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1、痢疾杆菌分离与鉴定课件痢疾杆菌的分离与鉴定濮阳市疾病预防控制中心许银怀第一节 概 述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌， 引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.610万、印度972.310万；发达国家相对较低，如美国61210万、德国2.710万、法国0.310万；我国上世纪5080年代发病率在46.371018.9310万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对

2、细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国宋内志贺菌75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在79月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊

3、和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。第二节 病 原 学一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分 A、B、C、D 4个群及35个抗原型。2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分为多种亚型。(二)表面(K)抗原 常在新分离的A、C、D群各血清型及B群的2a型、6型细菌中出现。 K抗原存在时，可阻止菌体抗原与相应

4、免疫血清发生凝集；需经10030分钟加热破坏后露出菌体抗原，与相应的免疫血清发生凝集。二、血清分群(一)A群(志贺痢疾杆菌):有12个血清型;具有K抗原菌株可阻碍O抗原的凝集;在我国常见的为2型(又称司密斯杆菌)，1型较少见，其余各型更为罕见。(二)B群（福氏痢疾杆菌） 具有型、群抗原；型抗原存在于同型菌株中；群抗原有多种，存在于B群各菌型中。 近年1C（I:7）、2b（:3,4;7）、3c（:6）、4c（:7,8）及4型（:-）等新型菌株出现。 目前有6个血清型，（14个亚型及2个变种)。(三)C群(鲍氏痢疾杆菌):18个血清型。(四)D群(宋内痢疾杆菌):仅一个血清型(、相);相(光滑型菌

5、落)多从急性期感染病人标本中分离;相亦称R型(粗糙型菌落)常从慢性患者或带菌者检出。三、属间抗原关系 志贺菌属与埃希菌属的O抗原关系非常密切，有近半数的菌型与大肠埃希氏菌的某些O抗原完全相同；相同抗原菌属间存在血清交叉凝集反应。表1 志贺菌属与大肠埃希菌的O抗原关系 O抗原完全相同O抗原部分相同志贺菌属大肠埃希菌志贺菌属大肠埃希菌志贺菌属大肠埃希菌A2 112ac A1 1,120C1 2,(50)A3 124 A2149C2 87ab,96A4 3588-51 A3 164C3 85A5 58 A4 88,159C4 149A12 152 A6 130C6 76B2b 147ab A7 12

6、1C9 102B3a 5444-80 A8 38,23C10 105acB4b 135 A9 144C12 7B5 129 A11 29C13 28ac,98C1 149 A12 3C15 83C4 53 B群1,2,13,16,1719,6269,73,3438-51C16 47C5 79C17 124C7 4838-69C1829,可能C8 143C11 105abC14 32Cl5 112ab注： D群宋内菌与类志贺邻单胞菌O17抗原相同。四、菌群分布与变迁 菌群分布与变迁因国家、地区、年份不同而异。 40年代前A群是优势流行菌,60年代初几乎销声匿迹，但1969-1970年突然在中美地

7、区暴发，1972-1978年又在南亚的孟加拉国连年发生流行，继之印度、斯里兰卡、马尔代夫、尼泊尔、不丹、缅甸、泰国等地区和国家受到侵袭。 D群从60年代起在许多工业发达国家跃居首位。 国内过去流行菌型为2a为主;近年来4、4c、5b、1a等菌型呈上升趋势；城市D群为上升态势。 我国个别地区发现A1型和C18型局部暴发流行。五、溶原性 噬菌体对相应的细菌具有特异性裂解作用,温和噬菌体DNA侵入宿主细胞后，整合于宿主细胞的染色体DNA上，称为前噬菌体； 前噬菌体与宿主细胞的染色体同时复制，这个过程称为溶原化； 被感染的细菌称为溶原性细菌。 溶原性细菌对于相同的噬菌体具有免疫力，并获得一些新的性状，

8、称为溶原性转换。 该转换可导致福氏志贺菌型抗原和群抗原发生广泛的变异。六、变异性 (一) S-R变异 志贺菌属菌落可由光滑型变异成为粗糙型(S-R变异)，并常伴有生化反应、抗原构造和致病性的变异。 在慢性痢疾病人或恢复期病人体内，菌株可变异成为不典型菌株。部分变异菌株可通过10的胆汁肉汤培养发生返祖，成为典型菌株。因而在分离这类细菌时注意要反复多次地检查。(二) 抗原变异(溶原性转换) 根据溶原性转换变种和细胞壁多糖免疫化学分析,福氏志贺菌除 6型菌外其它型、亚型以及变种都是由一个种所产生的许多溶原性的变种。 y变种是非溶原性的前体型，当被六种不同的噬菌体溶原化后， 可以变为各型福氏菌的a亚型

9、或x变种，这是第一次溶原化； 一次溶原化的培养物，还可以发生第二次溶原化，变为各型福氏菌的b亚型。 福氏型特异性抗原、和群7,8抗原，均以y变种群3,4抗原多糖为前体型，经温和噬菌体溶原性转换而来。 噬菌体()7,8溶原化的结果是使群7,8抗原变为x变种，同时群3,4抗原成为隐蔽状态； 前体型经、溶原化结果，则是相应型抗原的产生，分别变为2a、5a、1a、4a等型。其中x变种、2a型和5a型还可以经第二次的溶原化，变为2b型和5b型。 群6抗原是群4抗原乙酰化（,6溶原性转换）所致；型抗原为群3,4复合抗原乙酰化的结果。福氏1a型和4a型的群4抗原乙酰化后出现群6抗原，变为1b型和4b型，但此

10、时型抗原成为隐蔽状态,仅当型抗原、消失时显现。 宋内志贺菌相抗原受控于一个140Mda大质粒，若质粒丢失，相抗原不能合成，菌则从相转变为相。(三) 毒力变异 志贺菌的2型肠毒素（ShET-2）、粘附性、侵袭力、胞内繁殖、细胞间扩散等活性编码基因均存在于一个140Mda的质粒上，其表达受染色体上多个基因的调控。该调控基因的变异或大质粒的丢失，均可造成毒菌株的毒力减弱或消失。 七、致病性(一)侵袭力：菌毛-有利于菌粘附至肠粘膜(二)毒 素： 通透性增加内毒素 局部 作用于肠壁 粘膜炎症、溃疡 全身 内毒素血症外毒素（A群1型） 与内毒素协同作用 加重局部和全身症状 志贺菌具有抗酸性，能顺利通过胃酸

11、屏障进入肠道，侵袭于结肠粘膜上皮细胞，引起炎症反应。 有研究表明最小感染剂量为10个CFU。 产生的SHET1肠毒素是染色体编码毒素，主要见于福氏志贺菌；SHET2是质粒编码毒素，志贺菌和侵袭性大肠杆菌均能产生。 痢疾志贺菌可产生志贺毒素（ST），为染色体编码，由1个A亚单位和5个B亚单位构成，具有肠毒性、细胞毒性和神经毒性。第三节 实验室分离一、标本的采集和运送(一) 标本的采集 腹泻病人粪便标本： 监测点人员发现疑似病人和腹泻病人后，立即发给病人洁净塑料袋，要求其接取自然排出的可疑粪便部分立即送检； 婴幼、儿童则让其父母协助其坐排于罩有干净塑料袋的痰盂内(要求勿混入尿液)。 用2个棉拭子分

12、别在大便中可疑部分多点蘸取并旋转棉拭子使全部蘸满大便（约1-2克）。 将绵拭子插入装有Cary-Blair运送培养基的采样管中(注意培养基应埋住粪便拭子)，手接触的棉签尾部在管口处折断丢弃。 编号后将采样管置4冰箱或冷藏包中保存。 认真填写腹泻病人粪便采样表。 监测点/村医需配备和更换的监测材料: 腹泻病人粪便采样登记表。 消毒棉签。 装有Cary-Blair运送培养基的采样管(4保存可备用半年)。 采便塑料袋。 冷藏包(应每日更换冰排) 。(二) 标本的运送 采集标本后应立即通知监测点运送标本人员，或每天分中午、下午两次送交实验室。 如当天晚上采集，最长保存时间最好是48小时内。二、实验室分

13、离技术(一)选择分离培养基 直接划线分离于麦康凯（MAC）及木糖赖氨酸去氧胆酸钠(XLD)，也可选志贺-沙门菌琼脂(SS) 、去氧胆酸钠硫化氢乳糖琼脂(DHL)、去氧胆酸钠柠檬酸盐琼脂(DCA)或海克顿肠道琼脂(HE)。 但慎用SS，其可抑制志贺菌1型生长常造成漏检。表2.志贺菌及大肠菌在选择培养基上菌落生长特征选择性培养基志贺菌大肠埃希菌菌落颜色、形态菌落大小菌落颜色、形态菌落大小MAC无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形23a，b粉红或红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则34XLD粉红或无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形12a，c黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则23DCA

14、无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形23a粉红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则34HE绿色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形23a黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则34SS无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形12d粉红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则23注：a：志贺痢疾菌1型菌落生长较小； b：不含结晶紫的市售培养基干粉不适 于志贺菌属的选择分离；c：志贺痢疾菌1型在XLD上生长菌落非常细小； d：志贺痢疾菌1型常被抑制生长。木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂（XLD)：木糖；赖氨酸5g；乳糖7.5g；蔗糖7.5g；去氧胆酸钠2.5g；硫代硫酸钠6.8g；柠檬酸铁铵；酚红。去氧胆酸

15、钠柠檬酸盐琼脂（DCA）:乳糖10g；去氧胆酸钠1g；柠檬酸铁1g；中性红0.03g。 (二)病原分离 用接种环多点沾取粪便标本中可疑部分,或用采样拭子涂种，直接划线分离选择琼脂平板各一块（见示意图4）； 36培养1824小时。如无菌生长或接种过密应重新分离平板（可取菌苔处）（合格的分离平板菌落数150个）。图4 采样拭子接种平板及划线分离方法示意图(三) 菌落生长特性 志贺菌属是需氧或兼性厌氧杆菌。 经37培养1824小时，形成圆形、稍凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、无色、半透明、直径约2mm的较小菌落； 相对宋内菌的生长菌落较大、扁平，较不透明，易出现粗糙型菌落。 志贺痢疾杆菌1型的营养需

16、求比较高，必须补给15种氨基酸方能生长。(四) 生化初筛1.可疑菌落的观察和挑选： 许多细菌在选择性培养基上被抑制，既不发育也未死亡，有的能长出肉眼看不见的小菌落。 因而在观察、挑取可疑菌落时应用接种针挑取菌落中心，避免接触培养基表面以造成污染。2.接种生化反应管： 从选择培养平板上挑取可疑菌落3-5个，用接种针挑取菌落中心，分别接种KIA和MIU； 先接种KIA(将接种针在其斜面上划直线，随之插入底层,取出后再在斜面上划密集的横线)，不经火焰直接穿刺接种MIU培养基； 置361培养1620小时后观察结果。3.生化反应鉴别： KIA：斜面黄(分解乳糖产酸)红(不分解乳糖)； 底部红(产碱,非发

17、酵菌)黄(分解葡萄糖或乳糖)产气产H2S； MIU：动力(M)沿接种线周围向外扩散生长呈现混浊者为阳性(用未接种MIU管对比观察)。 吲哚(I)培养基变红为阳性。 尿素(U)加0.5mlKovacs试剂，数分钟内表层试剂变深红色为阳性。 表3.用克氏双糖(KIA) 和 动力-吲哚-尿素(MIU)生化反应 初步鉴别痢疾志贺菌与其它肠道菌 菌种名称斜面底层H2S动力吲哚尿素氧化酶痢疾志贺菌(A群)KAD福氏痢疾菌(B群)KAD鲍氏痢疾菌(C群)KAD宋内痢疾菌(D群)KA伤寒沙门菌KA+W+大肠碱性-殊异株KA+普罗菲登斯菌KA+摩根变形杆菌KADD+雷极变形杆菌KAD+小肠结肠炎耶氏菌KAVD+

18、气单胞菌属KA-+邻单胞菌属KA+弧菌属KA+爱德华氏菌属K+哈夫尼亚菌属DA+注：K碱性反应（红色）；A产酸（黄色）；产酸（黄色）产气；D不定（K或A）；W = 弱或迟缓 反应； 某些福氏6型产气；鲍氏痢疾菌血清13和14型产气；侵袭性大肠菌无动力。4.注意事项： KIA管最好用棉花塞,若用螺旋帽或硅胶塞，将盖子拧松一些,使有足够的氧气促进反应; MIU需用橡皮胶塞盖紧，因尿素酶反应需避开氧气。经46小时培养可先观察MIU管尿素酶反应，若为红色多为变形杆菌；再经361过夜培养后观察反应结果。 当KIA出现AA反应时，应检查KIA管是否塞得过紧，若太紧应将塞子松一下后，放2-3小时再观察一次。

19、 初筛中KIA底层不产气不一定分解葡萄糖不产气，应用带倒管的单糖管复核。 KIA斜面不产酸不一定是乳糖阴性，应用单糖管观察14天才能确定阴性或迟发酵。 ONPG(半乳糖苷酶)试验阳性是迅速判定乳糖迟发酵的可靠方法；乳糖阴性的菌株，除耶氏菌ONPG为阳性外，其余均为阴性。 若KIA斜面为黄色(酸性)，则不宜做氧化酶试验(因氧化酶可被酸性pH所抑制，出现假阴性反应),此种情况应将培养物转种至不含糖的培养基上,待生长后再做氧化酶试验。 有时MIU培养基表层呈红色，应检查穿刺线是否插到底，若已穿刺到底，培养基一半以上变红则判阳性。若穿刺到底仅表层变红，可能是细菌在有氧条件下分解蛋白胨产碱变色，暂不能判

20、为阳性，应继续培养观察。五、血清鉴定 用生化初筛符合志贺菌反应的KIA管斜面菌苔，做志贺菌玻片凝集血清凝集； 阳性者在营养琼脂平板上分纯，挑单个菌落穿刺保存到半固体保存管 详细记录试验结果并填写菌种登记表。(一)方法与步骤：1.挑取KIA生化反应符合痢疾菌的培养物，首先用四种多价血清做玻片凝集反应(4种多价包括：A群1、2型；B群和D群)。凝集者则用B群多价、D群和A1、A2、血清分别凝集，阳性者再选用相应的群多价或单价因子血清做凝集。若多价血清不凝集，可能为C群或A群的312型，应进行C群的四种多价和A群另三种多价血清做玻片凝集。 2.福氏多价血清凝集的菌株,可先用群3,4、6和7三种因子血

21、清检查,根据因子血清凝集反应再依次选用可能的型因子血清做凝集。在群因子血清中凝集反应可能的血清型3，467+-1a，2a，2b，4a，5a，6，y+-1b，3b，4b+-+2b-+3a-+-3c-+1c，2b，4c，5b，x-4，63.最近几年出现的新的血清型抗原式，目前世界上并没有统一；分离较多的国家多沿用此抗原式。部分我们国家近年出现的。 抗原式血清型 :-4 :74c :63c :71c :3,4；72b4.若四种多价血清凝集,与相应的群血清均不凝集,且菌落较粗糙，应考虑宋内相(R相)菌。可用宋内菌相（粗糙型）血清做凝集反应。5.每次均需要做盐水凝集对照试验；尤其当发现较脆或较粘稠的菌落

22、时，盐水对照可排除自凝菌。6.属于本地区未报道或极少见的志贺菌型，应慎重报告并送上一级实验室或国家级实验室复核确认。(二) 特别处理：一般通过血清学试验，可鉴定到群、型或亚型，但遇到不典型志贺菌（与相应的血清不凝集或凝集不完全）时，可做如下处理： 取可疑菌划线接种于营养琼脂平板，3618小时培育后,挑取数个菌落做玻片凝集,如不凝继续传代，也可用琼脂斜面与肉汤替换传代，一般经510代后，有些菌恢复其凝集力，否则可排除志贺菌。有些新鲜分离的培养物(A、C、D群各血清型及B群的2a型、6型)生化符合志贺菌反应，但与志贺菌属诊断血清不发生凝集，应考虑可能存在K抗原而阻止分型血清与菌体O抗原发生凝集，处

23、理方法如下： 取待检菌纯培养菌一满接种环于0.51ml生理盐水中制成浓厚菌液，置于100水浴中煮沸30分钟，冷至室温后再用诊断血清进行玻片凝集。(三) 交叉凝集反应：1. A3与动力+/-、产气量少大肠菌存在交叉凝集；2. F1、F1c、F4、F4b与动力+/-、产气量少的大肠菌存在交叉凝集；3. F4a与深红沙雷菌存在交叉凝集；4. F4c、x变种与蜂房哈夫尼亚菌属存在交叉凝集；5. C17与克雷伯菌属存在交叉凝集；6. 宋内I相菌株与类志贺邻单胞菌存在交叉凝集，注意用氧化酶试验加以鉴别。表6 福氏志贺菌型和亚型的型抗原和群抗原鉴别表型和亚型型抗原群因子血清凝集3，467，81a1b1c2a

24、2b（）3a3b3c44a4b4c5a5b6（）x变种y变种注：凝集；不凝集；（ ）个别菌株系阴性反应。六、鉴别试验 虽然经血清学证实、初步生化鉴定符合可基本定为志贺菌,但因部分志贺菌型与EIEC部分血清型有密切的抗原关系，而且EIEC同样具有侵袭力(可使豚鼠角膜试验阳性),因此需做相关鉴别试验。表7 志贺菌属与具有相关抗原的EIEC生化鉴别表鉴别菌型鉴别试验甘露糖吲哚蔗糖乳糖动力EIEC O112ac:K66+/-/+-志贺2型（A2）-+-鲍氏1型（C1）+-鲍氏15型（C15）+-鉴别菌型鉴别试验甘露糖吲哚醋酸盐产气动力EIEC O124:K72+(+)+/-+/-志贺3型（A3）-鲍氏

25、17型（C17）+-鉴别菌型鉴别试验甘露糖吲哚鸟氨酸产气动力EIEC O136:K78+/-+/-志贺3型（A3）-鲍氏1型（C1）+-鉴别菌型鉴别试验甘露糖吲哚粘液酸产气动力EIEC O152:K+/-志贺12型（A12）-鉴别菌型鉴别试验甘露糖吲哚醋酸盐柠檬酸盐动力EIEC O164:K+(+)(+)-志贺3型（A3）-七、系统生化鉴定 一般实验室可做下列生化试验：醋酸盐、丙二酸钠、西蒙柠檬酸盐、V-P、苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、氰化钾生长、水杨苷发酵等试验，志贺菌属均为阴性反应。 生化反应与血清学鉴定相不符合的菌株，不能诊断为志贺菌属细菌。 有条件的实验室可选用符合国内或国际质量标准

26、的市售生化反应板或鉴定卡做进一步的鉴定试验： API20E生化鉴定系统：采用手工21项生化试验，分RapiD 20E(4小时快速报告结果)和API 20E(24小时报告结果)两种板，不需做补充生化试验。该方法操作简便，结果重复性好，方便携带，较适用于现场疫情调查处理，目前为许多实验室使用。 RapIDONE系统：氧化酶阴性革兰阴性杆菌的鉴定用，20个试验项目；该方法操作简便，结果观察只需2种试剂。八、菌种保存(一) 短期保存： 志贺菌营养需求相对较高,在KIA斜面上，放4冰箱一般可存活23周。若穿刺到半固体培养基上,37过夜培养,再用胶塞或螺旋帽密封,或者加lcm厚的液体石蜡,放4冰箱可存活半年至1年；若用鸡蛋斜面保存,会存活得更好。(二) 长期保存： 1.30甘油-肉汤保存：方法是将培养物悬浮于含2030中性甘油的肉汤中,然后-70冻结。若无-70冰箱,也可用-20冰箱保存,存活时间要短些。2.冷冻干燥保存：将细菌接种于琼脂斜面上, 37培养18小时,把斜面上菌苔混悬于脱脂牛奶中,分装菌种冷冻干燥保存管中,每支0.20.3ml,迅速冷冻,真空抽干；真空状态下封口保存。一般可存活数年