WB实验步骤详细总结.docx

1、WB实验步骤详细总结WB实验步骤详细总结Lt D蛋白提取所有操作在冰上进行1.裂解1)配裂解液：PMSF=100：1，裂解液和PMSF在-20保存，提前一天4解冻取2ml裂解液，加20l PMSF混匀2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，参加600l上述1中液体参加液体与组织比例为20：1，冰上静置10min2.匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头在匀浆机在生化室上每次匀浆10s，两次间隔5s，冰上静置30min3.离心在根底4楼416室1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管，两个标记，加少量超纯水，号是为了离心平衡，对称放置2)将

2、离心机预冷至4为止，以120010r/min离心15min3)用移液枪将上层清液取出放入号管中4.变性上样缓冲液：样品=4：1将样品转移至23个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100变性10min仪器屏幕：S500：10S5100000：105.保存变性结束后，翻开AP管盖放一下气，然后4保存，点样是取出即可用WB实验步骤1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。2.配制别离胶1)准备：1ml枪蓝色枪头，200l枪黄色枪头10l白色枪头2)10%别离胶的配置：用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板5.91ml超纯水4.

3、95ml丙烯酰胺30%避光保存极易失效3.75mlPh8.8TrisHCL150l10%SDS150lAP催化剂促凝作用9lTEMED混合摇匀用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡3.灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速参加别离胶用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封立即用1ml超纯水进行水封利用重力把胶压平，如有气泡那么用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min5.浓缩胶的配制5%4.13ml超纯水1ml丙烯酰胺30%避光保存极易失效750lPh6.8 TrisHCL60l10%SDS60lAP催化剂促凝作用6lTEMED搅拌混匀立即

4、灌胶至溢出，插入梳子10孔或15孔凝胶30min或20min6.电泳电泳液最多使用两次1)安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中参加电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子注意两手平衡拔出防止拔歪2)点样不易时间过长，防止样品条带扩散Mark4lProtern ladder推荐9，实际4已经足够 样品8l7-10l均可内参挑齐即可组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪3)连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，翻开开关恒压电泳先调电压至70mV，跑约20min。Mark跑开，分出彩带即可再调电压至120mV，跑约60min。不能跑过下面的玻璃板注：Mark的条

5、带从红色条带往下依次为：7055403520，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡7.转膜转移液可用3-4次1)剪四层滤纸大小与膜相，近可大不可小浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小胶始终保持湿润2)剪PVDF膜用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜，然后用甲醇活化10s以上3)“夹三明治再大塑料盆中参加少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸胶膜两层滤纸胶的大分子量条带在上方，即在右上方4)安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。参加转膜液至满否那么仪器无法启动5)翻开开

6、关，调节电流至100mA，转膜2h恒流盆中加满冰转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色8.封闭1)配制5%脱脂奶粉：2.5g脱脂奶粉 50mlTBST2)将膜取出放入上述参加了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用2次9.一抗1)用TBST配，每一格加5ml TBST，再分别参加抗体抗体的量：2lPsmad2l免抗1:10005l：5ml58分子量2lPsmad2l免抗1:50010l：5ml58Jnk免抗1:10005l：5ml双带内参小鼠抗GAPH单抗，中杉金桥1:50001l：5ml362)膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中正面朝上3)4冰箱

7、中，慢摇过夜正面朝上，摇床416室10.洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。11.二抗1)用3%的脱脂奶粉1.5g的脱脂奶粉50mlTBST2)每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000，即参加1l注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗那么二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗3)膜分别参加小格，慢摇1-2h常温12.洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。13.显影： U盘 A液，B液显影液。4保存 200l枪+枪头黄 膜置于皿中1)开机后自动预冷，温度降到1-20才可2)显影液现配现用A液：B液=1：13)膜正面朝上放于暗箱，即大分子量再左上角用移液枪吧显影液均匀涂在膜上4)先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s影像的条带粗细深浅一致那么说明已调齐内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。5)每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘试剂配方：