植物组织培养的一些注意事项1.docx

1、植物组织培养的一些注意事项1植物组织培养的一些注意事项(1) 植物组织培养的一些注意事项 一、常用培养基主要特性 1、高盐成分培养基包括MS、LS、BL、BM、ER 等培养基。其中MS 培养基应用最广泛,其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高, 微量元素种类齐全, 其养分数量及比例均比较合适, 广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。LS、BM、ER 培养基由MS 培养基演变而来。 2 、硝酸钾含量较高的培养基包括B5 、N6 、LH、GS 等培养基。 B5 培养基B5 培养基除含有较高的钾盐外, 还含有较低的铵态氮和较高的盐酸硫胺素, 较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养。 N6

2、培养基N6 培养基( 朱至清等1975 ) 系我国学者创造, 获国家发明二等奖, 适用于单子叶植物花药培养, 柑橘花药培养也适合, 在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好。 SH 培养基是 矿盐浓度较高的一种培养基, 其中铵与磷酸是由磷酸二氢铵 ( NH4 H2 PO4 ) 提供的, 这种培养基适合于某些单子叶及双子叶植物的培养。 3 、中等无机盐含量的培养基 H 培养基本培养基大量元素约为MS 培养基的一半, 仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低, 微量元素种类减少, 而含量较MS 为高, 维生素种类比MS 多。适于花药培养。 尼奇培养基(Niotsch 1969 ) 此培养基与H 培养基成分基本相同

3、, 仅生物素比H 培养基高10 倍。也适合于花药培养。 米勒培养基(Miller 1963 ) 此培养基和Blaydes(1966) 培养基二者成分完全相同。适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用。 4 、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基。有以下几种: 改良怀特培养基(White 1963 ) WS 培养基(Wolter Skoog 1966) 克诺普液( Knop 1965 ) 花卉培养上用得多。 贝尔什劳特液(Berthelot 1934) HB 培养基( Holley Baker 1963) 此培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎 1 尖培养中效果良好。其成分是大量元素比1/ 2 克诺普

4、( Knop ) 液稍多, 微量元素用贝尔什劳特液, 每升培养基中加0 . 5ml。 二、与培养基有关的一些细节问题 1、培养基所用药品应采用等级较高的化学纯CP(三级) 及分极纯AR(二级) , 以免杂质对培养物造成不利影响。 2、调节PH也可用精密pH试纸(应在干燥器中保存, 以免吸湿而失效)。培养基过酸的可用1mol/ L 氢氧化钠( NaOH) 来调节; 培养基过碱的可用1mol/ L 盐酸( HCl ) 来调节( 1mol/ L NaOH 的配制方法是称40gNaOH, 溶解后加入蒸馏水, 定容到1 000ml 即可。1mol/ L HCl 的配制方法是量取12mol/ L HCl

5、84ml , 加水定容至1 000ml)。经高压蒸汽灭菌后, 由于某些成分的分解(如蔗糖的分解) 或氧化, 酸度会增加( pH 值一般可降低0 . 2 )。有时玻璃器皿质量较差, 其中一部分物质溶解, 也会影响酸度的变化。这些在调整pH 值时都要考虑进去。分装后应立即灭菌, 若因故不能及时灭菌, 最好放入冰箱中在24h 内完成灭菌工作。灭菌时压力表读数为0 . 8kg/ cm2 1 . 1kg/ cm2 , 121时保持15min20min 即可。 3、某些生长调节物质, 如吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等物质遇热不稳定, 因此不能进行高压灭菌, 而需用过滤方法灭菌, 经过滤灭菌的溶液, 可在琼

6、脂培养基温度下降到大约40时加入到已高压灭菌的培养基中。 4、配好的培养基可放到培养室中预培养3d ,若没有污染反应, 则证明是可靠的, 可以使用。暂时不用的培养基最好置于10下保存, 含有生长调节物质的培养基在45低温下保存则更理想。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制一周内用完, 其他培养基至多也不能超过一个月。一般情况下, 两周内应用完, 以免干 燥变质。 三、培养材料及消毒 1、取材季节的影响：大多数植物应在其生长开始的季节采样, 生长末期或已进入休眠期, 则外植体对诱导反应迟钝或无反应。 2、器官的生理状态和发育年龄：沿植物的主轴, 越向上的部分所形成的器官其 2 生长的时间越短, 其

7、生理年龄也越老, 越接近发育上的成熟, 越易形成花器官。反之, 越向下, 其生理年龄越小。木本植物的组织培养中, 以幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条较好, 下胚轴与具有3 对4 对真叶的嫩茎段, 生长效果也较好 。一般情况下, 幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力。 3、材料大小的影响：材料越小成活率越低, 茎尖培养存活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1 个2 个叶原基, 约0 .2mm0 .3mm 大小。叶片、花瓣等约为5mm2 , 茎段则长约0 .5mm。因此, 除非用于去除病毒否则不宜将外植体切的过小。但并不是说外植体越大越好, 外植体过大易造成污染, 有实验证明外植体越大污染率越高。

8、 4、材料的灭菌：一般是组织越大越易污染, 夏季比冬季带菌多，甚至不同年份污染的情况也有区别。取材最好选在中午或下午, 避开阴雨天取材可减少污染率。消毒是为了消灭病菌, 以保证无菌组织培养的进行。但不同植物及一株植物不同部位的组织, 其带菌程度不同, 它们对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样。最初所使用的消毒剂种类, 浓度及消毒时间的长短都要进行摸索, 以达到最佳的消毒效果。 材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温- 80 ,对与难消毒的根及地下部位材料 可将其浸入消毒液中进行抽气减压, 以帮助消毒液的渗入, 从而达到彻底灭菌的目的。潘学峰等( 1998) 报道, 12% 的双氧水+ 0

9、 .1%的升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌10min 的效果最好。 四、材料的接种 1、接种室的消毒：植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术, 做好接种室的消毒是至关重要的。污染的主要 2、初代培养物的建立 1）、保证无菌 2）、条件合适：首先, 一定要选择好合适的作物种类、品种及培养的部位; 其次,一定要选择合适的培养基, 激素及其他添加物; 还要注意掌握适宜的环境条件。所以在进行一种植物的组织培养之前, 应查找该种植物有关方面的资料, 根据这种植物过去所采用的培养部位、培养基、培养条件和培养技术等, 再决定自己的工作步骤。 3）、操作技术过关 3、污染的防治 1）、植物材料的选择

10、及防止污染 通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多; 老的材料比幼嫩的材料带菌多; 田间生长的材料比温室生长的材料带菌多; 带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多。为此对于培养材料的取材就应很认真地加以选择, 以减少污染的发生。 用茎尖作外植体时, 应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中, 使其发枝, 然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体, 便可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养, 待抽出徒长的黄化枝条时取材, 也可明显地减少污染。 对木本植物等难以消毒的材料可采用多次灭菌法。如将切好的外植体放入1 . 3%次氯酸盐溶液中

11、(商品漂白粉25%的溶液)消毒30min , 然后用无菌水冲洗3 次, 6 再放在无菌条件下,次日用2 . 6%次氯酸钠灭菌30min , 然后用无菌水冲洗3 次。也可采用多种药液多次浸泡法,以加强灭菌效果。 材料内部易感染病菌, 在这种情况下, 必须在培养基中加入抗生素类, 防止初代培养物污染。 2）、人为污染的防止 接种前应用肥皂将手仔细洗净后, 再用70%酒精擦洗双手, 并需及时剪除指甲。在工作中特别要注意避免交叉感染, 双手必须清洁, 工具则用一次即需消毒一次。工作人员呼吸所产生的污染, 主要是接种时说话或咳嗽所引起的, 因此, 操作时严禁谈话, 并应戴上口罩, 也应穿工作服, 戴工作

12、帽。 污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染, 这种细胞为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌( Bacillus lenlus) , 它外被荚膜, 耐高温, 一般消毒剂难以杀死。它可随培养材料、用具等传播; 它可出现在培养基表面, 或呈滴形云雾状存在于培养基内。若出现应严格灭菌, 清洗用具, 更换消毒酒精。 4、防止外植体褐变 1）、褐变的影响因素 褐变是由于组织中的多酚氧化酶被激活, 使细胞的代谢发生变化, 酚类物质被氧化后产生醌类物质, 这类物质呈棕褐色, 它们会逐渐扩散到培养基中, 抑制其他酶的活性, 毒害培养的材料。褐变的影响因素是复杂的, 随植物种类、基因型、外植体的部位及生

13、理状况等的不同而危害的程度也有区别。 材料本身的生理状态不同, 接种后褐变的程度也不同。如在欧洲栗的培养中, 用 7 幼年型的材料培养含醌类物质少, 而用成年型材料培养时含醌类物质多。而在卡德利亚兰的培养中, 较短的新生茎致褐物质含量高, 而较长的新生茎致褐物质含量低, 另外致褐物质的含量也因季节的不同而不同, 冬季褐变少, 夏秋季褐变最严重, 存活率最低。在枝条上取芽的时期及所取部位不同也有区别, 如欧洲栗取1 月后半月的芽培养则醌的形成少, 而在5 月6 月取芽培养则醌类物质发生严重。在第一至第四个芽的生长期单宁类物质合成多, 因此, 接种后褐变也严重。油棕用幼嫩外植体( 如胚)培养较少褐

14、变, 而用高度分化的叶片接种后则容易褐变。总之, 分生部位接种后形成的醌类物质少, 而分化的部位则形成的醌类物质较多。 培养基成分过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化。例如油棕用MS无机盐培养基容易引起外植体的褐变, 而用降低了无机盐浓度的改良MS 培养基时则可减轻褐变, 而且可获得愈伤组织和胚状体。激素使用不当时, 材料也容易褐变。细胞分裂素6 - 苄基氨基嘌呤或激动素有刺激多酚氧化酶活性提高的作用, 这在甘蔗的组织培养中表现十分明显。在外植体最适宜的脱分化条件下, 分生能力强的细胞大量增殖, 酚类的氧化会受到抑制。在芽旺盛增殖时, 褐变也被抑制。此外, 培养条件不适宜, 如温度过

15、高或光照过强, 均可使多酚氧化酶的活性提高, 从而加速被培养组织的褐变。 培养时间过长接种后材料培养时间过长, 未及时转移, 也会引起材料的褐变, 甚至导致全部死亡, 这在培养过程中是经常可见的。 2）、褐变的防止 选择适当的外植体和培养条件： 选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要的手段。外植体应有较强的分生能力, 在最适宜的细胞脱分化和再分化的培养条件下, 使外植体处于旺盛的生长状态, 便可大大减轻褐变。 抗氧化剂的作用：在培养基中加入抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮( PVP)、半胱氨酸等抗氧化剂, 或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养, 可减轻醌类物质的毒害。 连续转移：对于易褐变的材料

16、, 进行连续转移, 可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用。 8 六、试管苗的增殖与继代培养 （一）、加快试管苗的繁殖速度 1、试管苗繁殖类型 试管繁殖类型共有五种：微型扦插型、丛生芽增殖型、器官发生型、胚状体发生型、原球茎发生型，一定要注意其遗传稳定性, 前三种途径一般能保持遗传稳定性。 2、试管繁殖速率及计算 统计试管苗增殖速度, 有以苗为单位, 也有以芽或未生根的小茎作单位的, 以原球茎球状体或胚状体因难以统计, 则以瓶为单位。大多数以芽和苗作单位。 试管苗理论上一年能繁殖多少, 可用下面的简单公式计算: Y = mXn Y = 年繁殖数 m = 无菌母株苗数 X = 每个培养周期增殖的倍数

17、 n = 全年可增殖的周期次数 例如月季每5 周转接一次, 甲品种每次增殖3 倍, 乙品种每次增殖5 倍, 丙品种每次增殖7 倍, 假定一开始都是一个芽, 那么这三个品种一年能繁殖多少呢? 根据公式可知: n =365d/35d= 10 .4 , 即每年可转接10 次, 那么这三个品种年繁殖率分别计算如下: 甲品种Y = 131 0 = 59 000 = 5 .9104 乙品种Y = 151 0 = 9 760 000 = 9 .76106 丙品种Y = 171 0 = 282 000 000 = 2 .82108 从上可知甲品种每5 周转接一次, 一年可繁殖出5 万多苗, 乙品种每周期增殖5

18、 倍, 一年可得900 多万苗, 而丙品种每周期增殖7 倍, 一年可繁殖出2 亿苗来。 不过实际值远比理论值为低。因为实践中要受到多种因素制约, 困难很多。但理论计算可以作为一个计算产量的指标, 提供参考, 有它的积极意义。 3、提高繁殖速度的方法 不仅试管苗的繁殖类型不同, 而且在试管内又受到基因型、外植体 然后转移到降低浓度或没有生长素的培养基上使其成熟、萌发和生长。 培养基中, 还可加入其他附加成分, 如氨基酸、水解乳蛋白( LH ) 300mg/ L500mg/ L、水解酪蛋白(CH) 200mg/ L500mg/ L, 以及腺嘌呤(ADE) 1mg/ L80mg/ L 等, 以促进试

19、管苗的生长。 2）、改善培养条件:试管苗增殖与培养条件如温度、光照、湿度、培养器皿和培养基的pH值密切相关, 需要进行控制, 以促进繁殖。 七、保持试管苗的继代培养 1、试管苗的继代方法 1）、液体培养 2）、固体培养 2、影响试管苗继代培养的因素及解决措施 1）、驯化现象：有些植物在开始的继代培养中需要添加生长调节物质, 其后加 入少量或不必加入生长调节物质就可以生长, 此现象就叫做“ 驯化”。 2）、在长期的继代培养中, 材料自身内部要发生一系列的生理变化, 除了前面讲的“ 驯化”现象外, 还会出现形态发生能力的丧失。 一般认为分化能力衰退主要有三个因素: 第一、愈伤组织中含有从外植体启动

20、分裂时就包括进来的成器官中心（分生组织），当重复继代则会逐渐减少或丧失，这意味着不能形成维管束，只能保持无组织的细胞团。 第二、形态发生能力的减弱和丧失也可能与内源生长物质的减少或丧失有关。 第三、也可能是细胞染色体出现畸变，数目增加或丢失。 3、影响继代培养的其他因素 1）、植物材料的影响 不同种类植物，同种植物不同品种，同一植物不同器官 11 或不同部位继代繁殖能力也不相同。一般是草本木本；被子植物裸子植物；年幼植物老年植物；刚分离植物已继代植物；胚营养体植物；芽胚状体愈伤组织。 2）、培养基及培养条件 培养基及培养条件适当与否对能否继代培养影响颇大，故常改变培养基和培养条件来保持继代培养

21、。 3）、继代培养时间长短 关于继代培养次数对繁殖率的影响的报道不一。有的材料长期继代可保持原来的再生能力；有的经过一定时间继代后才有分化再生能力；而有的随继代时间加长而分化再生能力降低。 4）、季节的影响 植物材料能否继代与季节有关。 一般能达到每月继代310倍，即可用于大量繁殖，盲目追求过高增殖倍数一是所产小苗小而弱，给生根、移栽带来很大困难，二是会引起遗传性不稳定，造成灾难性后果。 八、试管苗的生根与移栽 （一）试管苗的生根 1、试管内生根 1）、根发生过程 植物离体培养根的发生都来自不定根。根的形成从形成上可以分为两个阶段，即形成根源基和根源基的伸长及生长。前一阶段根源基的形成包括第一

22、次、第二次细胞横分裂和第三次细胞纵分裂，细胞横分裂能够被生长素促进。根源基的启动和形成约历时48h，后一阶段为细胞快速伸长阶段，大约需2448h。根源基的形成和生长素有关，根源基的伸长可以在没有外源生长素下实现。 2）、影响试管内生根的因素 12 （1）、植物材料 不同植物、不同基因型、同一植株不同部位和不同年龄对分化根都有决定性因素。若试管里不生根不要完全从培养中去找原因，也应在取材时考虑。不同植物的一般生根规律是：木本比草本难，成年树比幼年树难，乔木比灌木难。 （2）、基本培养基 大多数使用低浓度的MS培养基，其中不少使用1/2MS或1/3MS培养基。大量元素中有人认为NH4+多可能不利于

23、发根，生根需要P和K元素，但不宜太多；而Ca2+多数报道有利于根的形成于生长。微量元素对生根有利的是B和Fe。生根通常用1%3%的蔗糖。 （3）植物生长调节剂 据报道单用一种生长素的占51.5%，生长素加激动素占20.1%。a、愈伤组织分化根时使用NAA最多，浓度以1.02.0为多。使用IAA+激动素浓度范围以1.04.0和0.010.02居多。b、而胚轴、茎段、插枝、花梗等分化根时，使用IBA居首位，浓度以1.01为多。可见生根培养多数使用生长素，大多以IAA、IBA、NAA单独用或配合使用，或与低浓度激动素配合使用。NAA与细胞分裂素配合时摩尔比在（2030）：1为好。一般赤霉素、细胞分裂

24、素、乙烯通常不利于发根，如与生长素配合，一般浓度宜低于生长素，ABA可能有助于发根，植物生长延缓剂多效唑（MET）对不定根的形成也有良好作用，使用浓度0.14.0。 （4）、使用方法 将生根材料先在一定浓度植物生长调节剂中浸泡或培养一段时间，然后转入无植物生长调节剂培养基中培养，能显著提高生根率。 （5）、其他物质 间苯三酚、脯氨酸、核黄素、活性炭等等。 （6）、继代培养 新梢生根能力随继代时间增长而能力增加，植物在培养初期不易生根。从试管苗长成的植株上去枝条比在一般植株上取的更易生根。 13 （7）、光照强度和光照时间对生根的影响十分复杂，结果不一。 （8）、pH值 一般在5.06.0。 （

25、9）、温度 16oC 25oC。 2、试管外生根 有些植物种类在试管内难以生根，或有根但与茎维管束不相通，或根与茎联系差，或有根无根毛，或吸收功能极弱不易成活，此时可采用试管外生根的方法，把生根和驯化过程联系起来，即可大幅度降低成本，又可提高移栽成活率。试管外生根有三种方法： （1）、在试管内诱导根源基再移栽 （2）、在生根小室进行生根和炼苗 做一个生根小室，不用琼脂和蔗糖，而用透气又保湿的基质如泥炭、蛭石、珍珠岩、苔藓等，并要控制温度、光照、采用人工喷雾，雾滴要细。 （3）、盆插和瓶插生根法 用罐头瓶或盆内装有泥炭或腐殖土与细沙，每瓶插入20株或30株无根苗，插入深度为0.31.2cm,加入

26、1/2MS+1.05.0IBA或IAA生根液,，在一定温度、光照及湿度下培养，容易生根且成活率高而稳定。 有些植物可以把试管繁殖的嫩枝当做微型插条，直接入土生根，也能成活。 （二）、试管苗的移栽 A、试管苗移栽后易于死亡的原因 试管苗一般在高湿、弱光、恒温下异氧条件下培养，出瓶后若不保湿极易失水而萎蔫死亡。从形态解剖和生理功能两方面分析其原因如下： 1、形态解剖方面： （1）、根 无根、根与输导系统不想一通、根无根毛或毛少。 14 （2）、叶 在高湿、弱光和异氧条件下，叶表保护组织不发达，易于失水萎蔫。这是因为：叶表角质层、蜡质不发达或无、叶无表皮毛或无、叶解剖结构稀疏易失水、叶片存在排水孔。

27、 2、生理功能方面 (1)、根无吸收功能或极低：试管苗根系吸收功能极低，仅为沙培苗的1/18，温室苗的1/39，低湿度下叶片大量失水，而根系又不能有效地吸收补充，故极易萎蔫、干枯。 (2)、叶片极易散失水分：试管苗叶片无保护组织，加之细胞间隙大，气孔开张大，移入低湿环境中失水极快。 (3)、试管苗气孔不能关闭，开口过大，与温室和大田生长的小植株气孔结构明显不同，这是主要原因。另外试管苗叶片缺乏角质和蜡质，叶片蒸腾较大。 (4)、试管苗叶光合作用能力极低：试管苗生活在含糖培养基中，光和气体交换受阻，因此光合作用能力弱。 B、提高试管苗移栽成活率的技术和措施 1、培育瓶生壮苗 凡生活能力强、小苗健

28、壮有较发达根系的试管苗易于移栽和成活，倍性混乱和单倍体小苗、生长不良小苗、弱苗、老化苗、发黄苗及玻璃化苗则移栽成活率低或不易移栽成活。因此，培育壮苗是移栽能否成活的首要基础。在培养基中加入多效唑（MET）、B9、CCC等植物延缓剂是培育壮苗的一种有效途径。多效唑处理后的小苗?高度降低，从而使其矮壮?发根快，根数多，从而大大增加了根系吸收养料的能力?叶色浓绿，叶绿素含量增加，从而加强了其移栽后的自养能力。 2、促进试管苗根系发展及功能的恢复（见前） 15 3、促进茎叶保护组织的发生和气孔功能的恢复 一般移栽试管苗时，开始时打开瓶口，逐渐降低湿度，并逐渐增加光照，进行驯化，是新叶逐渐形成蜡质，产生

29、表皮毛，降低气孔口开度，逐渐恢复气孔功能，减少水分散失，促进新根发生，以适应环境。一般情况下初始光照应为日光的1/10，其后每3天增加10%，经过10-30d炼苗即可栽入大田，但一定要避免中午的强光。湿度按开始3d饱和湿度，其后每2-3d降低5%-8%，直到与大气相同。 4、嫁接 有些试管苗试管内难生根或生根苗不能在生产上应用，必须进行嫁接，以解决生根和异砧结合问题。 （1）、试管内嫁接：难度较大，技术要求高，成活率低。 （2）、试管外嫁接： 九、植物组织培养商业性生产因注意的问题 （一）、遗传稳定性问题 （二）、玻璃化问题 （三）、污染问题 （四）、市场和经营问题 16 3、促进茎叶保护组织

30、的发生和气孔功能的恢复 一般移栽试管苗时，开始时打开瓶口，逐渐降低湿度，并逐渐增加光照，进行驯化，是新叶逐渐形成蜡质，产生表皮毛，降低气孔口开度，逐渐恢复气孔功能，减少水分散失，促进新根发生，以适应环境。一般情况下初始光照应为日光的1/10，其后每3天增加10%，经过10-30d炼苗即可栽入大田，但一定要避免中午的强光。湿度按开始3d饱和湿度，其后每2-3d降低5%-8%，直到与大气相同。 4、嫁接 有些试管苗试管内难生根或生根苗不能在生产上应用，必须进行嫁接，以解决生根和异砧结合问题。 （1）、试管内嫁接：难度较大，技术要求高，成活率低。 （2）、试管外嫁接： 九、植物组织培养商业性生产因注意的问题 （一）、遗传稳定性问题 （二）、玻璃化问题 （三）、污染问题 （四）、市场和经营问题 16