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1、分子生物学论文doc版分子生物学论文doc版 分子生物学论文doc版 分子生物学论文 基因治疗与基因诊断的研究与发展 摘要：基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。 所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。 因此在20世纪70年代末诞生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy)的临床试验方案。 可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。 关键

2、词：基因治疗 基因诊断 重组DNA 1引言 20世纪后半叶以来，由于分子生物学的崛起，人们进入了合成代谢与代谢调节的研究。 这一阶段，细胞内两类重要的生物大分子-蛋白质与核酸，成为研究焦点。 20世纪50年代初期发现了蛋白质的螺旋的二级结构形式；更具里程碑意义的是1953年提出的DNA双螺旋结构模型，为揭示遗传信息传递规律奠定了基础，是生物化学发展进入分子生物学时期的重要标志。 20世纪70年代，重组DNA技术的建立不仅促进了对基因表达调控机制的研究，使基因操作无所不能，而且使人们主动改造生物体成为可能。 基因诊断和基因治疗也是重组DNA技术在医学领域应用的重要方面。 随着对各种疑难疾病的深入

3、研究，和分子生物学日新月异的发展，传统的诊断治疗手段无法解决的一些重要问题。 通过对生物体在分子水平上的研究，基因诊断与治疗的作用逐渐显露出来，尤其是许多遗传疾病。 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。 现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。 基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。 基因

4、诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNA diagnosis)。 基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。 2基因诊断的原理与方法 2.1 基因诊断的原理 疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。 基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。 由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变化或利用连锁方法进行

5、分析，这就是DNA诊断。 对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNA diagnosis)。 2.2 基因诊断的方法 基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应（PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。 DNA诊断 常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。 斑点杂交：根据待测DNA 样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。 等位基因特异的寡核苷酸探针（all

6、ele-specific oligonucleotide probe, ASO probe）杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。 一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。 如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一条

7、染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；如果只能与正常ASO探针杂交，不能与突变ASO杂交，说明受检者不存在该种突变基因，如图21-1所示。 若与PCR方法联合应用，即PCR/ASO探针杂交法(PCR/ASO probe hybridization)，是一种检测基因点突变的简便方法，先用PCR方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。 此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。 也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53的点突变。 单链构象多态性（single stra

8、nd conformation polymorphism, SSCP）分析相同长度的单链DNA因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时速度就不同，若单链DNA用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。 一般先设计引物对突变点所在外显子进行扩增，PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。 PCR/SSCP方法，能快速、灵敏、有效地检测DNA突变点，如图21-2，此法可用检测点突变的遗传疾病，如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。 限制性内切酶图谱（restriction map）分析，如果DNA突变后改变了某一核酸限制性内切酶的识别位点，使原

9、来某一识别位点消失，或形成了新的识别位点，那么相应限制性内切酶片段的长度和数目会发生改变。 一般基因组DNA经该种限制性内切酶水解，再做Southern印迹，根据杂交片段的图谱，可诊断该点突变，如图21-3所示。 如果用PCR扩增该突变点的外显子，PCR产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳，溴乙锭染色后可直接观察片段的大小及数目。 此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾病，如镰状细胞贫血。 或基因缺失的疾病如地中海贫血症，单纯性生长激素缺乏症等。 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP）遗传连锁分析人群中个体

10、间DNA的序列存在差异，据估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变，这种现象称为DNA多态性。 有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生了DNA限制性片段长度多态性。 RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片段可作为遗传标记，来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因，见图21-4，此法可用于诊断甲型血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等。 DNA序列分析对致病有关的DNA片段进行序列测定，是诊断基因异常（已知和未知）最直接和准确的方法。 RNA诊断 RNA诊断主要是分析基因的表达功能，检

11、测转录物的质和量，以判断基因转录效率的高低，以及转录物的大小。 RNA印迹（Northern blot）RNA印迹是检测基因是否表达，表达产物mRNA的大小的可靠方法，根据杂交条带的强度，可以判断基因表达的效率。 RT-PCR是一种检测基因表达产物mRNA灵敏的方法，若与荧光定量PCR结合可对RT-PCR产物量进行准确测定。 3基因诊断的应用 3.1 遗传病的预防 产前诊断 产前诊断可以通过胎儿组织活检、羊膜腔穿刺、羊膜绒毛样品及母体血液循环中的胎儿细胞进行。 可以进行染色体组型分析，发现染色体异常，但利用PCR技术结合DNA诊断学方法分析特异基因缺陷更宜推广。 携带者测试基因 测试常用于检出

12、隐性遗传病携带者，包括遗传病受累个体家庭的其他成员和有特殊遗传病死亡家庭中的危险人群。 例如对个缺失型和个非缺失型假肥大肌营养不良家系缺失片段定量分析和连锁分析，对个家系名成员（患儿名、女性亲属名、男性亲属名）进行了基因检测。 检测结果发现了名女性为致病基因携带者，肯定了名女性为非携带者，为这些家系提供了可靠的遗传信息。 以上检测方法简便易行，利于在临床实验室中开展。 症状前诊断 对于某些单基因紊乱所引起的综合征，仅至晚年才会有明显表现，例如肝豆状核变性的症状前诊断及干预治疗，应用短串联重复序列标记对个肝豆状核变性家系进行单体型连锁分析，在先证者的例无症状同胞中，检出例症状前患者。 对其中例投

13、用硫酸锌治疗，效果良好，在预防症状出现的同时，提高了血清铜蓝蛋白水平。 强调症状前诊断及干预治疗的重要性。 遗传病易感性 多基因遗传病是由多个易感性基因累加效应引起的遗传性状，是由多个易感性基因累加效应引起的遗传性状，是多个才会有发病的机会。 比如，有LDL受体基因缺陷的个体同时有高胆固醇血症，其冠状动脉患病率要比单纯高胆固醇血症者高。 因此，根据DNA诊断，做好疾病的早期预防并注意环境卫生和个人生活方式，可以达到预防的目的。 3.2 感染性疾病 过去对感染性疾病(infectious diseases)的诊断，一是直接分离检查病原体，或者对患者血清学或生物化学的分析。 有些病原体不容易分离，

14、有些需经过长期培养才能获得。 血清学对病原体抗体的检测虽然很方便，但是病原体感染人体后需要间隔一段时间后才出现抗体，并且血清学检查只能确定是否接触过该种病原体，但不能确定是否有现行感染，对潜伏病原体的检查有困难。 对感染性疾病的基因诊断具有快速、灵敏、特异等优点。 80年代建立的PCR技术已广泛应用于对病原体的检测。 一般根据各病原体特异和保守的序列设计引物，有的还合成ASO探针，对病原体的DNA可用PCR技术直接检查，而对RNA病毒，则采用RT-PCR。 现在市场已经有许多种病原体的测定药盒供应，每一盒包含扩增某种病原体的特异引物，所需的酶以及配妥的各种反应试剂，并附有可行的操作方法步骤。

15、病毒性感染： 多种病毒性感染都可采用基因诊断检测相应的病原体，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病毒、腺病毒、EB病毒、疱疹病毒、人巨细胞病毒、乳头状病毒等。 最近新发现的SARS冠状病毒，在基因组（RNA）序列确定后，便很快建立了RT-PCR的基因诊断法。 细菌性感染： 可应用基因诊断检测多种致病性的细菌，如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、绿脓杆菌等。 寄生虫： 恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、血吸虫、弓形虫等都有基因诊断的方法 其它:如衣原体、支原体、真菌性感染也均用基因诊断。 3.3 恶性肿瘤 分析一些原癌基因的点突变、插入突变、

16、基因扩增、染色体易位和抑癌基因的丢失或突变，可以了解恶性肿瘤的分子机制，有助于对恶性肿瘤的诊断，对肿瘤治疗及预后有指导意义。 4. 基因治疗 4.1 基因治疗的定义 从基因角度可以理解为对缺陷的基因进行修复或将正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法。 若从治疗角度可以广义地说是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。 导入的基因可以是与缺陷基因相对应的有功能的同源基因或与缺陷基因无关的治疗基因。 基因治疗有两种形式，一种是改变体细胞的基因表达，即体细胞基因治疗（somatic gene therapy），另一种是改变生殖细胞的基因表达，即种系基因治疗

17、（germline gene therapy），从理论上讲，若对缺陷的生殖细胞进行矫正，不但当代可以得到根治，而且可以将正常的基因传给子代。 但生殖的生物学极其复杂，且尚未清楚，一旦发生差错将给人类带来不可想象的后果，涉及一系列伦理学的问题，目前还不能用于人类。 在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。 4.2 基因治疗的方式 基因治疗的方式（type of gene therapy）主要有3类，一类为基因矫正或置换，即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变，目前尚

18、无体内成功的报道。 另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。 再有一类为基因封闭，有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵（decoy）转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达。 除上述3大类外，近日发展其它多种形式，如导入病毒或细菌来源的所谓“自杀基因”或经过改造的条件性复制病毒，只能在p53缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。 4.3 导入的方式 导入基因有两种方式，一种是体外导入（ex vivo）,即在体外将基因导入细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使这种带有外源基因的细胞在体

19、内表达，从而达到治疗或预防的目的。 被用于修饰的细胞可以是自体，同种异体或异种的体细胞。 合适的细胞应易于从体内取出和回输，能在体外增殖，经得起体外实验操作，能够高效表达外源基因，且能在体内长期存活。 目前常用的细胞有淋巴细胞、骨髓干细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、肌细胞、角朊细胞（keratinocyte）、多种肿瘤细胞等。 另一种是体内导入（in vivo），即将外源基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。 4.4基因治疗的临床试验 目前临床基因治疗试验的方案已达9百多个，受治疗的患者已有数千例 表21-3可见当前临床基因治疗（gene therapy）或广义

20、地称基因转移（gene transfer）试验，有三种类型，即治疗性、基因标记及非治疗性试验。 后者将腺病毒载体注射于健康自愿者的体内，观察机体对腺病毒载体的反应。 这些方案的临床试验期（trial phases）极大多数为期临床试验，期者仅仅个方案。 说明基因治疗临床试验尚处于未成熟阶段。 基因标记 目前常用的基因标记方法是将含neoR基因的重组逆转录病毒载体在体外转导细胞，然后回输至病人体内，可以很方便地跟踪这种标记细胞的命运，用来研究许多其他方法不能回答的体细胞移植的生物学问题。 美国第一个被批准基因标记的临床研究计划是NIH的Rosenberg等的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infi

21、ltrating lymphocytes, TIL）基因标记实验。 他将恶性黑色素瘤组织或转移的淋巴结制成单细胞悬液，在IL-2的作用下淋巴细胞可成倍增殖而肿瘤细胞及其他类型细胞则死亡。 这种TIL能特异杀伤肿瘤细胞。 先在体外将含有neoR基因的逆转录病毒载体转导TIL，该载体能整合至TIL的基因组，故子代的TIL也含有neoR基因，能在含抗生素G418的培养液中生长，便于筛选；也可用PCR检测neoR基因是否存在，以跟踪回输体内的TIL的去处。 将这种基因修饰过的TIL注射于黑色素瘤患者，可以研究TIL在体内各组织器官、血循环细胞、淋巴结、肿瘤组织的分布情况；特别感兴趣的是观察TIL是否能

22、靶向肿瘤组织；同时也可以研究TIL在体内存活期的长短；以及了解这种体外基因修饰过的TIL是否会自主生长和恶变？注射后对人体是否有害？这些问题的阐明可为基因治疗打基础。 结果发现基因修饰过的TIL在体外不会自主增殖，说明没有恶变。 在注射后的头3周，用PCR可测出外周血存在着含有neoR基因的单核细胞，有的长至60d尚可测出。 在注射后3d活检的肿瘤组织也可测出有基因修饰过的TIL的存在。 有人对其他细胞如骨髓细胞、肝细胞和细胞毒淋巴细胞等进行标记研究。 单基因疾病 遗传性单基因疾病（monogenic diseases）是基因治疗的理想侯选对象，设计治疗方案时应考虑下列几点因素：对造成该疾病有

23、关的基因应有较详细的了解，并能在实验室克隆适合真核细胞表达的有关基因的cDNA序列，供转导用。 经有功能基因转导的体细胞，只要产生较少量原来缺少的基因产物就能矫正疾病。 例如腺苷脱氨酶（ADA）缺乏的严重联合免疫缺陷（SCID），由于淋巴细胞缺乏ADA酶，造成腺苷及dATP的堆积，可破坏免疫功能，患儿很少活至成年。 若淋巴细胞ADA恢复至正常水平的5%10%即能维持免疫系统的功能，对病人症状就有改善，这是第一个基因临床治疗的方案。 血友病B，是由于凝血因子缺乏所致。 现知只要因子水平达到正常的10% 20%就能缓解严重的血友病。 对血友病A而言，只要因子达正常水平的5%就能缓解症状，血友病已开

24、始基因治疗临床试验。 即使导入基因过度表达，对机体应无不良作用。 有些遗传疾病是某些特殊细胞基因缺损造成的，但那有关的细胞不易取出供体外基因工程操作用。 例如Parkinson症是脑黑质细胞（substantia nigra）的酪氨酸羟化酶缺乏，不能产生多巴胺（dopamine），给病人注射多巴胺可减轻症状。 动物模型试验表明，将酪胺酸羟化酶基因转导成纤维细胞，再移植至脑内，可以减轻动物模型的异常行为。 现在采用的以正常有功能的同源基因来增补体内的缺乏基因，因此要求增补的基因在病人寿命期间能稳定表达，或重复治疗，所以应考虑构建能长期持续稳定表达外源基因的载体，并考虑将外源基因转导干细胞，如造血

25、干细胞以望回输体内后其子代细胞也含有外源基因。 目前应用基因治疗的单基因疾病已有二十多种。 恶性肿瘤 恶性肿瘤属复杂基因疾病(complex genetic diseases)，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多步骤的，至今虽有不少有关的基因被鉴定，但肿瘤发病的分子机制尚未清楚，因此治疗时应选择何种靶基因不明确，多数是根据不同的环节，设计不同的治疗策略，目前临床恶性肿瘤的基因治疗策略有十余种之多。 见表21-4。 免疫基因治疗(immunogene theray) 分体外转导和体内转导二种。 体外转导将一些能刺激免疫反应的细胞因子基因，如 IL-2、IL-12、IFN-等转导肿瘤细胞作为基因

26、工程“瘤苗”，给肿瘤患者注射，宗旨为提高肿瘤细胞的免疫原性，有利于被机体免疫系统识别及排斥；由于转导细胞因子基因的肿瘤细胞在体内能持续不断分泌细胞因子，能增强抗肿瘤的特异免疫和非特异免疫反应，在肿瘤局部形成一种较强的抗肿瘤免疫反应微环境，并能通过局部免疫反应，引发全身的抗肿瘤免疫机能，此策略已应用于多种恶性肿瘤的临床试验。 本实验室研究了IL-2基因转导的人肝癌和胃癌细胞“瘤苗”，后者已被中国药物管理局批准用于临床研究。 另一种策略是将细胞因子基因或MHC I类基因直接体内注射于肿瘤局部，以促发抗肿瘤免疫反应。 自杀基因系统 自杀基因（suicide gene）来源于病毒、细菌或真菌，例如单纯

27、性疱疹病毒的胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因，能将一种对哺乳动物无毒害的嘌呤核苷的类似物甘苷洛韦（gancilovir, GCV）转变成三磷酸形式，后者可掺入新合成的DNA链，造成DNA链的断裂和抑制DNA聚合酶的活性，从而造成细胞死亡。 所以将HSV-tk基因体内转导肿瘤细胞，然后再给患者服用GCV药物，肿瘤细胞表达TK基因能使无毒的GCV转变成有毒的三磷酸GCV，达到杀伤肿瘤细胞的目的。 抑癌基因 (tumor suppressive gene) 抑癌基因p53的突变与多种肿瘤的发生有密切的关系。 将野生型(正常)的p53转导 p53缺陷的恶性肿瘤，使其能表达正常的p

28、53产物，后者具有强大的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而达到抗肿瘤效果。 裂解肿瘤病毒（oncolytic virus） 利用基因工程改造过的腺病毒突变体，如EIB基因缺失的腺病毒能选择性在p53缺 陷的恶性肿瘤细胞中进行复制、繁殖，并最终杀伤肿瘤细胞。 而正常细胞能表达p53，使这种病毒不能复制和繁殖。 病毒性感染 目前病毒性感染主要治疗对象为人免疫缺陷病毒（HIV）感染的艾滋病，接受基因治疗的患者约4百余例。 主要有二种治疗策略。 增强机体的抗HIV免疫反应 抑制HIV的复制 有人研究利用反义核酸来封闭HIV的基因，使mRNA不能翻译蛋白质，并发生降 解，或制备有关的核酶来破

29、坏HIV的mRNA，使HIV不能复制繁殖，确切的疗效尚不能肯定，许多科学家尚在研究其他更有效的抑制HIV复制的方法。 心血管疾病 目前心血管疾病中基因治疗最多的临床方案为外周血管疾病造成的下肢缺血，及心脏冠状动脉阻塞造成的心肌缺血。 通过转移血管内皮细胞生长因子（VEGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）或血小板衍生生长因子（PDGF）等基因于血管病疫部位，通过这些因子的表达，以促进新生血管的生成，从而建立侧肢循环，改善血供。 5. 问题及展望 基因治疗无疑是近30年来生命科学发展的一种结果。 从理论上讲，若能将与疾病 发生有关的基因进行矫正或修复，应是一种有效的根治方法，可惜目前还不能达到此目

30、的，这应是今后研究的一个重要方向。 在这当中，其中最具有挑战性的问题是运送治疗基因的载体系统，理想载体应具备下列条件：安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因；持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用，可惜目前所应用的载体尚没有一个能符合上述全部的条件。 这是今后努力研究的方向。 6结论 随着“人类基因组计划”的完成（即在阐明人类基因组DNA3*109核苷酸的序列，阐明所有人类基因并确定其在染色体的位置）和“后基因计划”的实施（即是对基因功能的研究和基因与人体疾病的研究），分子生物学

31、技术将会越来越普及，方便地运用到基因诊断领域。 虽然目前对DNA芯片的应用仍大多停留在实验室研究阶段，由于技术复杂、成本高、离临床检验及疾病诊断的普及性应用还有一段距离。 但是可以预见，随着现代生物科学和其他学科技术的不断发展和完善，在不久的将来，即可把所有的基因都固定于1块芯片上时，就成了一块多基因疾病检测得万能芯片，它可适用于任何多基因疾病的检测，为临床检测工作带来极大的便利。 总之，分子生物学和分子遗传学的飞速发展必将极大地促进基因诊断技术的进步，有理由相信，以基因诊断为基础的基因治疗必将成为人类治疗自身疾病的主流技术，并极大地促进人类卫生事业的进步。 参考文献： 【1】李景泰，林万明，王佩卿，临床医学分子生物学现状和未来【M】；北京中国科学技术出版社，1993:24-27 【2】夏家辉，医学遗传学讲座【M】；湖南科学技术出版社，1998:6； 【3】杜传书，医学遗传学基础【M】，北京人民卫生出版社，1995:163； 【5】马为民，陶其敏，RNA基因诊断技术的研究进展【J】，临床内科杂志,1993.10(4):4-6 【6】郭文潮,赵文清,余小平等,遗传病的基因诊断和产前基因诊断J,中国优生与遗传杂志,2006.14(12);33-34 9