AtHsfA1a对热胁迫下PCD相关基因启动子区结合的研究.docx

1、AtHsfA1a对热胁迫下PCD相关基因启动子区结合的研究 AtHsfA1a对热胁迫下PCD相关基因启动子区结合的研究 摘 要:近年来随着全球气温的不断升高，许多植物面临着很严峻的抵抗热胁迫伤害的挑战。植物在这种高温胁迫下会发生各种保护性的反应如热激反应（heat shock response，HSR），热激反应过程中能产生热激蛋白（heat-shock protein，HSP），这种蛋白能提高植物体对高温的耐受性。而调控这种蛋白表达的转录因子叫做热激因子(heat shock t ranscription factor , 简称HSF)。植物热激因子通常可以分为A、B、C三类，不同物种的HS

2、Fs有所不同但它们都有相同的结构域。其中A类热激因子可参与热激反应等胁迫应答和和植物发育调节，如拟南芥的热激因子AtHsfA1a就是其中一种。另外在高温胁迫中植物为维持内环境稳定还会发生细胞程序性死亡（PCD），它是由基因控制的细胞自主、有序的细胞死亡形式。但目前植物PCD的调控机制仍不是很清楚，也不清楚植物HSF与PCD是否有直接关系，更不清楚拟南芥热AtHsfA1a是否可以调控PCD，如何调控PCD。因此，本实验研究拟南芥热激因子AtHsfA1a对热胁迫下细胞程序性死亡相关基因启动子区结合的影响 ，对于揭示HSF与PCD的关系有重要意义。本实验以野生型和AtHsfA1a突变型拟南芥为实验材

3、料，在39的热胁迫下，提取拟南芥叶片的总RNA，并用RT-PCR技术检测拟南芥热激因子AtHsfA1a的表达量。实验结果表明在热胁迫下野生型和AtHsfA1a突变型的AtHsfA1a都会表达，只是突变性的表达量明显低于野生型的。之后为了探究拟南芥热激因子AtHsfA1a与PCD相关基因（sus1，sus2和sus3）的启动子区是否有结合，在39的热胁迫下，通过染色质免疫共沉淀技术分析拟南芥热激因子AtHsfA1a与PCD相关基因（sus1，sus2和sus3）启动子区的结合情况，实验结果表明在热处理，经过经甲醛交联，加抗体的情况下野生型的拟南芥的热激因子AtHsfA1a 与PCD相关基因（su

4、s1，sus2和sus3）启动子区在体内能结合，而突变型不能结合。通过本实验验证了拟南芥的热激因子AtHsfA1a 与PCD相关基因（sus1，sus2和sus3）之间存在了直接的联系，拟南芥的热激因子AtHsfA1a对热胁迫下细胞程序性死亡相关基因有调控作用。关键词：热激因子AtHsfA1a; PCD相关基因; 热胁迫; 启动子区；染色质免疫共沉淀技术AtHsfA1a on PCD under heat stress associated gene promoter (Department of Kunming Institute of life science and technology

5、, Kunming, Yunnan, 650214) Abstract: In recent years, with the rising of the global temperature, many plants are facing severe resistance to heat stress injury challenges. Plant in under the high temperature stress will happen various protective responses such as heat shock response (heat shock resp

6、onse, HSR) and heat shock response can produce heat shock protein (heat-shock protein, HSP). This protein can improve the plant tolerance to high temperature. The expression of heat HSF transcription factor is called shock factor (ranscription). The plant heat shock factor can be divided into three

7、kinds: A, B, C, and the HSFs of different species are different, but they have the same structural domain. Where a class a heat shock can be involved in the stress response and the plant developmental regulation such as the heat shock factor AtHsfA1a of Arabidopsis is one of them. In order to mainta

8、in the stability of the plants in the high temperature stress, the programmed cell death (PCD) is also the cell death form of the gene controlled cells. However, the mechanism of plant PCD regulation is still unclear, and it is not clear whether the plant HSF has a direct relationship with PCD, it i

9、s not clear whether the heat shock factor AtHsfA1a can regulate PCD, how to regulate PCD. Therefore, this experiment studied the regulation of the programmed death of the cell programmed by AtHsfA1a in Arabidopsis, and it was important for the relationship between PCD and HSF. This experiment to wil

10、d type and mutant of Arabidopsis thaliana as experimental material, under 39 degrees of heat stress, extraction total RNA from leaves of Arabidopsis thaliana, and RT-PCR was used to detect the Arabidopsis heat shock factor AtHsfA1a expression. The results showed that the mutant AtHsfA1a expression o

11、f wild type and AtHsfA1a mutant was expressed in heat stress, but the expression of mutant was significantly lower than that of wild type. After in order to explore the Arabidopsis heat shock factor AtHsfA1a and with PCD related genes (sus1, sus2 and Sus3) to start the whether there is a combination

12、 of, under 39 degrees of heat stress, by chromatin immunoprecipitation co precipitation technique analysis of death in the sexual heat shock factor AtHsfA1a and program of cell Arabidopsis DNA fragment combination. The experimental results show that only in the heat treatment after a period of cross

13、-linked with formaldehyde, and antibody of the wild type of Arabidopsis heat shock factor AtHsfA1a and PCD genes in vivo can be combined with, and mutant cannot be combined. Through the experiment to verify the between Arabidopsis heat shock factor AtHsfA1a and programmed cell death (PCD) genes (sus

14、1, sus2 and Sus3) existed in direct contact, the Arabidopsis heat shock factor AtHsfA1a to heat stress under programmed cell death related genes having regulatory roles.Key words: Heat shock factor AtHsfA1a, Programmed cell death, Heat stress treatment, Promoter region, Chromatin immunoprecipitation

15、引言植物在长期的生存生长过程中既能感知各种不良刺激也能逐步适应它，这是为什么呢？是因为它体内可以完成一整套高效而灵活的逆境反应的体系，使植物在各种不同的逆境条件下仍然可以生长、生存和再生。植物在各种非生物环境因素的胁迫下会产生各种不同的防御响应如热激反应（heat shock response，HSR）是当植物体在外界热刺激下产生的保护性反应。当高温刺激下植物细胞发生热激反应并产生热激蛋白（heat-shock protein，HSP）。热激蛋白的产生可以避免热刺激引起的蛋白质的凝聚, 使细胞或机体免受热激所带来的伤害。因此证明热激蛋白的生成与耐热性的获得有着密切的关系4,5。热激因子(hea

16、t shock t ranscription factor , 简称HSF),是在真核细胞内，在热激的条件下可以激活热激基因表达的一种转录因子本质是一种蛋白。这种表达调控依赖于在热激基因的5端有一小段特异的DNA识别序列HSE,这个序列可以和HSF 结合,在热激条件下HSF与HSE 的结合就会激活热激基因的表达1。大量的实验证明在正常生长的条件下, 热激因子以钝化的单体状态形式存在, 而当被热激时, 热激因子就会形成三聚体的形式并能够与DNA结合,这样就可以活化转录激活域从而激活热激基因的表达。只有在热激条件下HSF才会形成的三聚体形式而三聚体的形式对HSE才有高度的亲和性,在正常状态下没有这

17、种亲和性。HSF从单体转变成为三聚体,有了亲和性使HSF与HSE结合才能激活热激基因的表达，然而热激恢复时,HSF三聚体就会发生解聚, 又重新恢复到原来那个钝化的单体状态，不能激活热激基因的表达【2,3】。 植物热激因子通常可以分为A、B、C三类，不同物种的HSFs有所不同但它们都有相同的结构域。其中A类热激因可参与热激反应等胁迫应答和和植物发育调节如拟南芥的热激因子AtHsfA1a就是其中一种。对AtHsfA1a 的研究显示，与大多数的HSFs 都非常相似，在非生物的逆境胁迫条件下，AtHsfA1a 以单体形式存在这种单体的形式没有活性，在逆境诱导AtHsfA1a 可以让它形成三体的形式有活

18、性 、具有活性后能够与DNA 启动子区HSE特异结合，这样就可以调控逆境防御的相关基因基因的表达5,7。前期学者利用TDNA法使拟南芥的热激因子AtHsfA1a发生了突变，突变体构造如图1，突变后AtHsfA1a的表达量明显降低，本研究就将采用这种AtHsfA1a突变性的拟南芥植株作为材料与野生型的植株进行对照。图 1 AtHsfA1a突变体构造在动、植物生长发育过程中有一种常见的生命现象细胞死亡，与之相似的细胞程序性死亡(PCD)又称细胞凋亡 是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序的细胞死亡形式。它与细胞坏死不同，PCD不是一个被动的过程，而是一个主动的过程，涉及一系列基因的激活、

19、表达、调控等作用。他不是病理条件下自身损伤的一种现象，而是更好地适应生存环境主动采取的一种死亡过程19,20。表1-1细胞凋亡和细胞坏死的区别特征细胞程序性死亡细胞死亡诱发因素特定的或生理性各种病理性细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片细胞形态细胞皱缩、断裂溶解细胞数量单个细胞丢失成群细胞死亡膜完整性保持到最后阶段很早消失线粒体细胞程序性死亡肿胀破裂细胞核固缩碎裂为片段溶解破碎染色质致密、凝聚、边缘划分解、稀疏、固缩核生化改变DNA片段化弥散性降解内容物释放无释放释放炎症反应无有核DNA降解为完整倍数大小的片段随机不规则断裂基因组DNA有控降解随机降解基因控制有无蛋白质合成有无潜伏期数小时没有注：引

20、自谭冬梅7。发生PCD时，细胞膜发生皱缩、凹陷、染色质变得紧密，最后断裂成小碎片。进一步发展，细胞膜将细胞质分隔包围，有些包围了细胞质的片段，形成了多个膜结构尚完整的泡状小体，称为凋亡小体。其特点是具有完整的膜结构，胞膜表面的微绒毛消失，内容除了细胞质以外，还有降解的染色质片段17,18。动物中PCD的研究比较早,各方面都得到相当深入的研究并取得显著成果如在免疫学、胚胎学及医学方面都取得成功。近年来随着动物中PCD 研究的不断加深,植物PCD的研究也得到相应的提升12。并且随着植物PCD 研究的不断发展, PCD 相关基因也不断被发现,拟南芥中的sus 基因就是被发现的一组与拟南芥PCD有关的

21、基因13。在拟南芥中, 正常状况下胚柄细胞会在早期的时候发生PCD, 种子中就不会再出现胚柄。拟南芥胚柄的这种PCD与基因sus1，sus2和sus3有关。如果这三种基因发生隐性突变，胚柄细胞的这种PCD将不再发生。这样就会形成一个巨大的胚柄，使胚的正常形态发生破坏，因此本研究采用与拟南芥PCD相关的基因sus1，sus2和sus3的DNA片段作为PCR的引物来研究拟南芥热激因子AtHsfA1a与PCD相关的基因sus1，sus2和sus3之间是否存在联系14,15,16。拟南芥是被子植物中的一个植物种，属于植物界被子植物门，双子叶植物纲，白花菜目，十字花科，拟南芥属。拟南芥分为一年生，两年生

22、或多年生的草本植物，叶片互生，基生叶有柄，叶片倒卵形或匙形；茎生叶有柄，线形；总状花序顶生，匙形，白色，排列呈十字形。拟南芥虽只是小小的有花植物，但在遗传学、植物发育学中有重要作用，它是研究有花植物的遗传、细胞、分子生物学的模式植物。它的特点有植株个体小，在实验工作中容易实现拟南芥的栽培管理。生长周期短，使实验工作周期大大缩短。种子结实量大，容易扩增突变体的种子库。自花受粉，方便实施人工杂交。易突变基因组小，他是被子植物中第一个完成基因组测序的植物。基因序列重复少，使相关的研究工作变的方便快捷。容易进行遗传转化，容易从大量的后代中获得转化植物。遗传信息丰富。由于拟南芥有以上的优点本研究就采用拟

23、南芥作为材料染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation, 简称ChIP)是在生物体内研究DNA 和蛋白质之间作用的一种方法。最早的时候我们把它用于研究位于核小体上的DNA 和组蛋白之间的相互作用另外还有组蛋白的修饰。这几年来随着科技的不断发展,染色质免疫共沉淀技术不断的得到完善和发展, 尤其是将DNA 芯片技术与分子克隆技术的结合, 可以通过已知的蛋白因子筛选未知的DNA 靶点。ChIP基本原理是在一定的生理状态下把生物体细胞内的蛋白质和DNA共价的交联在一起，并且利用超声波将交联在一起的蛋白质和DNA打碎为一定长度的染色质小片段，然后用所要研究的目的蛋白质

24、的特异性抗体来沉淀此复合体，用Protein-A/G-Agarose特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，用不含Dnase的Rnase和Proteinase K解除交联，纯化DNA，通过对目的片断的检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫沉淀技术已经成功应用于研究植物体内蛋白质和DNA的相互作用，用于分析蛋白质与已知靶DNA序列的结合。因此本研究就将采用这种方法来研究南芥的热激因子AtHsfA1a 与PCD相关基因（sus1，sus2和sus3）之间的结合关系。 植物在生长过程中会受到很多不同的外界逆境胁迫如高温、干旱、盐渍、氧化等，面对这些非生物胁迫植物又不可以像动物一样可以随

25、意躲避这些伤害，但植物也不会就这样死去，植物自身为了抵抗这些胁迫会产生一系列的自我保护措施。细胞程序性死亡就是其中的一种，细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是指细胞在一定生理或病理的条件下，为了维护生物自身的生长发育、适应生存的各种多变环境而采取的一种主动、有序的死亡过程，这种死亡是由自身基因控制的，对生物生长发育具有重要的生理意义，它表现出特有的细胞学生理特征，具有复杂的生化基础。近年来随着温室效应的加剧，全球气温上升，许多植物面临着高温胁迫的严峻挑战9,10。在高温环境中，能引起植株叶片相关功能的变化，进而影响了植物的叶绿素含量、光合作用和蒸腾作用等生理活

26、动；高温能造成的植株多方面伤害，但最主要的是对胞内酶的破坏，使细胞的正常代谢受阻，造成生长发育中止或者细胞死亡。植物在这种高温胁迫下产生热激反应（heat shock response，HSR）是当植物体在外界热刺激时产生的保护性反应。在高温胁迫下植物细胞热激反应产生热激蛋白（heat-shock protein，HSP），能维护细胞正常生理活动。当植物受到热刺激时，HSF 能与HSE 特异性结合，从而激活热激蛋白表达，使热激蛋白在体内迅速积累，有助于蛋白重新折叠、稳定、组装等，从而提高植物体对高温的耐受性8。在逆境中植物会产生热激因子以调控热激反应同时植物也可能发生细胞程序性死亡，那么热激因

27、子和细胞程序性死亡之间会不会有某种联系呢？研究发现哺乳动物HSF1诱导热激蛋白的表达可以保护细胞免受热胁迫引起的细胞凋亡； HSF1可以调控肠癌细胞的抗细胞凋亡基因BAG3和XAF-1的表达,也可以调控干细胞中与PCD相关基因FasL的表达。但是对于植物中HSF与PCD的直接关系研究的相对较少，不清楚热激因子AtHsfA1a是否调控PCD，如何调控PCD。这种在动物中存在的联系是不是也适合植物呢?，因此本研究对于揭示热激因子AtHsfA1a的作用机理和PCD的调控机制均具有重要的意义21,22。本研究以野生型和突变型拟南芥为实验材料，在39的热胁迫下，通过染色质免疫共沉淀技术分析拟南芥的热激因

28、子AtHsfA1a 与PCD相关基因（sus1，sus2和sus3）启动子区的结合情况，从分子水平上研究拟南芥热激因子AtHsfA1a对热胁迫下细胞程序性死亡相关基因启动子区结合的影响，进一步鉴定拟南芥热激因子AtHsfA1a与逆境中PCD的关系。一、实验材料与方法（一）实验材料1植物材料 野生型（非转基因）拟南芥、突变型拟南芥2主要仪器设备实验仪器：超纯水系统（型号：Milli- Q Direct8） 电子称（型号：TP-1102） 电子天平（型号：si-224） 高压灭菌锅（型号：TOMY SX-500） 无菌工作台(型号：SW- CJ- 1BV) 水平摇床、冰箱、超声波破碎仪、制冰机、恒

29、温水浴锅、冷冻超速离 心机、真空干燥箱、PCR仪其他仪器：移液枪、烧杯、培养皿、小花盆、玻璃瓶、锥形瓶、量筒、镊子、剪 刀、滤纸、酒精灯、药匙、玻璃棒、密封纸、记号笔、称量纸3主要试剂K2HPO4、KH2PO4、蔗糖（sucrose0、Tris-HCl、氯化钠、醋酸钠、异丙醇、70%乙醇、氯仿、TE、TAE、琼脂糖、甲醛、SIB Buffer、crossing buffer、Lysis bufferl Protein-A-Agarose、Lysis buffer 2、Washing buffer、elution buffer 、蛋白酶K、苯酚、醋酸钠、无菌水试验方法及过程1拟南芥的播种1、配置

30、500ml的MS培养基：（1）取MS培养基2.37g，蔗糖5g，琼脂粉5g，去离子水500ml（用烧杯）（2）配置完母液后，向烧杯中加入氢氧化钠让ph达到5.8，然后再加5g琼脂 粉，倒入锅中煮10min左右，等琼脂粉溶解为止。（3）将煮好的MS培养基倒入锥形瓶中密封好。（4）将MS培养基、培养皿、枪头、无菌水等用报纸包好，进行高压灭菌（灭菌 温度121时间30min）2、种子消毒（1）将拟南芥种子用无菌水浸泡30min（2）再用0.1的Hgcl灭菌5min（3）用无菌水洗5min一共洗3次（4）再用70%的乙醇灭菌5min（5）用无菌水洗5min一共洗3次3、种子的接种（1）在20分钟前打开

31、超净工作台的紫外灯进行消毒，工作时关闭。（2）将灭菌好的MS培养基、培养皿、无菌水、枪头、抢、酒精、棉花用蓝色托 盘一起端到超净工作台。（3）将MS培养基倒入培养皿中，待冷却20min左右，进行接种（4）接种前用酒精擦拭工作台，抢。点燃酒精灯。（5）接种时用枪反复的抽取拟南芥种子，接种到培养基中（6）用枪把培养基中的水抽取出来（7）把接种好的培养基移到酒精灯旁（8）用密封纸把培养基密封好写上日期，姓名、型号。（9）放到组培室里面进行培养注意事项：（1）高压灭菌时注意国内的水位不够要加水（加蒸馏水）（2）琼脂粉记得蒸煮（3）超净工作台上的紫外灯要提前开启，工作时要关闭2拟南芥的移栽1、将营养土放

32、入黑色袋子里面密封好进行高温灭菌2、将营养土倒入蓝色托盘中加入肥料3、将高温灭菌的营养土填入花盆中微震使之平整，盆中的土不能装得太满，土 面到盆沿的距离约1.5cm的距离，用水从盆低的孔将盆土浸湿。4、将长出两片真叶的组培苗，用镊子轻轻地从培养基上挑出（保留组培根的完 整性），用镊子在培养瓶中分别挖三个洞，把小苗放入洞中用腻子将周围的基 质压实。5、接种好的培养盆用签字笔做好标记放入蓝色托盘中。用保鲜膜将盆口遮盖， 用签字笔做好标记，再放入生长室培养。6、遮阴培养2到3天后将膜去掉。热激处理 取生长4 周的小苗擦干水，置于SIB Buffer( 0. 5 mmol /L KH2PO4，0. 5 mmol /L K2HPO4，1%( 质量分数) 蔗糖，pH 6. 0 ) 中，39 热激处理30 min