常用作物生理指标测定方法以及叶绿色测定.docx

1、常用作物生理指标测定方法以及叶绿色测定SOD,POD,CAT,MDA,可溶性蛋白用同一提取液。磷酸缓冲液配制：A液（Na2HPO4 0.2M）:Na2HPO4.2H2O=35.61g(或Na2HPO4.12H2O=71.64g)定容1000MLB液（NaH2PO4 0.2M）:NaH2PO4.H2O=27.6g(或NaH2PO4.2H2O=31.21g)定容到1000ml浓度mol/lPH值A液体积mlB液体积ml定容体积ml0.057.891.58.54000.17.584162000.17.061392000.16.012.387.72001/157.06139300130mmol/l甲硫

2、氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml0.75mmol/l氮蓝四唑（NBT）溶液：称0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存0.1mmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml0.02mmol/l核黄素溶液：取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存反应液组成 水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na2：FD=5：30：6：6：6：6150ml反应液的组成是水12.7ml+磷酸（0.05M,PH=7.8）76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA=Na215.2

3、5ml+FD15.25mlSOD：称取0.5g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L PH=7.8），冰浴研磨，研磨后再加入1ml缓冲液倒入离心管，再用2ml缓冲液冲洗研钵，倒入离心管中，平衡后低温（0-4）10000rpm离心后10min冷藏保存。取相同型号的试管，加入20l上清液（2支对照管加缓冲液），分别加3ml反应液，其中一支对照放于暗处，其余在4000lux下反应20-30min（温度高时时间短，温度低时时间长）后再560nm下进行比色。计算公式：SOD总活性（units.g-1FW）=(Ack-A)*V/Ack*0.5*W*a(V酶液总体积4ml，w样品重=0.5g，a测定是

4、的酶液体积=0.02ml)POD：取上清液20l加入比色杯中（对照加磷酸），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每个1min读1次（读0，1，2，3min）的OD值。反应液：0.1mol/L，PH=6.0的磷酸50ml,加入愈创木酚28l，于磁力搅拌器加热溶解，加入30%的H2O219l存于冰箱内。计算公式：POD总活性（OD470/Min.gFW）=OD470*V/a*W(V=4ml,a=0.02ml,W=0.5g)CAT：取上清液100l加入比色杯中（对照加磷酸），加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每个1min再读一次（读第0，1min的OD值）。反应液：0.

5、1mol/L PH=7.0磷酸缓冲液20ml，加入0.1mol/LH2O2(5.68ml30%H2O2定容至1000ml)5ml。计算公式：CAT总活性（OD240/Min.gFW）=OD240*V/a*W(V=4ml,a=0.1ml,W=0.5g)数值下降。MDA: 取上清液1ml(对照加1ml水），加2mlTBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15min，迅速冷却（用冷水冲泡），倒入指形管中，4000转下离心20min,取上清液于600nm,532nm,450nm下比色。0.67%TBA：称0.67gTBA加少量1mol/LNAOH溶解，再用10%三氯乙酸定容100ml。MDA(g/gFW)=

6、C*V/W=0.1548(D532-D600)+0.013D450(V=0.012L,W=0.5g)可溶性蛋白：取上清液20l（对照加水），加3ml考马斯亮蓝放置2min，立即于595nm比色。G-250：称取100mgG-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%（v/v）磷酸100ml，定容至1000ml，常温可保存一个月。计算公式：蛋白质含量（mg/gFW）=3*Y*V/5*1000*a*W标准曲线Y=143.15OD+3.6（生理组）或Y=143.56OD+1.28（园艺系） V酶液总体积=4ml,a=0.02ml,W=0.5g，3/5由于标线是5ml中的含量，而本方法用3ml，100

7、0将g变为mg)可滴定酸：1.取一彩椒，称重，放入高速组织捣碎机内，加入等量水，捣碎 12min。每 2g 匀浆折算为 1g 试样。2.称取25-50g，用无CO2水100ml，洗入250ml容量瓶，在80度水浴中30min，取出冷却，用无CO2水定容过滤。3.取滤液50ml或100ml加入三角瓶中。加酚酞5-10d，用NaOH标液滴定，呈微红色，当滴定接近终点时，若溶液仍呈橙黄色，可再加2d酚酞，CK空白滴定。记下所消耗的体积。结果计算（1）试样的可滴定酸度以每 100g 或 100mL 中氢离子毫摩尔数表示，按下式计算：可滴定酸度mmol/100g(mL)=（cV1）/V0250/m(V)

8、100式中：c氢氧化钠标准溶液摩尔浓度V1滴定时所消耗的氢氧化钠标准溶液体积(mL)V0吸取滴定用的样液体积(mL)m(V)试样质量(g)或体积(mL)250试样浸提后定容体积(mL)（2）试样的可滴定酸度以某种酸的百分含量表示，按下式计算：可滴定酸度（%）(cV1k)/V0250/m(V)100式中：k换算为某种酸克数的系数， 0.1Mol/LNaOH标液：50gNaOH加入500ml蒸馏水，溶解贮于塑料瓶中，吸取5.4ml加入1000ml容量瓶中，用刚煮沸冷却的蒸馏水稀释至刻度。0.5%酚酞：0.5g酚酞加入100ml90%乙醇。本试验用水应是不含二氧化碳的或中性蒸馏水,可在使用前将蒸馏水

9、煮沸、放冷,或加入酚酞指示剂用0.1mol/L氢氧化钠溶液中和至出现微红色。植物组织中游离氨基酸总量的测定：（茚三酮溶液显色法）水合茚三酮试剂：称取0.6g再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15ml正丙醇，搅拌使其溶解。再加入30ml正丁醇及60ml乙二醇，最后加入9mlPH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶中，置4下保存备用，10d内有效。乙酸-乙酸钠缓冲液（PH5.4）：称取乙酸钠54.4g加入100ml无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至60ml左右。冷却后转入100ml容量瓶中加30ml冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至100ml。标准氨基酸：称取80下烘干的亮氨酸46.8mg，溶

10、于少量10%异丙醇中，用10%异丙醇定容至100ml。取此液5ml，用蒸馏水稀释至50ml，即为含5g/ml氨基酸之标准液。0.1%抗坏血酸：称取50mg抗坏血酸，溶于50ml无氨蒸馏水中，随配随用。1.样品制备：取干样，混匀后，迅速称取0.05-0.1g,于研钵中加入5ml10%乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100ml。混匀，并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。2.制作标准曲线：取6支20ml刻度试管，按下表操作：试剂123456标准氨基酸/ml00.20.40.60.81.0无氨蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.0水合茚三酮/ml3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸/ml0

11、.10.10.10.10.10.1每管含氮量/ml012345加完试剂后混匀，盖上大小适中的玻璃球，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60%乙醇定容至20ml。混匀后再570nm下测定吸光度。3.样品测定：吸取样品滤液1.0ml，放入20ml干燥试管中，加无氨蒸馏水1.0ml，向每管中加入3.0ml水合茚三酮，0.1ml抗坏血酸。加完试剂后混匀，封口，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热形成的红色被逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60%乙醇定容至20ml。混匀后再570nm下测吸光度。

12、根据标准曲线查得含氮量。 计算公式：100g样品中氨基态氮含量=（C*Vt/Vs*W）*100 (C为从标准曲线查得的氨基态氮含量，g；Vt为样品稀释总体积，ml; Vs为测定时样品体积，ml；W为样品干重，g) 注意：（1）因为茚三酮与氨基酸反应所生成的Ruhemans自在1h内摆出稳定，故稀释后尽快比色；（2）严格掌握加入抗坏血酸的量；（3）在80水浴中加热，应该适当延长反应时间，效果良好。可溶性糖：0.3g鲜样品（或0.03g干样）加入10ml蒸馏水，封口沸水浴30min（2次）,滤纸漏斗过滤入50ml容量瓶中，冲洗残渣，定容。吸提取液1ml加入蒸馏水1ml（对照加2ml蒸馏水），加蒽酮

13、乙酸乙酯0.5ml，加浓硫酸5ml，振荡，沸水浴1min，自然冷却后与630nm下比色。计算公式：可溶性糖（%）=100*Y*V/(a*n*W*106）(Y由Y糖(g)=322.58OD-0.96774查得 V提取液体积=50ml a测定时吸取的体积=1ml n为稀释倍数 W鲜样品重=0.3)叶绿素测定：取新鲜叶片，擦净表面污物，去掉中脉，用打孔器取叶圆片，混匀，称取叶圆片0.2g，加20ml 80%的丙酮（80ml丙酮定容于100ml），封口，置于暗处24-36h，到叶片变白，于663nm,646nm,470nm下比色（对照是80%丙酮）。公式：Ca(mg/L)=12.21D663-2.81

14、D646 Cb=20.13D646-5.03D663 Cx.c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229 叶绿体色素含量（mg/gFW）=C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)根系TTC活力：根系去掉根尖和上部老根，取根0.4-0.5g,剪成2cm长的段，放入试管中，对照先加入1mol/LH2SO4,其余试管中加入0.4%TTC和磷酸缓冲液（1/15mol/L,PH=7.0）等体积混合液10ml，封口，放入37恒温箱4h，取出，除对照外其余加1mol/L H2SO42ml中止反应，放置15min后取出根，吸干，再放回原试管，各试管中加入10ml 95%乙醇，封口，

15、提取24h至根变白，根据颜色稀释3-5倍后，于485nm下比色。40个样用量：0.4%TTC称1gTTC，溶于250ml蒸馏水中。 1/15mol/L PH=7.0 取A=61ml+B液=39ml 稀释到300ml 1mol/L H2SO4: 先在烧杯中加入100ml水，再加入浓硫酸11ml，冷却后定容200ml。计算公式：四氮唑还原强度（g/gFW.h）=(OD+0.0035)/4*h*W*0.0022 (h=4 W=0.4-0.5g)茎粗(为第一叶痕茎基部的粗度，用游标卡尺测量，每处理随机取5株，取其平均数); 测定方法 茎粗为用游标卡尺测量地上部第三节间的直径。分3次对茎粗进行观测(5-

16、6片叶之间)。株高(茎基部到生长点的长度，卷尺测量，每处理测5次，取其平均数);节间长度(为最终一次采收时，测分枝以上五个节间的长度之和除以5)。辣椒：叶面积、冠幅、株高测定。每个处理的每个区组随机抽样10株,每个处理30株用于上述项目测定。在每株第一轮分枝(主枝)上量1片最大叶,取30片叶的平均值作为处理的叶面积;冠幅量每株的最大冠幅处;株高量自然株高。叶面积：在每株第一轮分枝(主枝)上量1片最大叶,取30片叶的平均值作为处理的叶面积叶面积一：LI-3000A叶面积仪测定叶面积测定方法二： 样品采集 在样地内，对垂柳（ ）、榆树（ ）、国槐（ ）、刺槐（ ）、紫荆 （ ）、大叶黄杨（ ） 种

17、绿化树种，每种选取 片大小不一、发育正常且展开的叶片。为保证叶片大小的随机性，于每树冠东、西、南、北各采 个枝组，将枝条迅速放入保鲜膜内，以防止叶片因蒸腾水分而变形。带回实验室后，放入冰箱内保存，测定时取枝条上部和下部的叶片（叶片的大小和年龄不一）。去除残破和畸形叶片，每片叶的长和宽连续测量 次，取平均值。然后马上描形。 实验设计 从叶片基部剪取叶片，精确测量叶片的长和宽（单位：）。用万分之一天平称复印纸的重量（此步骤在采集枝条前做完，以节省时间，减小误差）。 复印纸的面积为 。将叶片固定在 复印纸上，准确描形，剪形。用万分之一天平称量剪形纸片的重量。根据剪形纸片的重量复印纸的重量和面积，换算

18、出叶片的准确面积。测定方法 在每个施肥处理小区，分别选冠层发育良好的健康分枝，取倒数第 片完全展开的叶子 片，用叶面积扫描仪扫描叶片测定叶面积。试剂药品的配制75%的酒精：75ml的95%的酒精加水定容至95ml。1N 盐酸：取8.25ml的浓盐酸，加蒸馏水定容至100ml。1N NaOH：称8g NaOH，用蒸馏水定容至200ml。30%KOH-甲醇溶液：用250ml的烧杯称60gKOH，慢慢加入甲醇，在通风厨中进行，沸腾，不断搅拌，待完全溶解后，最后加甲醇至烧杯200ml刻度线即可。该试剂要现配现用。KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。6N

19、 HCl（HCl:H2O1:1）：等量的浓 HCl等量的蒸馏水。10%醋酸：10ml的冰醋酸中加入90ml的蒸馏水。10%氨水：10ml的氨水中加入90ml的蒸馏水。10%的蔗糖溶液：10g蔗糖用80ml的蒸馏水溶解，最后用蒸馏水定容至100ml。1%的碘碘化钾溶液：碘、碘化钾各1g溶于100ml的蒸馏水中。盐酸甲醇（乙醇溶液）得制备有几种方法：常规1：用浓硫酸缓慢滴加到浓盐酸中，用无水氯化钙干燥通入无水甲醇中，直到重量增加到你需要的浓度为至。这是实验室常用的。二：直接购买。这氯化氢甲醇溶液有的卖。三：用浓硫酸缓慢滴加到氯化钠、三绿化铝中，用无水氯化钙干燥通入无水甲醇中，直到重量增加到你需要的

20、浓度为至。这也是实验室常用的，但是效率不高，容易结块。三：盐酸乙醇溶液制备，最经典的一种化学制备法。将一定量无水乙醇加到三口瓶中，搅拌冷却至0度后，滴加所需含HCl浓度的乙酰氯，此间温度不大于15度，即得无水HCl-EtOH溶液，当然含有少量乙酸乙酯，不会影响后继反应。石蕊指示液 取石蕊粉末10g,加乙醇40ml,回流煮沸1小时，静置，倾去上层清液， 再用同一方法处理2次，每次用乙醇30ml,残渣用水10ml洗涤，倾去洗液，再加水50ml煮 沸，放冷，滤过，即得。变色范围 pH4.58.0（红蓝）。甲基红指示液 取甲基红0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液7.4ml使溶解，再加水稀 释至

21、200ml，即得。 变色范围 pH4.26.3（红黄）。甲基红亚甲蓝混合指示液 取0.1甲基红的乙醇溶液20ml，加0.2亚甲蓝溶液 8ml，摇匀，即得。甲基红溴甲酚绿混合指示液 取0.1甲基红的乙醇溶液20ml，加0.2溴甲酚绿 的乙醇溶液30ml，摇匀，即得。甲基橙指示液 取甲基橙0.1g，加水100ml使溶解，即得。变色范围 pH3.24.4（红黄）。甲基橙二甲苯蓝FF混合指示液 取甲基橙与二甲苯蓝FF各0.1g,加乙醇100ml使溶 解，即得。甲基橙亚甲蓝混合指示液 取甲基橙指示液20ml,加0.2亚甲蓝溶液8ml,摇匀， 即得。甲酚红指示液 取甲酚红0.1g，加0.05mol/L氢氧

22、化钠溶液5.3ml使溶解，再加水稀 释至100ml，即得。变色范围 pH7.28.8（黄红）。水果、蔬菜及其制品亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定一、原理在弱碱性条件下，用热水从样品中提取亚硝酸离子（NO2）和硝酸离子（NO3），然后用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，过滤。分取两整份溶液：一份直接加磺胺和萘乙二胺盐酸盐，在波长538nm处测量生成的红色复合物的吸光度，计算样品中原有的亚硝酸离子含量；另一份用金属镉还原硝酸离子为亚硝酸离子，然后同上显色，测量样品中原有的亚硝酸离子和硝酸离子还原生成的亚硝酸离子的总量，由二者之差计算硝酸离子含量。二、试剂（1）饱和硼砂溶液：称取50g硼酸钠，溶于1000ml温

23、水中，冷却至室温。（2）亚铁氰化钾溶液：0.25mol/L。称取106g亚铁氰化钾溶于水，定容至1000ml。（3）乙酸锌溶液：1mol/L。称取220g乙酸锌，溶于30ml冰乙酸和水的混合液中，再用水定容至1000ml。（4）显色溶液： 溶液 称取0.4g磺胺，放入盛有160ml水的200ml容量瓶中，在沸水浴上加热溶解。冷却后（必要时过滤）加入20ml盐酸（=1.19g/ml），用水定容，避光保存。 溶液称取0.1g萘乙二胺盐酸盐（含量98.5%以上），放入100ml容量瓶中，加水溶解后定容，避光保存。 溶液量取445ml盐酸（=1.19g/ml），放入1000ml容量瓶中，加水定容。（5

24、）锌棒：长约150mm，直径57mm。（6）硫酸镉溶液：200g/L。称取40g硫酸镉于200ml容量瓶中，加水溶解后定容。（7）镉粒：置锌棒于盛有200ml硫酸镉溶液的高型烧杯中，及时用刮勺将还原生成的镉刮下来，并用捣碎机打碎，再用0.1mol/L盐酸处理镉粒，然后用蒸馏水冲洗数次，保存于蒸馏水中备用。（8）氨缓冲液（PH9.6）：称取37.4g氯化铵，溶于900ml水中，用浓氨水（=0.88g/ml）调节PH至9.6，再用水稀释至1000ml。（9）亚硝酸钠标准储备溶液：称取在1155下烘至恒重的亚硝酸钠0.1500g，于50ml容量瓶中，加水溶解后定容。此溶液含亚硝酸离子2000mg/L

25、。用移液管吸取亚硝酸钠标准储备溶液5ml于1000ml容量瓶中，用水定容。该溶液为标准工作溶液，含亚硝酸离子10g /ml，宜现用现配。（10）活性炭：粉末状。三、样品的制备 将新鲜水果、蔬菜洗净，晾去表面水分，用四分法取可食部分，切碎，按比例加入一定量水，用捣碎机制成匀浆，但在称取试样时，应扣除加水量。四、分析步骤（1）试样中亚硝酸盐、硝酸盐的提取 依试样中亚硝酸盐和硝酸盐的含量的大小，准确称取匀浆样220g（精确到0.001g）或准确量取220ml。放入200ml烧杯中，加入5ml饱和硼砂溶液和100ml（7080）热水；置沸水浴中，加热15分钟，并不断摇动。取出后冷却至室温，再加入10m

26、l亚铁氰化钾溶液，10ml乙酸锌溶液和2g活性炭粉，每次加后均充分摇匀。然后定量转入200ml容量瓶中，用水定容。用折成槽纹的滤纸过滤，得无色清亮提取液。（2）工作曲线的绘制 用移液管吸取亚硝酸钠标准溶液（10g /ml）0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分别置入7个50ml容量瓶中，各加水至30ml，然后加入5.0ml溶液和3.0ml溶液混匀，置于室温下遮光处，再加入1.0ml溶液，混匀，3分钟后用水定容，即得每50ml中分别含0、5、10、15、20、25、30g亚硝酸离子的系列标准工作溶液。于15分钟内，在分光光度计上，用1cm光径吸收池，以零管调零，于波长53

27、8nm处测其吸光度。以吸光度为纵坐标，50ml中亚硝酸离子的质量为横坐标，绘制工作曲线。（3）亚硝酸盐的测定 用移液管吸取提取液10ml于50ml容量瓶中，用水稀释至约30ml，加入溶液 5ml，再加入溶液 3ml，混匀。置于室温遮光处，再加入溶液 1ml，混匀，3分钟后用水定容，于15分钟内，用1cm吸收池，以空白溶液调零，在波长538nm处测其吸光度。从工作曲线上查得相应的亚硝酸离子质量（g）。同一试样应做两个平行测定，同时做空白试验。（4）硝酸盐的测定用移液管吸取提取液10ml于50ml带塞锥形瓶中，加入5.00ml蒸馏水，5.00ml氨缓冲液（使总体积为20ml）和2g镉粒（加前用滤纸

28、吸干镉粒上的水分），盖好瓶塞，置振荡机上振荡5分钟，过滤弃去部分初滤液，收集滤液于大试管中。 用移液管吸取还原滤液10ml于50ml容量瓶中，显色步骤同（3），在分光光度计上，用538nm波长 、1cm光径吸收池，以空白试验作参比液调零，进行比色测定，读取吸光度，从工作曲线上查得相应的亚硝酸离子质量。计算硝酸离子还原后的亚硝酸离子总量，从中减去试样亚硝酸离子含量，再乘以1.348即为硝酸离子含量。同一试样应做两个平行测定，同时做空白试验。五、计算 1、亚硝酸离子含量：（mg/kg）= （m1200）/（m0V1） m1： 从工作曲线上查得的测试液中亚硝酸离子的质量（g） m0： 匀浆样的称取量

29、，（g） V1： 测定时吸取的过滤液体积（ml） 2、硝酸离子量（mg/kg）=1.348（m22002）/（V2m0）-（m1200）/（m0V1） m2：从工作曲线上查得的测试液中亚硝酸离子的质量（g） V2：硝酸离子还原为亚硝酸离子后的过滤液整取体积（ml） 2：硝酸离子还原前后吸取液的体积比值1.348：亚硝酸离子还原为硝酸离子的系数m1、m0、V1的含义同上。可溶性糖：0.3g鲜样品（或0.03g干样）加入10ml蒸馏水，封口沸水浴30min（2次）,滤纸漏斗过滤入50ml容量瓶中，冲洗残渣，定容。吸提取液1ml加入蒸馏水1ml（对照加2ml蒸馏水），加蒽酮乙酸乙酯0.5ml，加浓硫

30、酸5ml，振荡，沸水浴1min，自然冷却后与630nm下比色。计算公式：可溶性糖（%）=100*Y*V/(a*n*W*106）(Y由Y糖(g)=322.58OD-0.96774查得 V提取液体积=50ml a测定时吸取的体积=1ml n为稀释倍数 W鲜样品重=0.3)叶绿素测定：称取叶片0.2g，加20ml 80%的丙酮（80ml丙酮定容于100ml），封口，置于暗处24-36h，到叶片变白，于663nm,646nm,470nm下比色（对照是80%丙酮）。公式：Ca(mg/L)=12.21D663-2.81D646 Cb=20.13D646-5.03D663 Cx.c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229 色素含量（mg/gFW）=C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)根系TTC活力：根系去掉根尖和上部老根，去跟0.4-0.5g,剪成2cm长的段，放入试管中，对照先加入1mol/LH2SO4,其余试管中加入0.4%TTC和磷酸缓冲液（1/15mol/L,PH=7.0）等体积混合液10ml，封口，放入37恒温箱4h，取出，除对照外其余