流式细胞仪临床应用手册.docx

1、流式细胞仪临床应用手册第一部分 流式细胞术简介1 流式细胞术定义流式细胞仪是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器，为生物医学与临床检验学发展提供了最强有力的工具。流式细胞分析技术(flow cytometry，FCM)又称流式细胞术，是20世纪70 年代发展起来的一种快速、准确、客观的检测技术，它能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞或微球的多项物理及生物学特性-在极短的时间内高速分析上万个甚至是几十万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，对其加以定性定量分析，还可以对特定群体加以分选。目前，流式细胞术已经广泛用于临

2、床应用与基础研究，在免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等医学与生命科学所有领域内发挥着重要的作用。2 流式细胞仪工作原理制备成单细胞悬液的标本或单个微粒在上样前进行荧光染色。流式细胞仪检测到上样管后，产生一定的气体压力将待测样本压入流动池。同时鞘液（不含细胞或微粒的缓冲液）在仪器产生的高压作用下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与样本流形成一定的角度，形成一个圆形的鞘液流，包围着细胞或微粒高速流动，使待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，逐个地通过流式细胞仪的激光聚焦区（流动池），从而被检测到，并发出散射光及荧光等多种光学信号。光学信号通过光电信号转换器及电子信号处理系统采集

3、及分析后，最后以图形的形式将数据结果显示在电脑屏幕上。3 流式细胞仪的主要结构光学系统，液流系统，信号处理及放大系统，计算机系统。4 流式细胞仪检测信号 散射光信号：FS SS 荧光信号：FL1 FL2 FL3 FL4 5 流式结果数据分析双参数点图分析双参数点图分析单参数直方图分析三维图分析双参数密度图分析双参数等高图分析6 流式细胞仪检测样品可用于流式细胞仪检测的样本种类多样，包括各种细胞（如外周血、骨髓、细针穿刺、灌洗液、实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等；血清、血浆、培养上清、细胞裂解液等。如果检测样本为实体组织时，我们可以用物理化学（天然，机械研磨/消化）等方法

4、将其制备成单细胞悬液5105 1107 cells/ml，并在上机前用300目筛网过滤。7 流式细胞仪检测范围细胞结构细胞功能细胞大小细胞表面/ 胞浆 / 核的特异性抗原细胞颗粒度细胞活性细胞表面面积细胞内/外细胞因子核浆比例酶活性DNA含量和细胞周期激素结合位点RNA含量、蛋白质含量细胞受体 蛋白磷酸化钙离子浓度 第二部分 流式项目检测列表序号项目名称项目内容参考值标本要求1淋巴细胞亚群T细胞亚群EDTA或肝素抗凝全血0.51mlT淋巴细胞CD3+727 %辅助/诱导性T细胞（Th，Ti）CD3+CD4+439 %抑制/杀伤性T细胞（Ts，Tc）CD3+CD8+309 %Th/TsCD4/C

5、D81.420.89B淋巴细胞CD3-CD19+11.562.54 %NK细胞CD3-CD(16+56)+14.914.87 %2细胞免疫表型CD45RA/CD45ROEDTA或肝素抗凝全血0.51ml幼稚/静止T细胞CD45RA+CD45RO-记忆性T细胞CD45RA-CD45RO+活化T细胞CD45RA+CD45RO+ CD3/CD4/CD29辅助性T 细胞（Th）CD3+CD4+CD29+16.925.35%诱导性T 细胞(Ti)CD3+CD4+CD29- CD3/CD8/CD28抑制性T细胞（Ts）CD3+CD8+CD28- 15.995.13%杀伤性T细胞（Tc）CD3+CD8+CD

6、28+ 13.224.18%调节性T细胞CD4+CD25+FOXP3+3淋巴细胞亚群活化程度分析HLA-DR总活化T淋巴细胞静止T淋巴细胞活化B淋巴细胞CD3+HLA-DR+ CD3+HLA-DR-CD3-HLA-DR+3.11.3 %67.1011.69%7.423.22 %EDTA或肝素抗凝全血0.51ml活化的辅助性/诱导性T细胞CD4+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD8+HLA-DR+4细胞因子检测Th1/Th2Th1: IFN-18.75.03 %EDTA或肝素抗凝全血0.51mlTh2：IL-42.990.72 %5HLA-B27检测HLA-B27/HLA-B7HLA-

7、B27+/HLA-B7-阳性标准：HLA-B27+/HLA-B7-百分比80%，同时平均荧光强度8.0EDTA或肝素抗凝全血0.51ml6造血干细胞造血干细胞相对计数造血干细胞绝对计数CD45/CD34CD45/CD34,绝对计数微球0.580.29 %EDTA或肝素抗凝全血0.51ml7白血病/淋巴瘤免疫分型急性白血病1） 初治AL 分型粗分首选基本抗体：CD45、CD10、CD19、CD34、CD13、CD33、CD7、CD117、HLADR、MPO、cCD3、CD79a2）AL 细分推荐选择抗体：AML：CD15、CD11b、CD64、CD4、CD16、CD41、CD61、CD71、GP

8、A、CD56T-ALL：CD4、CD8、CD3、CD5、CD2、CD1a、CD16、CD56、TdT、TCR、TCRB-ALL：CD20、CD22、CD38、/、EDTA或肝素抗凝骨髓或外周血慢性淋巴增生性疾病（CLD）/淋巴瘤First: CD5,CD19,kappa,lamdaCD3,CD20,CD23,CD10,CD45B-cell:CD22,FMC7,CD11c,CD103，CD38,CD25,CD79b,heavychain，(约12-15Ab)T-cell:CD4,CD7,CD8,CD2,CD56，CD16, TCR/，TCR/，(16个Ab)特殊用途: CD30,bcl-2,Td

9、T，CD1a,CD34,CD71EDTA或肝素抗凝骨髓或外周血淋巴瘤组织8T细胞受体TCR系列检测TCR V1-249多药耐药基因检测P糖蛋白检测CD24310PNH诊断CD55/CD59红细胞CD55/CD59粒细胞CD55/CD59CD55+95%,CD59+90%CD55+95%,CD59+90%EDTA或肝素抗凝全血0.51ml11网织红细胞/网织血小板网织红细胞网织血小板TO网织红：0.0050.024%EDTA或肝素抗凝全血0.51ml12血小板相关检测血小板相关抗体IgA,IgG,IgM枸橼酸钠抗凝全血0.51ml血小板膜表面糖蛋白CD41/CD42a/CD61血小板活化功能CD

10、61/CD62p/CD6313细胞周期DNA周期和倍体分析DNA分析诊断肿瘤 1.出现非整倍体细胞峰， DI1.1或DI15% 3.无明显的异倍体，但G0/1的CV10%，S期在10% -15% 4.S+G2/G1/0 20%EDTA或肝素）抗凝全血（0.51ml）,胸水、腹水、尿液、灌洗液、穿刺液（2106细胞），穿刺、活检各种实体组织（0.1cm3以上）14细胞凋亡细胞凋亡检测AnnexinV/PIAnnexinV/7-AAD第三部分 流式细胞术在各类疾病中的应用第一章 感染性疾病自有人类以来，就有感染性疾病。感染性疾病又称“传染病”，严重时甚至可以改变了人类的历史文明。如十四世纪蒙古帝国

11、的兴起，骁勇善战的骑兵把鼠疫传播至欧洲，造成欧洲中世纪的黑死病，流行四五百年之久，许多城市因鼠疫流行而荒芜甚至消失。感染性疾病的治疗就是一场病原体与机体免疫系统的战争，当感染发生时，免疫系统的变化往往能很敏感地反映感染的状态与程度。因此，对机体免疫系统的检测有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察，监测药物疗效，判断疾病的预后。检测项目及临床意义1 淋巴细胞亚群感染科FCM指标（外周血）CD3+CD3+CD4CD3+CD8+CD19+CD3-CD16+56+CD4+/CD8+肝炎慢性丙肝病毒性中型肝炎肝硬化细胞病毒感染流行性出血热成人麻疹儿童麻疹传单登革热乙脑HIV感染术后CMV感染2 细胞免疫

12、表型、淋巴细胞活化程度分析CD45RO+CD45RA+的活化细胞增高；术后感染的评价：术后感染CD3、CD4、CD8、NK、HLA-DR；鉴别急性/慢性病毒感染，判定抗病毒药物治疗效果：急性感染性疾病及病毒感染进展期，CD45RO记忆性T细胞增高；慢性感染性疾病或接受抗病毒治疗后，记忆性T细胞降低。3 细胞因子检测3.1 移植术后监测：急排Th1；3.2 细胞外感染：Th2；细胞内感染：Th1；3.3 作为过敏性哮喘、过敏性皮炎治疗的评价指标：Th2；3.4恶性肿瘤：Th2；3.5自身免疫病：Th1；3.6 耐受：Th2；4 中性粒细胞CD64抗原检测正常：中性粒细胞CD64指数（中性粒细胞C

13、D64平均荧光强度/淋巴细胞CD64平均荧光强度）1；感染或组织损伤：中性粒细胞CD64指数1。第二章 肿瘤、细胞治疗应用肿瘤中的应用 免疫系统能够通过免疫机制对肿瘤进行特异性应答和非特异性应答，该过程涉及多种免疫细胞及其分泌的产物,它们相互影响，相互调节，相辅相成，共同完成免疫监视功能。虽然机体有免疫监视机制，但肿瘤仍发生并持续发展，原因是肿瘤细胞存在多种免疫逃逸机制。众多临床实验和研究表明，宿主对机体内发生的肿瘤免疫逃逸，表现为特异性的细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫低下。众所周知，机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，体液免疫由B细胞（CD3-CD19+）介导，非特异性免疫以NK细胞（CD3-

14、/CD56+16+）。T淋巴细胞进一步分为辅助性T淋巴细胞(Th，CD3 /CD4 )和细胞毒性/抑制性T淋巴细胞(Tc/Ts，CD3 /CD8 )，Th和Tc对于抗原刺激的应答，辅助性T淋巴细胞分泌细胞因子抑制肿瘤细胞，Ts则抑制机体免疫功能。所以肿瘤患者的免疫力低下表现为CD3+，CD3+CD4+，CD3-CD56+CD16+， CD19+含量明显低于正常人，而且CD4/CD8比例倒置。所以了解评估肿瘤患者的免疫状态有重要的临床意义。检测项目及临床意义1 在肿瘤进展和预后中的意义 国内外研究表明肿瘤的进展和预后取决于肿瘤细胞的侵润性与机体免疫功能的变化。所以连续监测肿瘤患者的免疫状态是肿瘤

15、患者病程监控和预后的重要指标。已有众多报道乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、食管癌等肿瘤，当病程进展、转移或者复发时机体的T细胞、B细胞、NK细胞整体减低。特别是抑制性免疫细胞比例增加是肿瘤预后的非常重要的指标。Gilberto Filaci报道在结肠癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌等患者中，从T1-T4分级CD8+CD28-Ts细胞明显增高（P0.01），而且CD8+CD28-增高程度与患者的生存期明显相关（P1.1或DI15%；4.3 无明显的异倍体，但G0/1的CV10%，S期在10% -15%；4.4 S+G2/M 20%。临床意义FCM指标（外周血）CD3+CD3+

16、CD4+CD3+CD8+CD3-CD16+56+CD4+ CD25+ CD8+CD28-CD4+ CD45RO+CD3+HLADR+CD4+/CD8+Th1Th2肿瘤进展 预后不良 复发转移有效手术 有效化疗生活质量差 细胞治疗应用细胞治疗可以利用某些具有特定功能的细胞来治疗疾病。现在细胞治疗在造血及免疫系统疾病、肿瘤性疾病、心血管系统疾病、神经系统疾病、肌肉骨骼相关疾病、糖尿病等多种疾病的临床治疗中得到广泛的应用。特别成为肿瘤辅助治疗的重要手段，其中过继性免疫治疗在肿瘤中应用最广。细胞免疫治疗的关键是输注细胞的数量和质量，因而在体外培养出大量、高质量的效应细胞成为治疗效果。检测项目及临床意义

17、1 CIK和DC-CIK在肿瘤细胞治疗中应用CIK是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CIK细胞中的效应细胞是主要来源于CD4-CD8+细胞的CD3+CD56+细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此，应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细胞与DC细胞共培养可使CIK细胞获得更快的增殖速率和更强的抗肿瘤活性，利用DC-CIK免疫治疗联合放化疗及手术治疗，有助于减少恶性肿瘤的转移与复发，进一步提高临床疗效。2 干细胞治疗 干细胞作为一类既有

18、自我更新能力、又有多分化潜能的细胞，具有非常重要临床应用价值，所以现正日益广泛地用于各种血液病、肿瘤及某些遗传性疾病的治疗。应用最广泛的是造血干细胞移植，就是给完全丧失造血功能的患者通过中心静脉输入造血干细胞，使患者骨髓恢复再造血功能的一种治疗方法。主要适用于再生障碍性贫血等造血功能障碍性疾病、急、慢性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等造血系统肿瘤。现在自体造血干移植也用在乳腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等实体肿瘤经超大剂量化疗后、全身放疗后的骨髓功能的重建。在造血干细胞移植过程中，需要根据移植者的体重来确定移植细胞数量，而且需要保证移植的干细胞的功能 ，所以造血干细胞移植前准确定量干细胞数量和活

19、性非常重要。FCM检测项目临床意义CD45+CD34+7AAD-造血干细胞采集、培养过程中监测干细胞数目和活性；移植前根据体重不同确定输入数量CD3+CD8+监测移植者免疫状态,CIK培养过程中监测CIK诱导情况CD3+CD4+监测移植者免疫状态,CIK培养过程中监测CIK诱导情况CD3+CD56+监测移植者免疫状态,准确知道CIK培养过程中CIK细胞数量CD11C+骨髓来源DC成熟标志，监测诱导分化DC细胞数量CD80+/CD86+DC活化标志DC1（髓系DC）/DC2（淋巴系DC）细胞治疗前后检测周血中含量了解免疫状态和治疗效果第三章 血液系统疾病检测项目及临床意义1 白血病淋巴瘤（见白血

20、病淋巴瘤病例分析手册）2 贫血网织红细胞计数，评价疗效。3 血小板减少3.1再生障碍性贫血等：血小板计数：在血小板3%提示血小板活化，有凝血倾向。5 阵发性睡眠性血红蛋白尿PNH实验室诊断金标准，CD55、CD59，正常人阳性表达95%，患者表达下降或缺失。第四章 器官移植检测检测项目及临床意义1 骨髓移植CD34+造血干细胞计数，保证移植所需细胞量。2 移植后监测2.1 排斥反应的评价 CD3+/CD25+高于正常5-10%以上，表明即将或已发生排斥反应； CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染，0.2%则必须停用免疫抑制剂； CD3+/HLA-DR+增加5-10%且不伴有CD25+增加提示

21、巨细胞病毒感染； CD4+/CD45RA+及 Th17数量与急性排斥反应严重程度正相关； NK细胞（CD3-CD16+56+）是参与急性免疫排斥反应的重要效应细胞； Th1（CD4+INF+）是介导急慢性免疫排斥反应的主要细胞。2.2 排斥反应的调控 Treg（CD4+CD25+CD127dim）对移植后急慢性排斥反应起负调控作用； DC细胞：mDC细胞抑制免疫排斥反应的发生，pDC通过Treg维持免疫耐受。第五章 风湿免疫性疾病风湿免疫系统疾病主要包括风湿病和免疫病。 风湿一词起源于古希腊。公元前4世纪，希波克拉底全集有关人体解剖一文中认为：人体的体液由于湿冷而下注于四肢、内脏引起疾病，即为

22、风湿。我国黄帝内经(公元前5世纪)也把风寒湿三气杂合为痹。因为风湿病大多累及关节而引起疼痛，所以风湿这一词一直沿用至今，风湿病是一种全身性疾病，主要累及结缔组织，大多数病人有关节、肌肉的病变。与机体的免疫学异常有关，是属于自身免疫性疾病。因此，对机体免疫系统的检测能有效地帮助判断疾病的发生及监控治疗疗效，判断预后。检测项目及临床意义1 淋巴细胞亚群及绝对计数疾病FCM指标（外周血）CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3-CD16+56+CD4+/CD8+自身免疫性疾病SLE类风湿性关节炎 自身免疫性溶血性贫血重症肌无力免疫缺陷病AIDSCD4+T淋巴细胞记数测定的主要意义： 用于HIV

23、感染者的疾病分期：凡CD4+T淋巴细胞200/l或CD4+T淋巴细胞的百分比14%的HIV感染者可归入艾滋病。 判断HIV感染者的临床合并症（各种机会性感染与CD4+T淋巴细胞的相关性），如CD4+T淋巴细胞200/l时，很容易发生卡氏肺囊虫肺炎；而巨细胞病毒感染和鸟分支杆菌感染常发生于CD4+T淋巴细胞50/l的病人，极少见于CD4+T淋巴细胞100/l的病人。 帮助确定抗HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗的适应症，例如，当CD4+T淋巴细胞200/l时，应给予抗卡氏肺囊虫肺炎的预防性治疗。 抗HIV药物疗效的重要判断指标。2 淋巴细胞免疫表型分析淋巴细胞免疫表型分析联合淋巴细胞亚群分析，

24、能更全面的评价细胞免疫状态，评估机体的免疫功能，监测药物疗效，判断疾病的预后。如：风湿性关节炎关节液中CD4+CD29+细胞增多。多发性硬化（MS）、SLE患者外周血CD4+CD45RA+细胞减少。3 HLA-B27检测HLA-B27是MHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达，其表达与强直性脊柱炎高度相关，在其它血清阴性骨关节病也有明显表达。强直性脊柱炎HLA-B27阳性率超过90%Reiters 综和症HLA-B27阳性率为70-90%银屑病性关节炎HLA-B27阳性率为50-70%葡萄膜炎HLA-B27阳性率为40-50%第六章 呼吸系统疾病T淋巴细胞是抗原特异性淋巴细胞， 它不仅具有识别体外多种“非己” 抗原和排除抗原能力，且对免疫应答起重要的调节作用。重症肺炎患者T淋巴细胞因大量凋亡而总数降低，亚群的变化又造成免疫功能的紊乱。且感染因素对患者T细胞活化障碍，机体的细胞免疫功能具有抑制作用，导致机体免疫力下降。因此，检测T淋巴细胞亚群具有非常重要的临床意义。支气管