRP-标记羊抗鼠IgG），Gene-Script公司；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）；碳酸盐缓冲液（CBS，pH 9.6，0.05 mmol?L-1）；洗涤缓冲液（PBST，pH 7.4）；终止液（2 mmol?L-1 H2SO4 ）；底物缓冲液（pH 5.0 磷酸柠檬酸）。 1.3 仪器 96孔酶标板，Corning；紫外-可见分光光度计，Beckman coulter DU 800；酶标仪，Tecan Safire2全波长多功能酶标仪；84-1A

5、磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。 2 方法 2.1 连翘苷人工抗原的合成 参照本实验室以往经验12-14，采用高碘酸钠法，将连翘苷分别与BSA偶联成人工免疫原，与OVA偶联成包被原。具体方法如下：准确称取连翘苷5.0 mg充分溶于1 mL 20%甲醇中，NaIO4 8.0 mg充分溶于1 mL蒸馏水中，将二者混合，密封并用锡箔纸包裹避光，室温下搅拌反应1.5 h，得到连翘苷的氧化产物，成为A液。用0.1 mol?L-1 Na2CO3（pH 9.6）调pH至9.0以上。准确称取BSA/OVA各10.0 mg分别充分溶于1 mL CBS中，成为B液。然后将A液逐滴加入B液中，用0.1 mol?L

6、-1 Na2CO3（pH 9.6）再次调pH至9.0以上，封闭并避光，室温下搅拌6 h或过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至用蒸馏水预处理的透析袋中，搅拌下用蒸馏水透析72 h，中间多次换液。透析后的产物分装，于-20 保存待用。 2.2 连翘苷人工抗原的鉴定 2.2.1 紫外扫描法 用蒸馏水精确配制适宜浓度的FRn与BSA，OVA标准溶液，将待测样品用蒸馏水稀释到适宜浓度，用紫外分光光度计测出FRn，BSA，FRn-BSA，FRn-OVA，OVA的全波长图谱。 2.2.2 薄层色谱法 按2010年版中国药典方法进行。用蒸馏水配制适宜浓度的FRn，BSA，OVA标准溶液，将待测样品FRn-B

7、SA和FRn-OVA用蒸馏水稀释到适宜浓度。将标准溶液和待测样品分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（81）为展开剂，展开后晾干，喷以10%硫酸-乙醇溶液，加热到108 显色。 2.2.3 动物免疫 用FRn-BSA免疫原以背部皮下多点注射免疫的方法免疫5只雄性BALB/c小鼠。初次免疫用等量的弗式完全佐剂充分乳化，免疫剂量为100 g/只，以后每14 d左右加强免疫1次，改用弗式不完全佐剂乳化抗原，免疫剂量不变。从第3次加强免疫开始后每7 d断尾取血，之后5 000 r?min-1，离心10 min分离血清，分别编号为15。 2.2.4 ELISA法测定血清中的抗体效价 以FRn-O

8、VA作为包被原，用CBS稀释至11 000，每孔加100 L，37 孵育2 h。以PBST洗板，每次5 min，共3次，然后拍干。以10 g?L-1明胶为封闭液，每孔加200 L，37 孵育1 h。洗板。抗血清稀释倍数为1 000，2 000，4 000，8 000，16 000，32 000，64 000，128 000倍。以未免疫空白小鼠的血清作为阴性对照，37 孵育1h，洗板。每孔加入100 L HRP-羊抗鼠二抗（110 000），37 孵育0.5 h，洗板。每孔加入TMB使用液100 L，37 孵育显色15 min后每孔加2 mmol?L-1硫酸50 L终止反应，测定吸光度A450

9、nm。以同一稀释倍数下抗血清（P）与阴性血清（N）A450 nm比值（P/N）大于2.1时血清的最大稀释度定为抗体效价。 2.2.5 icELISA法测定血清中的抗体特异性 以FRn-OVA作为包被原，用CBS稀释至11 000，每孔加100 L，37 孵育2 h。以PBST洗板，每次5 min，共3次，然后拍干。以10 g?L-1明胶为封闭液，每孔加200 L，37 孵育1 h。洗板。抗血清稀释倍数为2 000，FRn分别稀释为100，50，25，12.5，6.25，3，1 mg?L-1和对照值0 mg?L-1，每孔分别加入小分子和抗血清各50 L。37 孵育1 h，洗板。每孔加入100 L

10、 HRP-羊抗鼠二抗（110 000），37 孵育0.5 h，洗板。每孔加入TMB使用液100 L，37 孵育显色15 min后每孔加2 mmol?L-1硫酸50 L终止反应，测定A450 nm。 3 结果 3.1 FRn-BSA，FRn-OVA的紫外光谱鉴定 FRn，FRn-BSA，BSA，FRn-OVA，OVA的紫外光谱见图1。可以看出FRn紫外特征吸收峰为276 nm；BSA及OVA紫外特征吸收峰为278 nm，FRn-BSA及FRn-OVA紫外特征吸收峰为277 nm，另在290330 nm处的紫外吸收明显区别于FRn和BSA及OVA，其中在310 nm处有一肩峰，因此可以判断FRn成

11、功偶联于BSA及OVA上。 3.2 FRn-BSA和FRn-OVA的薄层色谱图 薄层色谱是鉴定人工抗原合成的简便方法。FRn，BSA，OVA，FRn-BSA，FRn-OVA经薄层色谱，FRn的Rf约为0.5，并显示出紫棕色斑点，但BSA，OVA在此显色条件下点样原点并未出现棕色斑点，而FRn-BSA，FRn-OVA在点样原点亦显示棕色斑点。上述结果说明连翘苷偶联在BSA和OVA上。 3.3 动物免疫实验结果 3.3.1 ELISA法测定血清中的抗体效价结果 经过5次免疫后小鼠血清中有抗FRn抗体产生，以P/N2.1为标准，抗体效价在18 000，见表1。 3.3.2 icELISA法测定血清中

12、的抗FRn抗体特异性 经检测，FRn对5只小鼠的免疫血清均有竞争抑制，表明小鼠血清中产生的抗体具有连翘苷特异性，以连翘苷浓度为0对应的孔A450 nm为A0，以其他各种浓度连翘苷对应的孔A450 nm为A，计算小鼠抗血清间接接竞争抑制曲线的线性方程和R2，以及灵敏度（抑制率为10%时连翘苷的质量浓度），见表2。以1号小鼠为例，抗血清竞争抑制曲线见图2。 4 讨论 中药中活性成分众多，植物激素、皂苷类化合物、植物单糖及植物多糖类化合物等是重要的中药活性成分，具有广泛的药理活性，但由于此类化合物大多数无特征紫外吸收，分析检测比较困难，对于这类化合物建立快速、灵敏、特异性强的检测方法，对中药及复方中

13、微量有效成分的检测，探索中药小分子活性成分的作用机制等具有重要的意义15。基于抗体特异性的免疫分析方法具有耗时少、能够大批量处理样品、灵敏度和准确度高等优点，并且有多种技术形式，将免疫分析方法应用于中医药的研究具有广阔前景12，16。因此，通过合成连翘苷人工抗原，进而产生抗FRn抗体，建立相应的免疫分析方法，来进行连翘药材、含连翘中成药的质量检测，以及相关的药物作用机制研究等。 人工抗原合成有很多种方法，如高碘酸钠氧化法、碳二亚胺法等。不同偶联方法因选择半抗原的连接基团或部位不同，决定了半抗原表位构型的表达差异，不仅影响半抗原的免疫原性，更决定了其免疫抗体的特异性17。本实验室曾采用高碘酸钠氧

14、化法合成了栀子苷、黄芩苷、甘草酸、绿原酸等中药小分子化合物的人工抗原18-22，连翘苷人工抗原的合成也适合采用高碘酸钠氧化法，即将糖基侧链中的邻羟基氧化为双醛基，继而与大分子载体蛋白的氨基相偶联。合成方法较为简便，且保留了连翘苷的特征性结构，不仅可以提高连翘苷的免疫原性，而且较容易得到效价较高、亲和性良好的稳定细胞株，为下一步获得高特异性的连翘苷单克隆抗体奠定基础。 目前鉴别人工抗原成功与否的方法主要有紫外分光光度法、电泳法、质谱法、同位素示踪法等23。研究中发现薄层色谱法简便、快捷、成本低，且样品使用量非常小，几乎适用于所有的化合物，可以大大推动人工抗原合成条件优化的研究进度24，所以本研究

15、采用较为方便简捷的薄层色谱法和紫外光谱法对合成产物进行鉴定。经过初步鉴定，连翘苷与载体蛋白成功偶联，并且对免疫小鼠血清进行ELISA检测发现，所合成的FRn-BSA可以使小鼠体内产生抗连翘苷抗体，效价达18 000；间接竞争ELISA结果也表明所产生抗体具有连翘苷特异性。这些结果也进一步证明了连翘苷人工抗原合成成功。 参考文献 1胡竟一，雷玲，余悦，等. 连翘的抗炎解热作用研究J. 中药药理与临床，2007，23（3）：51. 2赵咏梅，黄新炜，马蕊，等. 连翘苷对氧自由基清除作用的研究J. 西安文理学院学报：自然科学版，2008，11（4）：14. 3朱淑云，杨建雄，李发荣. 连翘叶提取物对

16、小鼠氧化损伤的保护作用J. 中药药理与临床，2004，20（1）：18. 4邱娟，杨晨，杨建雄. 连翘叶中苷类成分的体外抗氧化作用研究J. 陕西理工学院学报，2007，23（2）：53. 5赵咏梅，李发荣，杨建雄，等. 连翘苷降血脂及抗氧化作用的实验研究J. 天然产物研究与开发，2005，17（2）：157. 6徐春媚，王文生，曹艳红，等. 连翘护肝作用的实验研究 J. 黑龙江医药科学，2001，24（1）：10. 7张美蓉，魏守蓉，吴燕川，等. 连翘苷对MPP+诱导人神经母细胞株SH-SY5Y细胞损伤的保护作用J. 神经药理学报，2011，1（4）：12. 8 赵文华，石任兵，刘斌，等. R

17、P-HPLC测定连翘病毒清胶囊中连翘酯苷和连翘苷的含量J. 中国中药杂志，2005，30（1）：37. 9 戴传云，高晓燕，汤波，等. 近红外光谱法测定双黄连口服液中绿原酸和连翘苷的含量J. 光谱学与光谱分析，2010，30（2）：358. 10 Chuang J C，Van Emon J M，Jones R，et al. Development and application of immunoaffinity column chromatography for atrazine in complex sample media J. Anal Chim Acta，2007，583（1）： 3

18、2. 11 屈会化，赵琰，王庆国. 利用免疫芯片技术筛查中药注射剂致敏成分J. 北京中医药大学学报，2008，31（1）：23. 12赵琰，屈会化，王庆国. 利用单克隆抗体特异性敲除技术解析中药药效物质基础的新方法J. 中国中药杂志，2013，38（17）：2906. 13屈会化，赵琰，李翼飞，等. 中药活性小分子人工抗原合成的技术要点J. 中草药，2012，43（10）：1880. 14屈会化，赵琰，王雪茜，等. 黄芩苷人工抗原的合成与鉴定J. 北京中医药大学学报，2010，33（9）：606. 15郭旭，刘吉华，余伯阳. 中药中活性物质单克隆抗体的制备及其免疫检测应用J. 南京晓庄学院学报

19、，2010，26（3）：31. 16 屈会化，赵琰，王庆国. 基于中药活性小分子单克隆抗体的复方配伍机理研究新思路J. 中国中西医结合杂志，2012，32（10）：1418. 17 李丽华，刘文泰，戴军，等. 大黄素-BSA不同表位构型的免疫原性和特异性研究J. 中国免疫学杂志，2011，27（5）：419. 18屈会化，张桂亮，赵琰，等. 栀子苷人工抗原的合成与鉴定J. 北京中医药大学学报，2013，36（6）：387. 19苏歆，屈会化，赵琰，等. 基于黄芩苷单克隆抗体的ELISA快速检测方法的建立J. 药物分析杂志，2013，33（6）：946. 20张越，屈会化，吴婷婷，等. 甘草酸单

20、克隆抗体的制备与鉴定J. 药物分析杂志，2013，33（5）：770. 21何洲，屈会化，王雪茜，等. 绿原酸作为半抗原的致敏性研究J. 北京中医药大学学报，2010，33（10）：667. 22 刘洋，屈会化，任燕. 人参皂苷Rg1人工抗原的合成及免疫原性鉴定J. 中草药，2013，44（13）： 1738. 23张丽芳，李伟岭，薛飞群. 人工抗原的鉴定J. 畜牧与饲料科学，2009，30（10）：116. Synthesis and identification of artificial antigen of forsythin REN Ya-jun3，4，QU Hui-hua2，4，C

21、HENG Jin-jun3，4，HE Na-na3，4，FENG Sheng-lan3，4，ZHAO Ling-ling3，4， ZHAO Yan1，4*，WANG Qing-guo1，4 （1.School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China； 2.Center of Scientific Research，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China； 3.College of Chin

22、ese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China； 4.Beijing University of Chinese Medicine Classical Prescription Application Foundation Research Innovation Team，Beijing 100029，China） Abstract The establishment of high specificity and sensitivity method of small molecul

23、e monoclonal antibody-based immunoassay has a great importance in the study of small molecule compounds in Chinese medicine，wherein synthesis of small molecule artificial antigen is a critical step in the preparation of small molecule antibodies. Oxidation method using sodium iodide was used to synt

24、hesize immunogenic antigen （FRn-BSA） and coating antigen （FRn-OVA） of forsythin. UV spectroscopy and thin layer chromatography showed that forsythin was successfully conjugated with BSA and OVA. After immuned FRn-BSA，the mice could specifically produce anti-forsythin antibodies with titer up to 18 0

25、00，and the linear range was from 1 mg?L-1 to 100 mg?L-1. In this paper，the artificial antigen of forsythin was successfully synthesized，which can be applied for preparation of monoclonal antibodies and establishment of appropriate immune method. Key words forsythin；artificial antigen；sodium periodate oxidation；immunoassay method；anti-forsythin antibodies doi：10.4268/cjcmm20141228