生化工程教案.docx

1、生化工程教案本课程是化学工程与生物科学两者结合的一门交叉学科，同时又是生物技术领域中的一个重要分支，在生物技术中起到连接科研与工业化生产的桥梁作用。主要内容包括：培养基灭菌，空气除菌，通气与搅拌，发酵罐的比拟放大，连续培养的基本原理，固定化酶、固定化细胞，微生物生化反应过程的质量和能量衡算，微生物生长及发酵反应的数学模型和计算机的应用。第一章 培养基的制备与灭菌一、目的与要求：1、了解培养基的配制原理，掌握制备培养基的过程。2、学习高压蒸汽灭菌操作技术。3、了解干热灭菌操作要点。二、原理及说明:培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。一般来说，培养基包括有

2、水份、碳源、氮源、无机盐类以及生长因素等五大类营养成份。此外还得有适宜的PH值，一定的渗透压（即浓度）以及氧化还原电位等。1、培养基的分类（1）根据培养基原料来源不同：天然培养基、合成培养基、半合成培养基（2）根据物理性状分为：液体培养基、固体培养基、半固体培养基（3）根据培养目的不同：鉴别培养基、分离培养基、选择培养基2、培养基的配制（1）称药：按下列培养基的配方准确称取各成分，其中牛肉膏放在小烧杯里称量，其他成分放在称量纸上称量。阿斯毕无氮培养基：甘露醇（或蔗糖、葡萄糖） 10gKH2PO4 0.2gMgSO4.7H2O 0.2gNaCl 0.2gCaSO4.2H2O 0.1gCaCO3

3、5g琼脂 20g水 1000mlPH 自然 121oC 灭菌30分钟（2）溶化：用烧杯先装少许水,依次将药品倒入铝锅中，加足水，然后在电炉上加热溶化。（3）PH值：用精密的PH试纸测定，并用1%氧化钠或5%盐酸调节到所需的PH值。（4）过滤：趁热用纱布将培养基进行过滤。（5）分装：过滤后根据不同需要，立即趁热装入试管或三角瓶等容器中，分装如图：注意事项：（1）不要使培养基沾在管口，如沾上，需用干净的纱布擦干净。（2）液体培养基：分装高度以试管的1/4左右为宜。（3）固体培养基：分装试管，其装量为管高的1/61/5灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量之一半为宜。（4）半固体培养基：分装试管一般以试管高

4、度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。（6）做棉塞装好培养基的试管都要加上棉塞，这样既可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发，制棉塞的方法多种，形状各异，总原则如下：（1）用脱脂棉制作（脱脂棉花易吸水）（2）松紧适合（3）塞头不要太大，一般为球状。（7）包装试管口或三角瓶口棉塞部分，用牛皮纸扎，以防灭菌时水蒸气打湿棉塞。（8）灭菌灭菌是指杀死物品上或环境中的所有微生物。灭菌方法可分为四种：物理灭菌、机械灭菌、化学灭菌和生物灭菌。物理灭菌：1、热力灭菌： 2、紫外光灭菌：一般应用于无菌室和接种箱的灭菌。热力灭菌：干热灭菌：适用于玻璃仪器，将物品放入烘箱，160170oC，

5、12小时。火焰灭菌：适用于常用用具，如接种环、镊子等。灭菌方法是放在火焰上直接灼烧。湿热灭菌：(1)高压蒸汽灭菌：适用于培养基、衣物等的灭菌。（2）间歇蒸汽灭菌：适用于不耐高温的培养基或无高压蒸汽灭菌锅时。（3）巴斯德灭菌：适用于牛乳类等不耐高温的物体。紫外光灭菌：一般应用于无菌室和接种箱的灭菌。原理与区别基本原理：即通过不同的加热方法，使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的,蛋白质的凝固变性与蛋白质中含水量的多少有关，含水量较多者，其凝固所需要的温度低，反之，含水份较少者需要高温才能使蛋白质凝固。因此杀灭芽孢比杀灭营养体所需的温度高。干热灭菌与湿热灭菌的区别：在同一温度下，湿热的杀菌

6、效力比干热大，因为在湿热情况下菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时水蒸汽穿透力强，水蒸汽的导热性也强。而且当蒸汽与被灭菌的物体接触凝为水时，又可放出热量，使被灭菌物体温度迅速增高，从而增加灭菌效力。高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌锅是一个耐高压又密闭的金属锅。它是利用在密闭条件下产生高压蒸汽来达到灭菌的效果。其温度在100oC以上，有强大的杀菌能力。因此它是一种用途广泛，效率高的灭菌工具。分类：1、卧式 2、立式具体操作步骤：（1）加入适量自来水于灭菌锅中（至水位线）（2）摆入上述包装好的待灭菌的培养基，注意：不要摆得太挤，以免影响蒸汽流通和灭菌效果。（3）加盖旋紧螺旋，使蒸汽锅密闭不漏气（对角线均匀

7、拧旋）（4）打开放气阀，打开电源，自开始产生蒸汽后10分钟（此时蒸汽锅内的冷空气由排气阀排尽）关紧放气阀，让温度随蒸汽压力上升而上升，当达所需压力时（15磅/时2）控制热源维持所需时间（30分钟）然后停止加热，让其自然冷却。（5）待压力降至0磅时，打开排气阀，再打开锅盖，取出灭菌物。注意：压力未降至0磅时，切勿打开锅盖，否则突然降压，招致培养基沸腾，沾湿棉塞，甚至冲出管外。（6）自锅中取出灭菌好的培养基，放置稍冷却后摆成斜面，而后至37oC恒温箱培养24小时，无菌生长，方可保存备用。第二章 空气除菌一.空气除菌的意义好气性微生物的生长和合成代谢产物都需要消耗氧气。工业生产上均采用空气作为氧气来

8、源。然而，空气中有各种各样的微生物，为保证纯种培养，必须将空气中的微生物除去或杀死。二.空气中的微生物空气中微生物的含量和种类随地区、高低、季节空气中尘埃多少和人们活动情况而异。一般寒冷的北方比暖和、潮湿的南方含菌量少；离地面愈高含菌量愈少；工业城市比农村含菌量多。据统计大城市空气含菌数为300010000个/m3。空气中的微生物以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母、霉菌、放线菌和噬菌体。三. 好气性发酵对空气无菌度的要求好气性发酵中需要大量无菌空气，但空气绝对无菌是很难做到的，也是不经济的，只要使在发酵过程中不至于造成染菌而出现“倒罐”现象，这就是通风发酵对无菌空气的要求。不同类型的发酵,由于菌种

9、生长活力、繁殖速度、培养基成分和pH值及发酵产物等不同，对杂菌抑制的能力不同，因而对无菌空气的无菌程度要求也有所不同。在工程设计上，一般要求1000次使用周期中只允许有一个杂菌通过。三.空气除菌的方法1.辐射杀菌高能阴极射线、X射线、射线、紫外线都能破坏蛋白质活性而起到杀菌作用。其中紫外线用的较多，它在波长226.5nm-328.7nm时杀菌最强。一般用于无菌室、手术室杀菌。2. 静电除菌静电除尘法已广泛使用，除尘效率一般在8599%之间，但由于它消耗能量小，每1000立方米的空气每小时只需电0.20.8kw。空气压头损失小，一般只在420mm水柱。静电除尘是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除

10、菌除尘的目的。悬浮于空气中的微生物、微生物孢子大多带有不同的电荷，没有带电荷的微粒在进入高压静电场时都会被电离变成带电微粒，但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降所以静电除菌对很小的微粒效率很低。4. 过滤除菌绝对过滤绝对过滤是介质之间的孔隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质层后，空气中的微生物被滤除。绝对过滤易于控制过滤后空气质量，节约能量和时间，操作简便，它是多年来受到受到国内外科学工作者注意和研究的问题。它采用很细小的纤维介质制成，介质空隙小于0.5um。介质过滤介质过滤除菌是目前工业上用的

11、较多的空气除菌方法，它是采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物，而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维等。第三章 传氧与通气搅拌一. 概述1.生化反应器通气与搅拌有两个目的:2. 微生物的临界氧浓度生物的耗氧速率受发酵液的浓度的影响，各种微生物对发酵液中溶氧浓度有一个最低要求这一溶氧浓度叫做“临界氧浓度”。不同的微生物的需氧量不同。同一种微生物的需氧量，随菌龄和培养条件不同而异。菌体生长和形成代谢产物的耗氧量也往往不同。3.溶解氧控制的意义在生物反应过程中，微生物只能利用溶解状态下的氧（最近有报道在气-液界处的微生物也能直接利用气相中的氧）。氧是很难溶解的气体，在25、

12、100MPa下，空气中的氧在水中的溶解度0.25mmol/L。由于微生物不断消耗发酵液中的氧，而氧的溶解度很低，由于微生物在人工环境内比较集中，浓度大；另外在这种稠厚的培养液氧的溶解度比在水中更小。就必须采用强化供氧。近年来，许多好气性发酵已发展到如此地步，以至氧的需求超过现有的生物反应设备的氧传递的能力，其后果是氧传递速率成为产量的限制因素。氧的供应不足可能引起生产菌种的不可弥补的损失或可能导致细胞代谢转向所不需的化合物的产生。了解长菌阶段和代谢产物形成阶段的最适需氧量，就可能分别地合理地供氧。事实上并不需要发酵液中氧的浓度达到饱和浓度，只要维持在氧的临界浓度以上即可。因此，因尽可能了解发酵

13、过程中菌的临界氧浓度和达到最高发酵产物的临界氧浓度，即菌的生长和发酵产物形成过程中的最高需氧量，以便分别合理地供给足够氧气。二. 传氧理论第五章发酵罐的放大 本章重点1、发酵罐的放大基础和准则2、以体积溶氧系数KLa（或Kd）相等为基准的放大法3、以搅拌功耗P0 /VL相等的准则进行反应器放大4、酶反应器的放大基础和准则难点：反应器放大设计计算方法放大过程中与培养-发酵环境相关的主要因素 与细胞形态学、细胞生理学和过程动力学之间的关系与生物反应器中的流体力学性质、传递现象及发酵液的理化性质之间的关系。一、放大目的 产品的质量高，成本低。必须使菌体在大中小型反应器中所处的外界环境完全或基本一致。

14、二、生物学基础三、放大准则与方法 2、放大方法主要有经验放大法、因次分析法、时间常数法、数学模拟法 第二节通气发酵罐的放大设计一、机械搅拌通气发酵罐的功率计算 验放大法 (一)几何相似放大（二）以单位体积液体中搅拌功率P0 /VL相等的准则进行反应器放大 这种方法适用对于以溶氧速率控制发酵反应的生物发酵，粘度较高的非牛顿型流体或高细胞密度的培养 P0/VL 常数 1. 对于不通气的搅拌反应器 2. 对于通气搅拌反应器，可取单位体积液体分配的通气搅拌功率相同的准则进行放大对于通气式机械搅拌生物反应器，可取单位体积液体分配的通气搅拌功率相同的准则进行放大，即：对于不通气时的机械搅拌生物反应器，轴功

15、率计算 （三）以体积溶氧系数KLa（或Kd）相等为基准的放大法在耗氧发酵过程中，由于培养液中的溶解度很低，生物反应很容易因反应器溶氧能力的限制受到影响，所以以反应器KLa的相同作为放大准则，可以收到较好的效果。 这种方法适用于高好氧的生物发酵过程的反应器的放大。在耗氧发酵过程中，培养液中的溶解度很低，生物反应很容易因反应器溶氧能力的限制受到影响，以反应器KLa的相同作为放大准则，可以收到较好的效果。(四)以搅拌叶尖线端速度相等的准则进行反应器放大适用于生物细胞受搅拌剪切影响较明显的发酵过程的放大，例如丝状菌的发酵。搅拌叶尖线端速度（Dn）是决定搅拌剪切强度的关键。叶尖端线速度（五）混合时间相同

16、的准则混合时间是指在反应器中加入物料，到它们被混合均匀时所需的时间。在小反应器中，比较容易混合均匀，而在大反应器中，则较为困难.（六）以单位培养液体积的空气流量相同的原则进行放大单位培养液体积在单位时间内通入的空气量（标准态），即： 以单位培养液体积的空气流量相同的原则进行放大时，有（七）以空气线速度相同的原则进行放大 酶反应器的放大基础和准则酶反应器放大设计计算方法一、酶促反应动力学基础与一般化学反应相比，酶促反应要复杂一些，影响酶促反应的主要因素有：酶浓度，底物浓度，温度压力，溶液的介电常数与离强度，PH、内部结构因素等。最根本的是浓度因素1、零级反应：酶促反应速率与底物浓度无关。2、一级

17、反应：反应速率与底物浓度的一次方成正比。即酶催化AB的过程二、单底物酶促反应动力学1、米氏方程三点据说：（1）底物浓度S远大于酶浓度E时，X的形成不会降低底物浓度S，底物浓度以初始浓度计算；（2）不考虑 E+PES这个可逆反应的存在。（3）ES E+P是整个反应的限速阶段 米氏方程：三、固定化酶促反应动力学固定化酶促反应过程中，需考虑扩散传质与催化反应的相互影响，有外部与内部扩散的不同传质方式，内部扩散与催化反应有时是同时进行的，外扩散通常先于反应。1、外部扩散过程底物由液体主体向固定化酶颗粒表面的扩散速率Ns正比于传质表面积及传质推动力在稳定状态下，传质速率等于酶促反应速率，当反应按米氏方程

18、规则时有：Ns=KLa（SSs）当 SsS时，主体传递阻力可以忽略当Ss远大于S时，整个反应速率由外扩散控制固定化酶的反应体系中效率因子（外扩散）的定义为out2、内部扩散过程对于具有大量内孔的球形固定化酶颗粒，内部是酶促反应的主要场所颗粒内部各处底物和产物的浓度不同，各处的反应速率和选择性有差异。对于球形固定化酶颗粒的内扩散效率因子有酶反应器:酶为催化剂进行生物反应的场所.游离酶反应器、固定化酶反应器（分：固定化单一酶、复合酶、细胞器、细胞等形式） 酶反应器及其操作参数 2连续式酶反应器的流动状态分为理想型与非理想型（1）理想型 活塞式：连续操作活塞式反应式（CPFR continuous

19、plug flow reactor）实用反应器为填充床或膜反应器 活塞式流动：指反应液在反应器内径呈严格均一的速度分布，流动如同活塞运动，反应速度仅随空间位置不同而变化。 全混式：连续操作搅拌式反应式（CSTR continuous-flow stirred tank reactor），为搅拌罐。反应速度仅随时间变化全混式流动：指反应器混合足够强烈，因而反应器内浓度分布均匀，且不随时间而变化。 二、酶反应器设计和操作的参数停留时间停留时间：指反应物料进入反应器至离开反应器止所经历的时间对于CSTR，常用平均停留时间3、生产能力Pr生产能力Pr：单位时间、单位反应器体积内的产物量。分批式操作中：

20、连续操作中：选择性SP：表明整个反应的平均选择性，指从1mol底物S中所得到产物P的摩尔数，由反应的量论关系而决定的。平均选择性 瞬时或局部选择性为三、理想的酶反应器1、CPFR型酶反应器CPFR具备的特点：在正常的连续稳态操作情况下，在反应器的各个截面上，物料浓度不随时间而变化；由于径向有严格均匀的速度分布，故反应速率随空间位置的变化只限于轴向。对CPFR进行物料衡算，沿反应器轴向任意切出长度为dl的一个微元管段作为反应器微元，该微元的体积记为VAdl， 2、CSTR型酶反应器3、CSTR型与CPFR型反应器性能的比较（1）停留时间的比较（2）酶需求量的比较（4）反应器中的浓度分布第五章 固

21、定化酶、固定化细胞一、概述定义：固定化酶、固定化细胞：是一种在空间运动上受到完全约束或局部约束的酶、细胞。固定化酶(immobilized enzyme)：是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。优点：（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；（3）稳定性显著提高；（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；（5）提供了研究酶动力学的良好模型。二、固定化方法(一) 应遵循的几个原则（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，

22、为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。(2)由于酶蛋白的高级结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件，避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等处理。（3）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。（4）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。（5）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应尽可能不妨碍酶与

23、底物的接近，以提高催化效率和产物的量。（6固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。（7）固定化酶的成本适中。工业生产必须要考虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的，以利于工业使用。二、固定化方法四种：交联、包埋、吸附、载体结合1、载体结合体结合法(covalent binding）是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：（1）酶蛋白N末端的-氨基或赖氨酸残基的-氨基。（2）酶蛋白C末端的-羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的-羧基。（3）半胱氨酸残基的巯基。（4）丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基

24、。（5）组氨酸残基的咪唑基。（6）色氨酸残基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。其中最普遍的共价键结合基团是氨基、羧基以及苯环。常用来和酶共价偶联的载体的功能基团有芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。这种方法是固定化酶研究中最活跃的一大类方法，但必须注意，参加共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性非必需基团，如若共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。第六章 发酵过程动力学及模型一、概述1、发酵的实质：生物化学反应。2、发酵过程动力学主要研究各种环境因素与微生物代谢活动间的相互作用随时间而变化的规律。3、研究方法 采用数学模型定量描述发酵过程中影响细胞生长、基质利用和产物生成

25、的各种因素。3、发酵过程的反应描述及速度概念(1)、发酵过程反应的描述(2)、发酵过程反应速度的描述4、发酵反应动力学的研究内容二、分批发酵动力学(一)、对微生物生长过程描述对细胞群体进行描述，而不是对单一细胞；不考虑细胞间的差别；将细胞视为单一组成，不考虑环境对细胞组成的影响（非结构模型）或 考虑环境对细胞组成的影响（结构模型）认为细胞生长过程中，各组分以相同比例增加，即细胞均衡生长；将细胞视为单独的生物相（分离化模型）或将细胞与培养视为同一相（均一化模型）；（二）、分批培养微生物生长动力学Monod方程假设基础：1、细胞的生长为均衡生长；2、培养基中只有一种限制基质；3、细胞生长视为简单的

26、单一反应，细胞得率为常数。Monod方程求解方法代谢产物生成动力学基质消耗动力学1、基质的消耗速率与比消耗速率如果基质仅用于细胞的生长：如果以氧的消耗来计算：2、包括维持代谢的基质消耗动力学要消耗额外的基质产生能量供维持代谢待续进行。3、包括产物生成的基质消耗动力学(1)产物的生成以产能途径进行；如生产ATP、酒精、乳酸等(2)产物的生成不与或仅部分与能量代谢相关联。细胞反应动力学模型的建立一、数学拟合型模型黑箱系统+经验模型不能找到反应过程的本质。获取数据的途径： (a)在正常生产操作中获得实测数据；(b)实验设计获得实测数据。(1)紫外线照射菌体悬浮液与细胞存活率关系P123(2)超声波降

27、解透明质酸的时间与透明质酸相对分子时的关系P124二、机制模型“白箱”系统(1)要求对内在机制有深刻的认识；(2)精确、可靠的基础数据。无条件限制下的微生物种群生长P125三、常规细胞反应动力学模型补料分批发酵过程动力学补料分批发酵介于分批培养与连续培养之间，在发酵的过程中连续或间歇的补加一种或一种以上特定限制性底物。补料分批培养主要适用于代谢产物得率或生成速率受底物影响、细胞的生长状况和培养环境需要调节的过程。 连续发酵过程动力学连续发酵过程指以一定的速度向反应器中流加培养基，同时以相同的速度排出培养液，因而反应器内的液量维持恒定。连续培养有两种形式：恒化器和恒浊器优点：细胞生长速度、代谢活动处于恒定状态能够高速稳定的大量生产;缺点: (1) 开放式操作导致容易染菌；(2) 细胞容易退化。1、单级恒化连续培养模型稀释率D对影响多级连续培养1、单流多级系统2、多流多级系统3、带循环的多级系统